1. CONTROL DE LA FORMACION DE
BIOFILMS SOBRE BIOMATERRALES
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA,
INDUSTRIAL Y AMBIENTAL
DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES
9, 10 y 11 de octubre de 2012
Mónica Fernández Lorenzo
INIFTA. CONICET, UNLP
Facultad de Ingeniería, UNLP

2. INFECCIONES ASOCIADAS A LA FORMACIÓN DE
BIOFILMS
Catéter
intravascular
Implante de
mama Válvula
cardíaca
Marcapasos
Cable en
endocarditis
Stent en vena cava Stent urinario Prótesis de cadera Catéter Peritoneal Stent biliar
modified from Clinical Pharmacology & Therapeutics 82, 204-209,2007

3. LONGEVIDAD Y OBESIDAD INCREMENTO DE DEMANDA DE
PRÓTESIS ORTOPÉDICAS
 INCREMENTO DE INFECCIONES ASOCIADAS A BIOFILMS
•Reemplazo de articulaciones totales
Incremento de la demanda de prótesis de cadera 2030: 174%
Incremento de la demanda de prótesis de rodilla 2030: 673%
Biofilm de Staphylococcus sobre una
prótesis metálica

4. Biofilms mixtos y de una única especie
Biofilms mixtos: prótesis dental dental
Banda de ortodoncia
Biofilms de una especie única:
No-móviles: Móviles:
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa

5. Microorganismos que están asociados a la formación de
biofilms sobre prótesis
Prótesis de Elementos de fijación
cadera y rodilla externa
Datos de 242 pacientes

6. Interacciones del biofilm con biomateriales y
células durante el tratamiento antimicrobiano
Biomaterial Agente
Antimicrobial
antimicrobiano
Agent
Biofilm
Células

7. ¿Por qué es dificil controlar las infecciones
asociadas a la formación de biofilms?
La estructura tridimensional del biofilm juega un importante papel
resistivo en:
 Protección de las células internas del ambiente agresivo y de la defensa contra el
sistema inmune.
 Creación de barreras difusionales para macromoléculas y secuestro de sustancias
antibacterianas.
 Inducción de gradientes de oxígeno
dentro del biofilm
 Reducción del metabolismo en las
células internas.
 Generación de fenotipos heterogéneos
dentro de la estructura del biofilm

8. Etapas de formación de biofilms de bacterias no-móviles
Ej: Staphylococcus aureus
Dispersión de bacterias plactónicas
Colonización de la superficie
Acumulación en Desprendimient
Adhesión Adhesión irreversible colonias 3D con o de bacterias
reversible matriz polimérica
modified from

9. Formación de un biofilm de bacterias móviles
Dispersión
Maduración
Bacterias
planctónicas
dispersas Matriz
extracelular
Adhesión Adhesión irreversible y
reversible movimiento superficial.
Microcolonias 2D

10. ¿Cómo inhibir la formación de un biofilm?
Dispersión
Limitar los mecanismos Maduración
que conducen a la forma
sésil
Bacterias
planctónicas
dispersas Matriz
Limitar la adhesión
extracelular
e interacción
Limitar la movilidad superficial
Adhesión y el crecimiento 3D
reversible Adhesión irreversible y
movimiento superficial.
Microcolonias 2D

11. Las bacterias se unen entre ellas y al sustrato mediante el MPE
 Estrategia: limitar la agregación microbiana
Pseudomonas sp
Staphylococcus sp

12. Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
 Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
 Superficies con propiedades químicas
antiadherentes (AA)
 Superficies microestructuradas (MS)
 Estrategia combinada: AT + MS +

13. Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
 Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
 Superficies con propiedades físicoquímicas
antiadherentes (AA)
 Superficies microestructuradas (MS)
 Estrategia combinada: A + MS +

