El documento explica el uso de plásmidos como vectores de clonación para introducir genes de interés, como el de la hormona de crecimiento humana, en bacterias. Describe la importancia de utilizar enzimas de restricción para insertar estos genes en los plásmidos y cómo se identifica la presencia del gen inserto a través de marcadores como la resistencia a antibióticos y la producción de enzimas específicas. Finalmente, se detallan los pasos para obtener colonias bacterianas que pueden sintetizar la hormona de crecimiento para su producción comercial.

1. Vamos a clonar un GEN…

2. fragmento amplificado por PCR
que incluye el gen de interés
PLÁSMIDO
(VECTOR DE CLONACIÓN)
Cada grupo tenéis un plásmido y un fragmento de ADN:

3. Pero, ¿qué es un PLÁSMIDO?
Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular extracromosómico
que suele encontrarse de forma natural en algunas bacterias y levaduras.
by Spaully (Wikimedia Commons)

4. ¿Por qué un PLÁSMIDO se usa como VECTOR de CLONACIÓN?
De forma natural, a veces las bacterias se transfieren plásmidos de unas a otras.
Es una de las formas que tienen para intercambiar material genético entre ellas.
byAdenosine(WikimediaCommons)

5. ¿Por qué un PLÁSMIDO se usa como VECTOR de CLONACIÓN?
Los plásmidos muchas veces contienen genes de resistencia a antibióticos,
como el gen de la enzima b-lactamasa que es capaz de romper las moléculas
de antibióticos como la penicilina, la amoxicilina o la ampicilina.
byKeeperoftheforest(WikimediaCommons)
Estructura general de antibióticos b-lactámicos
enzima b-lactamasa
que rompe el anillo
e inactiva el antibiótico

6. ¿Por qué un PLÁSMIDO se usa como VECTOR de CLONACIÓN?
Una vez tienen el plásmido, se hacen resistentes y el antibiótico deja de funcionar.
by@AntibioticsRise(Twitter)

7. ¿Por qué un PLÁSMIDO se usa como VECTOR de CLONACIÓN?
Imaginad que tenéis una infección por una bacteria y os tomáis un antibiótico…
byAlexRyan(vscomic.com)

8. ¿Por qué un PLÁSMIDO se usa como VECTOR de CLONACIÓN?
Si no seguís correctamente el tratamiento, puede ser que alguna bacteria tenga
un plásmido que le otorgue resistencia y lo empiece a pasar al resto… ¡Horror!!!
byAlexRyan(vscomic.com)

9. ¿Cómo se usa un PLÁSMIDO como VECTOR de CLONACIÓN?
Los humanos nos aprovechamos de estos plásmidos para modificarlos
e introducir en bacterias los genes que nos interesa sintetizar…
1) Corto y pego en un plásmido
el gen humano de la insulina
2) Lo introduzco en bacterias
(TRANSFORMACIÓN)
3) Lo bacteria se transforma
en una súper fábrica de
insulina recombinante
insulina

10. fragmento amplificado por PCR
que incluye el gen de interés
Volvamos a nuestro plásmido y al fragmento de ADN:
gen de la
hormona de
crecimiento
humana
(GH)

11. ¿Cómo se obtienen muchas copias del gen de la GH humana?
Una forma de obtener copias del gen de interés para introducirlo
en los plásmidos, es la técnica de amplificación por PCR.
byEnzoklop(WikimediaCommons)
PCR
reacción en cadena de la polimerasa

12. ¿Cómo se obtienen muchas copias del gen de la GH humana?
byBIONINJA(https://ib.bioninja.com.au/)

13. ¿Para qué clonar el gen de la hormona de crecimiento?
gen de la
hormona de
crecimiento
humana
(GH)
La hormona de crecimiento se utiliza para tratar trastornos
en los que hay un déficit de esta hormona en el organismo,
caracterizados por retraso en el crecimiento, especialmente
el longitudinal, y otras alteraciones neurológicas.

14. fragmento amplificado por PCR
que incluye el gen de interés
¿Y qué son esas pequeñas pegatinas de colores?
gen de la
hormona de
crecimiento
humana
(GH)
son DIANAS
para diferentes
ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN

15. Entonces, ¿qué es una ENZIMA de RESTRICCIÓN?
Las ENZIMAS de RESTRICCIÓN son enzimas presentes en las bacterias que reconocen
una secuencia de nucleótidos característica y cortan el ADN en ese punto en concreto
.

