Este documento describe las propiedades del virus MVL3 que infecta a Acholeplasma laidlawii. Se determinó que MVL3: 1) Se adsorbe de manera específica a sus células huésped siguiendo una cinética de primer orden. 2) Tiene un periodo de latencia de 90 minutos antes de comenzar a liberar nuevas partículas virales. 3) Continúa liberando partículas virales de manera constante durante más de 5 horas. 4) Tiene un tamaño de estallido promedio de 120

1. Aislamiento de
Bacteriofagos de Fuentes
Naturales
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Químico Bacteriólogo Parasitólogo

2. DESCUBRIMIENTO
Twort, inoculó
muestras de vacuna
de la viruela en
agar nutritivo, y
observó placas de
aspecto vidriosa
(enfermedad
bacteriana).
1915 D’Herelle propuso
que se podían usar
para el control
biológico de
enfermedades.
Tuvieron gran
impacto
antecedido de los
antibióticos.
1917

3. DEFINICIÓN:
BACTERIOFAGO:
Son agentes infecciosos (virus)
que se replican
intracelularmente de manera
obligada en bacterias.
Fig. 1. Imágenes de bacteriófagos. A. Fagos filamentosos
(Inoviridae); B. Sulfolobus neozealandicus infectada por Guttaviridae
(en forma de gotitas); C. Acidianus filamentous (Lipothrixviridae) con
estructuras de cola; D. Bacteriófago T4 (Myoviridae); E. Bacteriófago
SPP1 (Siphoviridae); F. Bacteriófago P22 (Podoviridae). Las barras
son 50 nm.

4. COMPOSICIÓN ESTRUCTURA
Ácidos
nucleicos
Cápside (capa
protectora de
proteína)

5. Bacteriófagos
Material
genético
Estructura
Ciclo de
multiplicación

6. Composición
Material genético Cadena Ejemplo
RNA Sencilla
Doble
MS2
QB
DNA Sencilla M13
Doble Lambda

7. Fagos Filamentosos
Tienen la forma de una barra filamentosa. Los fagos filamentosos por
lo general contienen un genoma de una sola hebra de ADN y son
capaces de infectar a las bacterias gram-negativas.
Ejemplos:
• M13
• F1
• Fd
• lke
• N1
Fig. 2 Bacteriófago M13.

8. Fagos Icosaédricos
LambdaT4
Ejemplos:
• T4
• T7
• Lambda
Fig. 4 Bacteriófago Lambda.Fig. 3 Bacteriófago T4.

9. Fagos Esféricos
Fig. 5 Bacteriófago Phi 6.

10. CICLO LÍTICO

11. CICLO LISOGÉNICO

12. Ciclo no lítico

13. Multiplicidad de Infección (MOI)
Se define como el número de fagos adicionados por
células en un determinado volumen de la mezcla de
infección.

14. Definiciones
Amplitud del
huespéd.
Tipos diferentes
de bacterias que
pueden ser
infectadas por
un mismo fago.
Tamaño del
estallido
Número de
fagos que se
libera por cada
célula
monoinfectada.
Propagación
fágica
Amplificación o
multiplicación
del número de
bacteriófagos
presentes en la
muestra.
Lisado fágico
La suspensión de
la progenie
fágica liberada
después de un
proceso de
propagación.

15. Curva de crecimiento en un solo paso y lisis artificial.

16. Bacteriófagos
T4
Bacteriófago
icosaédrico
con cola.
Receptor es
la proteína
OmpC de
membrana
Fago
(virulento)
Ciclo lítico
DNA lineal y
bicatenario
(165000 pb)
Fig. 6 Bacteriófago T4.

17. Bacteriófagos
λ
Bacteriófago
icosaédrico
con cola.
Receptor de
maltosa
LamB en
membrana.
Fago
temperado
DNA lineal y
bicatenario
(48502 pb) Fig. 7 Bacteriófago Lambda..

18. M13
Bacteriófago filamentoso
Receptor: es la proteína to1A
del pili bacteriano
Virulento no citocida, sigue el
ciclo no lítico.
DNA monocatenario, circular (
6407 NT)
Bacteriófagos
Fig. 8 Bacteriófago
M13.

