1. La espectroscopia de fluorescencia involucra la excitación de átomos o moléculas mediante la absorción de radiación electromagnética, lo que causa que emitan radiación a una longitud de onda mayor cuando regresan a su estado fundamental. 2. Los fluorómetros y espectrofluorímetros se utilizan para medir la fluorescencia emitida, variando las longitudes de onda de excitación y detección para obtener espectros. 3. La fluorescencia se utiliza en una variedad de aplicaciones biomédicas y analíticas

1. Análisis Instrumental

2.  Es el proceso de emisión de la luz que acompaña a la
transición espontanea de una molécula desde el estado
excitado hasta el nivel de menor energía.
 Es la radiación UV- visible que emiten los átomos o las
moléculas que se han excitado al absorber la radiación.

3. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA.
Gran sensibilidad
Alto nivel alcanzado tanto
por los instrumentos
requeridos, como por los
fluoróforos diseñados para
aplicaciones específicas.
Fluorescencia: ciertas sustancias absorben energía en
forma de radiación electromagnética emitiéndola en
una longitud de onda mayor en un período de tiempo
muy corto.
Se trata de utilizar un haz de luz, por
lo general luz ultravioleta, que excita
los electrones de las moléculas de
ciertos compuestos y provoca que
emitan luz de una menor energía.

4. 1. Los Átomos o las moléculas son excitados por absorción de la
radiación electromagnética.
2. Las especies que han sido excitadas se relajan luego hacia el estado
fundamental, liberando el exceso de energía en forma de fotones.
Las dos principales ventajas de los métodos de fluorescencia sobre los de
absorción son:
1) Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor.
2) Mayor intervalo de respuesta lineal. No obstante, los métodos de
fluorescencia se aplican menos que los de absorción ya que no todos los sistemas
químicos son capaces de fluorescer y además el equipamiento necesario es
mucho más costoso que el de la espectroscopia de absorción.

5. FLUORÓFOROS.
Los fluoróforos se
pueden dividir en
dos clases
generales:
extrínsecos e
intrínsecos.
Dichas moléculas
son generalmente
orgánicas
poliaromáticas o
heterociclos.
La fluorescencia es
el resultado de una
serie de procesos
que ocurren en
ciertas
moléculas llamadas
fluoróforos.
FIGURA NO. 1 Moléculas
aromáticas que no
fluorescen
FIGURA NO. 2 Moléculas
aromáticas que
fluorescen

6. FUNDAMENTOS.
• Cuando el fluoróforo absorbe luz
uno de sus electrones pasa a un
estado excitado (de mayor
energía) que es inestable y al
retornar a su estado basal, el
exceso de energía se libera en
forma de luz pero de una longitud
de onda mayor (menor energía) a
la de excitación. Este proceso es
representado por el diagrama de
Perrin-Jablonski.
Diagrama de Perrin-Jablonski .

7. TEORIA DE LA ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA.
Las moléculas
tienen diferentes
estados llamados
niveles de energía se
refiere
principalmente a
estados
vibracionales y
electrónicos.
• En general, las especies objeto de examen tendrán
un estado electrónico basal (un estado de baja
energía) de interés, y un estado electrónico
excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de
estos estados electrónicos hay diferentes estados
vibracionales.
Primero se excita la
muestra mediante la
absorción de un fotón
de luz, desde su
estado electrónico
basal a uno de los
distintos estados
vibracionales del
estado electrónico
excitado.
• Las colisiones con otras moléculas
causan que la molécula excitada
pierda energía vibracional hasta que
alcanza el estado vibracional más
bajo del estado electrónico excitado.
La molécula
desciende luego a
uno de los distintos
niveles de vibración
del estado
electrónico basal,
emitiendo un fotón
en el proceso.
• mediante el análisis de las diferentes
frecuencias de luz emitida por
espectrometría de fluorescencia,
junto con sus intensidades relativas,
se puede determinar la estructura de
los diferentes niveles de vibración.