16. EcoRI es una ENZIMA de RESTRICCIÓN
Por ejemplo, Escherichia coli fabrica una enzima de restricción llamada
EcoRI que corta esta secuencia cada vez que la encuentra en el ADN.
EXTREMOS COHESIVOS
(son bases complementarias)
EcoRI

17. Cada ENZIMA de RESTRICCIÓN corta por un sitio distinto
http://www.biologydiscussion.com/enzymes/restriction-enzymes-enzymes/restriction-enzymes-with-diagram-microbiology/50902

18. Y esto, ¿para qué nos va a servir al clonar un gen?

19. Si cortamos el gen de interés y el plásmido con la misma
enzima de restricción… ¡Podremos insertar el gen en el plásmido!
by CNX OpenStax (Wikimedia Commons)

20. fragmento amplificado por PCR
que incluye el gen de interés
Ya sabemos más cositas sobre enzimas pero, ¿y el plásmido?
gen de la
hormona de
crecimiento
humana
(GH)
PLÁSMIDO
¿Qué partes
diferenciadas
tiene?

21. ¿Qué cosas debe tener un PLÁSMIDO para
poder usarse como un VECTOR de CLONACIÓN?
Si no tiene ORI, el plásmido no
podrá replicarse, y por tanto,
al no poder multiplicarse,
no pasará a las bacterias hijas
cuando se dividan.
Ori
Origen de
replicación
Al menos 2
marcadores
Pueden ser genes de alguna resistencia a antibiótico o
para sintetizar alguna enzima que permita distinguir:
Si en el plásmido se ha
insertado el gen de interés
Si la bacteria se ha transformado
y tiene el plásmido en su interior

22. fragmento amplificado por PCR
que incluye el gen de interés
Las partes de nuestro plásmido son:
gen de la
hormona de
crecimiento
humana
(GH)
origen de
replicación
ori
resistencia
a Ampicilina
Amp
enzima b-galactosidasa
Lac Z

23. 1. Marcador de resistencia a un antibiótico
Pueden ocurrir 2 posibilidades:
resistencia
a Ampicilina
Amp
bacteria sin plásmido,
sensible al antibiótico
bacteria con plásmido,
resistente al antibiótico
Medio de cultivo
Con el antibiótico
no crece crecen colonias

24. 2. Marcador LacZ: enzima b-galactosidasa
enzima b-galactosidasa
Lac Z
LacZ codifica para una enzima que, en
presencia del sustrato X-Gal colorea
las bacterias de color azul.
SI LA BACTERIA TIENE
EL PLÁSMIDO Y
SINTETIZA LA ENZIMA
SI LA BACTERIA NO
SINTETIZA LA ENZIMA
Medio de
cultivo
Con el sustrato
X-gal crecen colonias
sin color
crecen colonias
de color azul

25. 2. Marcador LacZ: enzima b-galactosidasa
Este marcador lo utilizaremos para
saber si se ha insertado el gen de la
hormona de crecimiento o no:
Lac Z
Dentro de este marcador hay
varias dianas de restricción, así
que intentaremos insertar el gen
humano en medio de LacZ
Medio
Con X-gal
colonias sin color
tienen el INSERTO
SI SE INSERTA EL GEN
EN MEDIO DE LacZ,
LA ENZIMA NO FUNCIONARÁ
SI EL PLÁSMIDO SE VUELVE
A LIGAR Y SE QUEDA VACÍO,
LA ENZIMA FUNCIONARÁ
colonias azules tienen
el plásmido VACÍO

26. Con toda esta información, vais a intentar:
1) Elegir qué enzima de restricción
utilizaréis en la digestión:
Medio CON AMPICILINA Y X-gal
BamH I
Bgl II
Sma I
2) Tras la digestión, la enzima LIGASA
unirá los extremos cohesivos
3) Se transformarán células
competentes de E. coli con
el plásmido resultante y se
cultivarán en placas Petri
4) Explicar que colonias obtendréis y qué plásmido tendrá cada tipo

27. Es tiempo de completar la hoja de respuestas
fragmento amplificado por PCR
que incluye el gen de interés
gen de la
hormona de
crecimiento
humana
(GH)
origen de
replicación
ori
resistencia
a Ampicilina
Amp
Lac Z
PLÁSMIDO
(VECTOR DE CLONACIÓN)

28. En definitiva, así clonaremos nuestro gen:
by CNX OpenStax (Wikimedia Commons)

29. Tras digerir con SmaI, las colonias sin color que crezcan
en el medio con ampicilina y X-Gal tendrán este plásmido:
PLÁSMIDO
CON INSERTO
gen de la
hormona de
crecimiento
humana (GH)resistirá al
medio con
Ampicilina
Amp
la enzima
b-galactosidasa está
cortada por el inserto así
que no se expresará
Lac Z
podrá replicarse
sin problema
ori
(colonias sin color)
Tras la digestión con
SmaI sobrará un trozo
del amplificado de PCR
pero que no afecta al
gen de interés

30. Solo nos quedará cultivar industrialmente las bacterias obtenidas,
que comiencen a sintetizar GH y luego purificarla para su venta
http://www.china-bioreactor.com/sp/product/234.html
Hormona de crecimiento
recombinante
de venta en farmacias