19. Placas líticas
Placas claras (T4) Placas turbias (M13)
Turbias homogéneas
Placas turbias (λ)
Turbias no homogéneas

20. Propiedades estructurales y
biológicas de Mycoplasmavirus
MVL3: Una inusual interacción
virus-procariote.
Klaus Haberer, Gunther Klotz, Jack Maniloff. Journal of Virology,
Otubre 1979, pp.268-275
Demostrar el tipo y cinética de
infeccion que MVL3 presenta
sobre Acholeplasma laidlawii
1305.K2 como célula hospedera.
Objetivo

21. oGrupo 1:
Virones desnudos en forma de bala
Tipo: MVL51
Molécula de DNA circular de una cadena sencilla (1.5X106
Da.)
oGrupo 2:
Virones envueltos en partículas esféricas
Tipo: MVL 2
Contiene una doble cadena de DNA en superenrollado
circular covalentemente cerrado (7.8X106 Da.)
oGrupo 3:
Partícula poliédrica desnuda con una cola corta
Tipo: MVL3
Contiene una doble cadena de DNA
Citocida pero no
provoca lisis
celular
Virus no
citocidas

22. Materiales
y métodos
• Caldo triptosa (cultivar célula huesped K 2).
• Agar triptosa (cultivar célula huesped K2).
• Buffer Tris-EDTA-NaCl (TES) usado para la
lavado celular.
Cepa y virus empleados
• Acholeplasma laidlawii 1305.K2 célula
hospedera. (K2)
• Mycoplasmavirus MVL3

23. Células y virus
200 mL K2 +
800 mL
caldo
triptosa
2 hrs 37 °C
MVL3
MOI
a 1
24 hrs a 37 °C
Pp
polietilenglicol
1 noche a 3-5°C a 5 °C 15000 x
g por 30’
Resuspendido
en 10% del
volumen
original de TES
Solubilizado
con Triton x-
100
2 hrs a 37 °C
Dializado toda
la noche con
2 L- TES
δ 1.48 g/cm3
con CsCl
a 40000 rpm
Virus en banda
en la mitad del
gradiente
Remover parte
superior
Virus a 4 °C
sin con CsCl
es estable
por un año
Rendimiento en el rango de
1013 a 5 x 1014 unidades
infecciosas/L de cultivo.
Objetivo: Reproducir MVL3.

24. Determinación del título de células y título viral.
Cultivo celular
Evitar errores,
suspensión de
células puestas en
un baño ultrasónico
Seguido por
microscopia de
contraste de
fase
Colonias visibles 4
días a 37 °C agar
triptosa
Tinción de Dienes
Conteo de UFC.
0.1 mL de muestra
viral + 0.1 mL cultivo
celular + 1 mL de
caldo triptosa
brevemente a 45 °C
1 ml al 0.7% de agar
con TES a 45 °C
Placa de agar
triptosa
Placas contadas
después de 24 hrs a
37 °C Conteo de UFP.

25. MVL3 agregado a
MOI a 1
Cultivo celular
(K2) Dilución (1:5)
Se toman
muestras cada 5
minutos.
Filtrado en filtro de
0.2 μm
Obtención de UFP
Adsorción del virus
Objetivo: Cuantificar la tasa de adsorción de MVL3 y
comparar con el numero de colisiones virus-célula

26. Discusión y Conclusiones
Adsorción de MVL3 sigue una
cinética de primer orden, el
numero de UFP no adsorbidas
durante el proceso de
adsorción disminuye
exponencialmente (datos no
mostrados). La velocidad de
adsorción es de 3 X 10 -10
cm3/min
Discusión
Tasa de adsorción experimental fue
de 3x10-10 mientras que la teórica es
de 2x10-9.
La adsorción requiere un alto grado
de especificidad en la interacción
virus-célula.

27. Cultivo celular
(K2) Dilución
(1:5)
MVL3 agregado
a MOI a 0.1
30 min a 37 °C
Cultivo infectado
se diluye 106 en
caldo triptosa
Se toman
muestras a
diferentes
tiempos durante
5 horas
Calcular UFP
para cada
muestra
Crecimiento en un solo paso
Objetivo: Determinar las diferentes fases de
crecimiento del virus MLV3.

28. Resultados y conclusiones
Figura 10. Crecimiento en un paso del
MVL3. MOI de alrededor de 0.1. La
gráfica semilogarítmica claramente
muestra el comienzo de la liberación
del virus después de un periodo latente
de 90 minutos.
Conclusiones
Periodo de latencia de MVL3 de
90 minutos.
La liberación del virus continúa
por más de 5 horas.