8. • Localización subcelular
• Cambios en la concentración
• Interacciones moleculares
• Cambios conformacionales
• Distancias intra/intermoleculares
• Difusión rotacional
• Caracterización estructural
• Actividad enzimática

9. • Determinación de farmacocinética.
• Elaboración de antibióticos ya que la unión de
anticuerpos a fluorocromos (Los fluorocromos son
moléculas químicas que absorben luz a una determinada
longitud de onda y emiten a otra diferente) mejora la
especificidad.
• En el desarrollo de un fármaco con el fin saber en qué
sitio el fármaco se unirá a una cierta proteína o
biomolécula y posteriormente llevar a cabo su acción.
• Determinar estructuras y enlaces químicos.

10. • Los indicadores fluorescentes se han utilizado
ampliamente para estudiar fenómenos biológicos en el
interior de las células.
• SONDA IÓNICA, que cambia su espectro de excitación o
emisión cuando une iones específicos como Ca2+ o
Na+. Estos indicadores sirven para registrar fenómenos
que ocurren en distintas partes de las neuronas o vigilar
simultáneamente la actividad de un conjunto de
neuronas.
• Detección de cromatografía fina o electroforesis capilar.
• HPLC para la determinación de proteínas

11. • Fluorómetros
• Espectrofluorímetros:
Instrumento equipado con 2 monocromadores
Variar la longitud obtener espectro de emisión
de onda de excitación

12. *Filtro
*Facil de usar
*lámpara de mercurio
(exitacion)
*Tubos
fotomultiplicadores(detector)
*haz de referencia y de
muestra
*Espectros de excitación y
emisión.
*2 monocromadores de red
*fotomultiplicador y muestra.
*espectros corregidos.
FLUORÓMETROS ESPECTROFLUORIMETROS

13. FACTORES QUE AFECTAN LA
FLUORESCENCIA.
Estructura: La
fluorescencia se
presenta más
comúnmente y en
forma más intensa
con compuestos
que tienen grupos
funcionales
aromáticos con
bajas energías de
transición π→π∗.
Temperatura y
naturaleza del
solvente: El efecto de
un aumento en la
temperatura
incrementa el número
de choques
moleculares, por lo
que la desactivación
tiende a
efectuarse a través de
procesos no radiativos
y por lo tanto se inhibe
la fluorescencia.
Efecto del pH:
Debido a las
diferentes formas
químicas que son
posibles de existir a
diferentes
condiciones de pH,
la intensidad de
fluorescencia
también es
afectado por
este factor.
Efecto del oxígeno
disuelto: Debido al
paramagnetismo de la
molécula de oxígeno,
esta tiende a desactivar
cualesquier estado
activado por oxidación
fotoquímica de la
especie
fotoluminiscente,
provoca cruzamiento
intersistemas y
conversiones de las
moléculas excitadas al
estado triplete

14. INSTRUMENTOS UTILIZADOS PARA
DETECTAR FLUORESCENCIA.
• Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos básicos de la fluorescencia,
entre ellos:
• Espectrofluorómetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la fluorescencia de la
muestra (el volumen de muestra que mide ronda entre los µL a mL).
• Microscopio de Fluorescencia: determina la fluorescencia como una función de las coordenadas
espaciales en dos o tres dimensiones para objetos microscópicos (por debajo de ~ 0,1 mm de
diámetro).
• Scanner de Fluorescencia: determina la fluorescencia en función de coordenadas en dos
dimensiones de objetos macroscópicos como ser geles de electroforesis, blotting y
cromatografías.
• Citometría de Flujo: incorpora un detector de fluorescencia para determinar la fluorescencia de
células, en un flujo a través de un capilar. Permite identificar y cuantificar subpoblaciones de
células en una muestra compleja.
• Otros tipos de instrumentos que usan la detección por fluorescencia son los sistemas de
electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciación de DNA.

15. Un fluorímetro consta de una fuente de luz y de un sistema de
selección de longitud de onda de excitación. Cuando la muestra es
excitada con radiación de energía apropiada emite radiación en todas
las direcciones del espacio. No obstante la luz emitida se detecta
mejor en ángulo recto con respecto al haz de excitación ya que se
evitan problemas de dispersión de la luz y también el haz de luz
excitante que es de mucha mayor intensidad que el haz de luz emitida.
La luz emitida es recogida seleccionando una longitud de onda
apropiada y conducida a un detector donde queda registrada por
sistemas similares a los de un espectrofotómetro de absorción.
Diseño experimental de un equipo de medida de
Fluorescencia.