El documento describe la citometría de flujo, una técnica de análisis celular que permite el estudio multiparamétrico de muestras biológicas mediante el uso de láseres y detección de señales de dispersión y fluorescencia. Se analizan parámetros como tamaño, complejidad y marcajes antigénicos o de fluorescencia para caracterizar poblaciones celulares de forma simultánea y cuantitativa.

1. Citometría de Flujo

2. Citometría de Flujo Análisis celular multiparamétrico Láser focalizado = señales celulares recogidas por diferentes detectores. Tamaño y complejidad Inmunofenotipo. Señales de dispersión. Señales de fluorescencia.

3. Parámetros Dispersión: *FSC: Tamaño *SSC: Complejidad. Fluorescencia: Uniones AG-AC Marcaje con fluorocromos. Poblaciones celulares detectadas simultáneamente.

4. Ventajas Múltiples marcajes. Analizar un elevado numero de partículas en un corto periodo de tiempo. Cuantificación de la actividad antigénica. Mayor sensibilidad y objetividad. Análisis de poblaciones celulares Almacenamiento de la información para análisis posteriores.

5. FLUOROCROMOS Absorben luz a una   Emiten a otra. Espectros de excitación y de emisión. Uso  Tipo de láser y su long.de onda. Corto estado de excitación. Fotoestables. Alto rendimiento cuántico.

6. FLUOROCROMO DESCRIPCION FITC Isotiocianato de Fluoresceína PE Ficoeritrina PerCP Proteína Clorofila Peridinina TRITC Isotiocianato de tetrametil rodamina 540---570 PEC Ficoeritrina cianina RT Rojo Texas 596----615nm PC Ficocianina 620---650nm APC Aloficocianina 650-----660nm TRICOLOR TRICOLOR 540--------570nm ALEXA-FLUOR FLUOROCROMO : Molecular Probes

7. CITOMETRO

8. SISTEMAS OPTICOS

9. Como se preparan las muestras?? TIPO de MX. Médula ósea. - Sangre periférica. - Exudados y trasudados - LCR. - BAL. - Tejidos sólidos como ganglios. - Células procedentes de cultivos celulares. - Productos de aféresis.

10. CITOGRAMAS Línea Blanca Lo  Rojo No  Azul Eo  Amarillo Mo  Verde PQ y Rcel.  Negro

11. CITOGRAMAS Línea Roja: H  Rojo PQ  Verde Residuos  Azul

12. FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

13. ¿Qué es la citometría de flujo? FSC 90º 2- 4º Columna de muestra Meeting point Láser Detectores de luz Amplificación digitalización Representación y Analisis Flujo

14. ¿Cómo funciona un citómetro? Sistema de flujo Dispersión de la luz Fluorescencia Separación y detección de la luz Amplificación Corrección de errores: solapamiento espectral y formación de dobletes Digitalización y almacenamiento de la información

15. 1.1. SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA MUESTRA AIRE FLUJO MUESTRA

16. 1.2. Cámara de flujo FSC 90º Fluido envolvente Columna de muestra Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente,  = 90 º Luz incidente Luz dispersada hacia delante,  = 2- 4º

17. Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light ) Detector FSC Detector de 90º SSC Laser

18. DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula FSC SSC

19. DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad) FSC SSC

20. Granulocitos CD15+ Monocitos CD14+ Linfocitos CD3+ T2ab T1gd CD4+ CD8+ CD56+ CD19+ CD5+ CD5- Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular

21. Laser Detectores de fluorescencia Fluorescencia Detector Detector de fluorescencia (PMT3, PMT4 etc.)

22. Fluorescencia FSC FL-1 FL-2

23. Fluorescencia Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón. Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido. t (  s) E  1 <  2  1  2

24. Citómetros con 1 láser: 2 D (dispersión) y 3 Fl (fluorescencia) Citómetros de 2 láser: 2D y 4 Fl TIPOS DE LASER Láser Violeta 405 nm Láser Azul 488 nm (Argón) Láser Verde 543 nm Láser Rojo 633-635 nm (He-Ne) Citometros Flujo

25. Espectros Espectro de Absorción Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas longitudes de onda por una sustancia Espectro de Emisión Representación de la intensidad de emisión de una sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda. Intensidad de fluorescencia   nm    excitación medida

26. DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA TC PerCP QR Cy5 APC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 Detectores Fluorocromos

27. Escalas FSC Ej: Lineal FL-1 Ej: Logarítmica

28. Compensación de señales Fundamento Superposición de espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un fluorocromo es leída por el detector de otro color Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color FL-2 - %FL1 excitación medida Intensidad de fluorescencia FL-1 FL-2 l

29. Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.

30. Histogramas SSC FSC FL-1 FL-2 FL-3

31. Representación biparamétrica en 2D Diagrama de puntos / dot plot + + - - + + - - FL-1 FL-2

32. Representación 3D Countour plot / Diagramas de contornos X, Y más una tercera dimensión. La altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros. Densidad=altura Diagrama de dot plot density Usa colores para representar densidad

33. Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos Sitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés. Selección de la información Gates (Puertas) / ventanas (windows)

34. Estadisticas biparamétricas Cuadrantes Combinación de dos umbrales de positividad para dos parámetros Número de células % de células MFI mean, geo mean + - - + + - + - U L U L LL L R