29. Cultivo celular
(K2) Dilución
(1:5)
MVL3 agregado
a MOI a 10
Se toma una
muestra cada 30
min. durante las
primeras 4 horas,
posteriormente
cada 2 horas.
Esto durante 42
horas.
Calcular las UFP
para cada
muestra tomada
Nota: Un identico cultivo fue iniciado e
infectado 12 horas despues del primer cultivo
Crecimiento a tiempo largo del virus
Objetivo: Conocer como se lleva la producción del
virus MVL3 en tiempos largos.

30. Resultados y conclusiones
Figura 11. Crecimiento a largo
plazo del MVL3. MOI de 10,. El
título final del virus es
alrededor de 120 veces el
número de unidades
infecciosas medidas después
de 1 hora de infección.
Conclusiones
Estallido es de 120 unidades
infecciosas.
El virus es liberado de manera
constante después de 10-15
horas.

31. Cultivo celular
(K2) Dilución
(1:5)
MVL3 agregado
a MOI a 0.1
30 min a 37 °C
Se realiza una
dilución 1:100 en
caldo triptosa
Muestras
por
duplicado
Triton X-100
concentra
ción final
de 0.1%
Calcular
UFP
Calcular
UFP
Lisis Artificial
Objetivo: Determinar la posible existencia de partículas
infecciosas intracelulares del virus durante el periodo
latente.

32. Resultados y conclusiones
Figura 12. Lisis artificial del
MVL3. MOI de 0.1. Muestras por
duplicado en diferentes
tiempos. Una se sembró (O). La
otra se lisó por medio de la
adición de Tritón X-100 (•).
Conclusiones
Solo se encuentran partículas virales
maduras a los 70 minutos después de la
infección.

33. MOI=1
30 minutos
200 ml 10-
8
100 muestras
1 ml c/u
Analizadas para
UFP después de 8
horas de
infección.
Analizadas para
UFP después de
24 horas de
infección.
Experimento modificado de estallido simple.
Objetivo: Cuantificar el numero de fagos liberados
por célula

34. Resultados

35. Conclusiones
Conclusiones
El tamaño de estallido varia por cada
célula monoinfectada y es independiente
del tiempo.

36. Cinética de estallido simple.
Filtros de 0.2 μm,
inoculados con 0
ó una célula
infectada.
Jeringa con
caldo triptosa
Jeringa vacía
MOI=1
30
minutos 200 ml 10-
8
1 ml
Objetivo: Determinar el tamaño del estallido durante
un tiempo establecido

37. Se hace pasar 1
mL de caldo a
través del filtro a
las 3, 8 y 24 horas
después de la
infección
A las muestras
de 1 mL
obtenidas se
les determina
UFP
*Cada vez que
se obtiene una
muestra se
hacen pasar 5
mL de caldo
para eliminar
restos de virus
libres.

38. Resultados y conclusiones
Tabla 2.- Datos de la
cinética de estallido
simple (de 20 filtros, 7
fueron sin virus).
Conclusiones
Aparición y la tasa de liberación
del virus de células individuales
en función del tiempo de
infección son altamente variables

39. MVL3 purificado
Adsorbido en
rejilla
Teñido
negativamente
Acido
fosfotungstico
(pH 7)
Similares
micrografías
obtenidas con
acetato de uranilo
Fotografías
tomadas con
aumento de
50,000 x Microscopia
electrónica
Microscopia electrónica
Objetivo: Identificar a MVL3 a partir de características
estructurales (forma y tamaño del material genético)

40. Resultados y conclusiones
Figura 13 : Viriones MVL3
teñidos negativamente con
ácido Fosfotúngstico al 2%.
Cola Corta
Cabeza poliédrica
Fibras
Conclusiones
Partículas de virus poliédricas
cercanas a 60 nm de diámetro.
Tienen una pequeña cola cercana a
20 nm de longitud y 10 nm de
diámetro adjunto a un collar cercano
a 8 nm de grueso y 16 nm de
amplitud.