14. Efecto del tratamiento con antibióticos (AT) sobre bacterias
plactónicas y sobre el biofilm
Células planctónicas
Minimim Inhibitory concentration MIC=4mg/L
Minimum biocidal concentration MBC=8mg/L
Biofilms on NS
Streptomycin (ST)
105
Más de 104/cm2 bacteria
permanecen vivas con
CFU
4mg/L ST
101
0 1mg/L 2mg/L 4mg/L

15. Nanopartículas de ZnO como agentes antimicrobianos
en periimplantitis

16. Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bacteriostática
para distintas concentraciones de nanopartículas de
Ag, CuO, Cu2O, ZnO, WO3, TiO2, Ag+CuO, Ag+ZnO

17. Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
 Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
 Superficies con propiedades fisicoquímicas
antiadherentes (AA)
 Superficies microestructuradas (MS)
 Estrategia combinada: A + MS +

18. Efecto del ZnO agregado al PVC
(catéteres)

19. Formación de monocapas autoensambladas (películas de
moléculas ordenadas y ensambladas) derivatizadas con gramicidina

20. Adhesión de bacterias Gram positivas a superficies sin y con gramicidina
Listeria ivanovii
Sin
gramicidina
Bacterias vivas en verde
Bacterias muertas en rojo
Con
gramicidina

21. Reducción de las bacterias adheridas sobre
películas poliméricas con clorhexidina
PBA: Polybenzyl acrilato
Cortizo et al, J of Dentistry, 2012

22. Composición de las superficies
Uso de coberturas con heparina como anticoagulante
(en los catéteres). Aumento de adhesión bacteriana
Formación de biofilms se S. aureus sobre PVC con
y sin coberturas que contengan heparina
(1000U/mL)

23. Modificación de las superficies de los biomateriales: Superficies antiadherentes
con nanotubos con y sin monocapas de PTES.
Cambio de hidrofilicidad
NT
NT: film de nanotubos
NTS: con monocapa de 2H-perfluorooctyl
triethoxisilane (PTES) NTS TiS
TiS: Ti + PTES

24. Superficies con tratamientos de PTES con y sin nanotubos de TiO2
Sésiles Planctónicas
NT-2h NTS-2h 2h
4h
TiS-2h NT-4h
NTS- TiS-4h
4h
PTES=2H-perfluorooctyl triethoxisilane

25. Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
 Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
 Superficies con propiedades fisicoquímicas
antiadherentes (AA)
 Superficies microestructuradas (MS)
 Estrategia combinada: A + MS +

26. Variación de la adhesión de S. aureus con el tiempo
en sustratos lisos y rugosos
0 2 7 14 21 días

27. Retención de bacterias
aisladas
S. aureus
Liso
S. aureus
Fácil Posible interpretación
remoción
S. Aureus
Rugoso dificultad en la remoción
Difícil
remoción
P. aeruginosa
Liso P. Aeruginosa
Discontinuidad debilita la fuerza de adherencia
Difícil
remoción P. aeruginosa
Rugoso
Fácil
remoción

28. Sustratos lisos y microestructurados
control (NS) Microstruturado (MS)
Sustratos:
Oro
100
20.0
nm
nm
Polyisobutilcianoacrilato(PBCA)
0
0
Long de onda 250 nm y 20 nm
-20.0
-100
0 2.5 5.0 7.5 10.0 0 2.5 5.0 7.5 10.0
Cobre de amplitud.
m m
Wide= 750 nm + 550nm Ripples: ancho= 40 nm
deep = 120 nm profundidad=4 nm
70.0
Au evaporated, 200 nm thickness,
(II)
Cr-coated glass. Canales de ancho similar al díámetro de las bacterias
nm
0
Grains: 50-100 nm, w=2-3 nm
-70.0
Wave length 100-200 nm
0 2.5 5.0 7.5 10.0
m

29. Bacterias no-móviles
Staphylococcus aureus (AFM images)
Redes 2D Bacterias aisladas atrapadas
Se inhibe la formación de agregados