41. Medida del DNA
MVL3 purificado
contiene 1011 UFP/mL
Disociado SDS 1%
Agitado suave Dializado con
TES
Dilución
1:10
Acetato de amonio
0.5M + 0.1mg/ml
Citocromo c
50 μL
Acetato de amonio
0.25 M
Acetato de uranilo
5x10-4 M en Etanol
50%
Medición por
proyección de los
negativos con una
computadora
Wang 2200
Separacion de
fases

42. Resultados
Figura 14. Histograma de las
mediciones de DNA del MVL3.
Conclusiones
Peso molecular de las moléculas
de DNA es de (26+0.6) x 106 Da.
Moléculas de DNA de MVL3 son
lineales.

43. MOI=10
Células
no
infectad
as
Análisis
de
UFC.
37°
C
Análisis
de
UFC.
Viabilidad de las células
infectadas con MVL3
Objetivo: Determinar si después de la infección con el
fago la célula sigue teniendo viabilidad

44. Resultados y conclusión
Figura 15. Viabilidad de las células
infectadas con MVL3. Al tiempo cero
un cultivo se dividió. Una parte fue
desinfectada (o) y la otra se infectó a
una MOI=10(•).
Conclusiones
La célula infectada no puede
formar colonias.

45. • MVL3 se asemeja al grupo de bacteriófagos de cola corta, además éste es el
único virus de micoplasma que contiene DNA lineal.
• La constante tasa de adsorción encontrada experimentalmente fue de 3x10-10
cm3/min, mientras que la teorica fue de 2.9x10-9, que se trata de un orden de
magnitud mayor que los resultados experimentales.
Estructuralmente:
Ciclo de multiplicación:
• Las células infectadas con MVL3 aunque ya no son viables continúan
liberando progenie viral por varias horas.
• La tasa de liberación fluctuó durante el tiempo que la célula estuvo
produciendo el virus, por lo tanto la interacción virus-célula infectada de
MVL3 se asemeja a virus citocidas no líticos de animales.
Conclusiones generales

46. Objetivos
Conocer
algunos
aspectos de la
metodología
empleada en el
trabajo con
bacteriófagos.
Establecer
algunas de las
propiedades de
las partículas
fágicas que
permiten su
identificación.
Aislar
bacteriófagos a
partir de
muestras de
aguas negras.
Determinar el
título y ciclo de
multiplicación
de los fagos
presentes en la
muestra de
agua, con base
en su morfología
de placa.
PROTOCOLO

47. Materiales
Medio Composición
2YT Triptona (16g), Extracto
de levadura (10 g), NaCl
(10g)
Luria (L) Triptona (10 g), Extracto
de levadura (5g), NaCl
(10g)
Agar Lambda (λ) Triptona (10 g), NaCl (10
g) B1- 0.1%
Agar blando Agar (7g)
Agar lambda
blando
Triptona (10 g), NaCl(10
g)
Agar (7.5 g) B1- 0.1%

48. Cepa Genotipo y/o fenotipo
Escherichia coli W3110 F- λ-, rph-1, sup-
Escherichia coli B 837 Silvestre
Escherichia coli TG1 glnV44, thi-1, Δ(lac-proAB),
Δ(mcrB-hsdsSM)5,(rk
-mk
-
)/F,traD36, lac Iq,lacZΔM15,
proAB+
Bacillus subtilis SB19 Silvestre
Salmonella typhimuriumLT2 Silvestre
Staphylococcus aureus Silvestre
Klebsiella pneumoniae Silvestre

49. Bacteriófag
o
Hospedero Estructura Acido
nucleico
Tamaño del
genoma
(kb)
Receptor
T4 Escherichia
coli
Icosaédrica
con cola
DNA lineal
doble
cadena
172 Lipopolisaca
ridos
λ Escherichia
coli
Icosaédrica
con cola
DNA lineal
doble
cadena
49.5 LamB
M13 Escherichia
coli
Filamentoso DNA circular
de cadena
sencilla
6.4 Pilina
Características generales de Bacteriofagos.

50. A. Aislamiento de bacteriófagos a partir
de muestras de aguas negras
a) Preparación de las cepas indicadoras
Escherichia coli W3110,TG1, B837, Bacillus
subtilis SB19, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhimurium LT2,
Staphylococcus aureus
5 mL caldo L
Incubar
37°C,
durante 18 h,
sin agitación
1er día.

51. A. Aislamiento de bacteriófagos a partir
de muestras de aguas negras
b) Tratamiento de las muestras
Papel filtro y
gasas de filtrado
claro Volumen =
10 mL
Hasta obtener
filtrado claro
5 ml de filtrado
anterior
Esterilización por
filtración. *Poro 0.22 o
45 µm*
5 mL
Refrigerar hasta su uso
2do día

52. A. Aislamiento de bacteriófagos a partir de muestras de aguas negras
c)Prueba de gota del filtrado de aguas negras
0.1mL de
cada una
de las
cepas
indicadoras
3mL agar blando
fundido 45 °C
Agregar 3 gotas
del filtrado de la muestra
Incubar a 37° C
durante 18 h
3er día.
Registrar
resultados
2do día
Mezclar y vaciar el
contenido del tubo
En caja con agar L
Una caja para cada cepa

53. A. Aislamiento de bacteriófagos a partir de muestras de
aguas negras
d) Determinación de la concentración de bacteriófagos en las muestras de agua
Diluciones
de
filtrado
(+)
Sol. salina
estéril
Para
cada
tubo
0.1 mL
de la
dilución
3mL agar blando
fundido 45 °C
0.1 ml de la
cepa
indicadora
Mezclar y vaciar
Medio rico sólido
Incubar a 37° C
durante 18-24 h
3er día.

54. Describir
morfología
de placas
líticas
obtenidas
Contar el
numero de
placas líticas
obtenidas
Calcular el
titulo del fago
o fagos
presentes en
la muestra
4to día.

55. • B. Diferenciación de fagos temperados, virulentos líticos y
virulentos no citocidas por morfología de placa
1er día
Diluciones de lisado de
bacteriófago T4, M13 y
lambda
Bacteriófago Dilución
Cepa
indicador
a
Medio
Agar
blando
λ 10-4, 10-5 AB1157 o
W3110
Lambda
Agar
blando
Lambda
T4 10-4, 10-5 AB1157 o
W3110
Luria
Agar
blando
M13 10-4, 10-5 TG1 o
JC4046
2YT
Agar
blando
Incubar a
37° C
durante 18
h
1er día.
Ejemplo Bacteriófago λ
50 μL 50 μL 500 μL
100
10-2
10-4 10-5
0.1 mL bacteria
indicadora
+
0.1mL diluciones del
fago
Agar blando
fundido 45°C
Vaciar cajas medio
rico solido según se
indica

56. 2do día.
B. Diferenciación de fagos temperados, virulentos
líticos y virulentos no citocidas por morfología de
placa

57. • Determinación de la amplitud de huésped de los bacteriófagos T4, M13 y λ
• Seleccionar 3 placas
de cada fago con
misma morfología y
aisladas.
Con punta de
micropipeta
tomar las tres de
cada fago
Colocar por
separado en
tubos de
hemólisis
0.5 mL Caldo
rico
Macerar
Agar
blando
fundido
45°C
0.1 mL de cultivo
de 18 h de
incubación a
37°C de las
cepas.
Escherichia coli W3110, TG1,
B837, Bacillus subtilis SB19,
Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhimurium LT2,
Staphylococcus aureus
Agitar y
vaciar cada
tubo en cajas
con medio
rico
3er día.
Dejar solidificar
Gota del macerado y 0.5 ml de
caldo rico
Incubar 37°C por 18 y 24 hrs.

58. 4to día.

59. Referencias
 Klug, Cummings, Spencer, Palladino, “Conceptos de Genética”, Ed Pearson, 10° edición, 2013,
págs. 168-180
 Benito César, Espino Fco. Javier, “Génetica”, Ed. Médica Panamericana, 2013 págs. 109-112
 Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losick, “Biología Molecular del Gen”, Ed. Médica
Panamericana, 7ma edición, 2016, págs. 798-803
 Shors, “Virus, estudio molecular con orientación clínica”, Ed. Médica Panamericana, 2009, págs.
49-63
 Jauregui Rincón Juan, Chávez Vela Norma Ángela, “Glosario de Biotecnología”, 1ra edición,
2006, pág 33
 Neil A. Campbell, Jane B. Reece. “Biología”, 7° Edición. Ed. Médica panamericana, pág. 339
 Vidania M. R., “Estudio del rendimiento en fagos para los procesos de lisis bacteriana”, Junta de
energía nuclear, Madrid, España, 1979.
 Fernández Espinel, C., Flores Dominick, V., & Medina Morillo, M., “Aislamiento y caracterización
del bacteriófago Va1 específico a Vibrio alginolyticus.” Revista peruana de biología, 2017, 24(1),
93-100.