30. Colonización bacteriana de bacterias móviles sobre
sustratos lisos y microestructurados (MS)
NS: Redes 2D MS:Bacterias aisladas
4 m 4 m

31. NS MS
2 m 2 m
(a) (b)
Pseudomonas fluorescens
Lisos= agregados 2D (rafts) MS= Bacterias atrapadas

32. Bacterias Móviles (Pseudomonas)
Rafts de bacterias más
MS: Bacterias atrapadas en
largas
los canales
flagelo
flagelo
5 m
5 m

33. Biofilms de Pseudomonas sobre NS and MS
Las superficies MS disminuyen la
adhesión, independientemente de
su composición
Oro
Polyisobutylcyanoacrilate(PBCA)
Cobre
Adhesión 6 veces
menor
NS MS

34. MOVIMIENTO SUPERFICIAL DE LAS BACTERIAS:
COLONIZACIÓN DE SUPERFICIES LISAS POR
BACTERIAS SÉSILES (swarming)
Frente de
avance
Colonización
del sustrato

35. Colonización bacteriana oro liso
Distribuciones de tamaños de bacterias en el frente de
avance según el rol de las bacterias
•10% de las
células: tamaños
mayores a 2,5
micras.
•87% de las
células:
tamaños
mayores a
2,5 micras

36. Densidad superficial der
bacterias sobre
superficies lisas y con
canales

37. Imágenes de AFM y microscopía de epifluorescencia de sustratos
lisos y MS
LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Green, live bacteria

38. Efecto de la microestructura
superficial
Las microestructuras superficiales cuyas
dimensiones características son similares
al diámetro de las bacterias:
 Inhiben la formación de agregados bacterianos
 Disminuyen el desplazamiento de las bacterias
móviles
 Inhiben la colonización bacteriana de la
superficie

39. Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
 Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
 Superficies con propiedades fisicoquímicas
antiadherentes (AA)
 Superficies microestructuradas (MS)
 Estrategia combinada: A + MS +

40. Efecto del tratamiento con antibióticos sobre las bacterias
planctónicas y sobre los biofilms formados sobre superficies
lisas NS
Biofilms on NS
Streptomycin (ST)
105
Más de 104/cm2 bacterias
permanecen vivas con
CFU
4mg/L ST
101
0 1mg/L 2mg/L 4mg/L

41. Tratamiento con antibióticos de superficies lisas y MS
105
CFU
101
1mg/L 2mg/L 4mg/L
Importantes agregados
microbianos Débil
efecto de los
antibióticos
Agregados pequeños
Mayor efecto de los
antibióticos sobre las
superficies MS
(a) Number of viable bacteria after AA on NS and MS substrates (area: 0.25 cm2).
Epifluorescence image (Live/Dead kit) of P. fluorescens on
(b,c) NS substrate
(d,e) MS substrate after 2 h of ST. Green: live bacteria; red: dead bacteria

42. Imágenes de microscopía de epifluorescencia de biofilms de bacterias móviles y
no móviles sobre sustratos lisos (NS) y microestructurados (MS) tratados con
antibióticos (AT). Importante efecto MS + AT
LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Verdes:vivas, rojas: muertas

43. CFU
NS
MS
CFU
Pf Sa Pf Sa Pf Sa Pf Sa
Without AT 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L
AT: Streptomycin
Número de bacterias viables (Pseudomonas y Staphylococcus) después del
tratamiento con estreptomicina sobre superficies MS y lisas
CFU, colony-forming units.

44. Efecto sinérgico MS+A.
MS
+
AT MS AT MS+AT
control NS
MS+
MS
Decrease in survival cells
AT
SM
AT
Efecto
sinérgico
Estrategias y su efecto
MS (decrecimiento de 1 orden en el número de bacterias
A Decrecimiento de 2 órdenes en el número de bacterias
Estrategia combinada MS + AT : decrecimiento de 5 ordenes en el número
de bacterias

45. Efecto del tratamiento con antibióticos sobre bacterias
en agregados de sustratos lisos y sobre sustratos MS
NS MS
Incremento de la rugosidad

46. Incremento de la rugosidad en la membrana
celular MS+AT

47. Interacciones del biofilm con biomateriales y
células durante el tratamiento antimicrobiano
Biomaterial Agente
Antimicrobial
antimicrobiano
Agent
Biofilm
Células

48. Influencia de la liberación de antibióticos desde películas
poliméricas sobre el metabolismo celular
Efecto
antibacteriano
Efecto sobre
las células
Cortizo et al, J of Dentistry, 2012
Disminución de la supervivencia celular y de la actividad fosfatasa
alcalina

49. Efecto de la liberación de agentes antimicrobianos sobre
las células aledañas
Control células Ti Ti - PBA
Ti – PBA – CLH 0,35% Ti – PBA – CLH 0,7% Ti – PBA – CLH 1,4%
Dosis creciente de clorhexidina
Cortizo et al, J of Dentistry, 2012

50. Conclusiones:
 La adecuada modificación de las características del sustrato (fisicoquímica y
microestructural) puede ser una estrategia efectiva para inhibir la adherencia de bacterias.
 Las superficies microestructuradas con patrones de dimensión similar al diámetro de las
bacterias inhiben la adhesión de microorganismos y evitan la formación de agregados
microbianos y la colonización de superficies.
 La acción antibiótica aumenta si las bacterias están aisladas.
 Efecto sinérgico: Antibiótico + MS para bacterias móviles (P. aeruginosa and P.
fluorescens) and non-móviles (S. aereus).
 La estrategia combinada es adecuada para aumentar el efecto antimicrobiano con una
reducción de 5 órdenes en el número de bacterias adheridas al biomaterial
 Lás células de tejidos aledaños pueden ser afectadas por los agentes antimicrobianos y
debe determinarse la concentración máxima de antibiótico en las películas para liberación
controlada de agentes antimicrobianos.

51. Biomaterial
Antibiótico
Biofilm
Tejido

52. Acknowledgements
Dra. Carolina Díaz
Dr. Alejandro Miñán
Dra. Patricia Schilardi
Dra Cecilia Cortizo

55. S1 S2

56. Comparación de la colonización sobre:
• Sustratos lisos
• Sustratos con MS orientación paralela
• Sustratos con MS orientación perpendicular

57. SWARMING
Oro
liso
GLIDING

58. Orientación bacteriana sobre sustratos con
canales paralelos a la dirección del
desplazamiento
Agregados celulares
en forma oblicua a la
dirección de la
submicro-estructura
• Avance bacteriano oblicuo con respecto a la dirección de la microestructura
superficial evita que las bacterias queden atrapadas.
• Las bacterias oblicuas empujan a las que están atrapadas; gran demanda de
energía.

59. Estrategias de colonización superficies MS
Alargamiento de
células Material
polim. extrac
y surfactantes
fimbrias
Duplicación
Flagelos orientados
Bacterias deformadas por
empuje y salida de los
canales

60. Orientación bacteriana sobre superficies con
canales perpendiculares a la dirección de avance
Las orientaciones de
las bacterias no son
aleatorias, dependen
de la posición y de la
dirección de la
submicro-estructura

61. Influencia de la orientación del sustrato sobre la
longitud y dirección de las bacterias
Liso
18
(a)
Pe Pa
15
Relative frequency (%)
12
9
6
3
0
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Size ( m)
Longitud
Pe Pa
Angulo

62. Antibióticos, macrófagos y biofilms
d d. Las enzimas fagocíticas dañan los
tejidos circundantes y se liberan
bacterias desde el biofilm
c
c. Los fagocitos son atraídos por el
biofilm
b
b. Las bacterias de los biofilms son
resistentes a los antibióticos
a
a.Las bacterias planctónicas pueden
ser fagocitadas por los fagocitos y
son sensibles a los antibióticos