Este documento describe tres tipos de luminiscencia: fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia. La fluorescencia ocurre cuando una sustancia absorbe luz UV/visible y emite luz a una longitud de onda mayor. La fosforescencia involucra un estado excitado metaestable. La quimioluminiscencia ocurre cuando una reacción química produce especies electrónicamente excitadas que emiten luz al volver al estado fundamental. El documento también discute la instrumentación y aplicaciones de estos fenómenos.
La espectrofotometría uv-visible (UV-VIS) es una práctica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. La espectrofotometría uv-visible se basa en la medición de absorción de radiación UV o visible por determinadas moléculas, la radiación correspondiente a estas regiones del espectro electromagnético causa transiciones electrónicas a longitudes de onda característica de la estructura molecular de un compuesto.
Aplicación de la espectrofotometría uv-visible
La espectrofotometría uv-visible es utilizada generalmente en la valoración cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos, ambos absorben la luz. La Ley de Beer-Lambert estipula que la absorbancia de una solución es directamente proporcional de la concentración de la solución, por lo que la espectrofotometría uv-visible puede usarse para determinar la concentración de la solución.
Espectrofotómetro uv-visible
El espectrofotómetro uv-visible es un instrumento óptico que tiene la capacidad de resolver radiaciones de diferentes longitudes de onda dentro del rango ultravioleta y visible (por lo general este rango se encuentra dentro de los valores de 190 a 1,100 nm).
Descripción del equipo:
Está compuesto por una fase luminosa, monocromador, elementos fotodetectores y un sistema de registro.
• Fase luminosa: una bombilla pequeña de filamento enrollado es ideal para concentrar la luz en un haz intenso. La incandescencia causada por la luz visible de la lámpara de tungsteno-halógeno se basa en las altas temperaturas de calentamiento que alcanzan el filamento.
• Moncromadores: descompone la luz incidente de un espectro de luz, es decir, se encarga de separar y seleccionar la radiación de onda que se quiere analizar. Está compuesto por las rendijas de entradas y salida de, colimadores y el elemento de dispersión, en los monocromadores convencionales se usa el prisma como elemento de dispersión.
Cuando un haz de luz atraviesa un medio que contiene un analito absorbente, su intensidad disminuye a medida que interacciona con el analito. En este sentido, en el estudio de un compuesto por espectrofotometría, el analito debe cumplir dos requisitos: a) que pueda absorber luz, y b) la absorción debe distinguirse de la de otras sustancias en la muestra. Para una disolución de analito a una concentración dada, cuanto mayor sea la trayectoria en el medio por el cual pasa la luz, más absorbentes habrá en la trayectoria y mayor será la atenuación. De manera similar, para una longitud de la trayectoria de la luz dada, cuanto mayor sea la concentración de los absorbentes, mayor será la atenuación. A este fenómeno se le conoce como la ley de Beer-Bouguer-Lambert, comúnmente conocida como ley de Beer.
La espectrofotometría uv-visible (UV-VIS) es una práctica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. La espectrofotometría uv-visible se basa en la medición de absorción de radiación UV o visible por determinadas moléculas, la radiación correspondiente a estas regiones del espectro electromagnético causa transiciones electrónicas a longitudes de onda característica de la estructura molecular de un compuesto.
Aplicación de la espectrofotometría uv-visible
La espectrofotometría uv-visible es utilizada generalmente en la valoración cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos, ambos absorben la luz. La Ley de Beer-Lambert estipula que la absorbancia de una solución es directamente proporcional de la concentración de la solución, por lo que la espectrofotometría uv-visible puede usarse para determinar la concentración de la solución.
Espectrofotómetro uv-visible
El espectrofotómetro uv-visible es un instrumento óptico que tiene la capacidad de resolver radiaciones de diferentes longitudes de onda dentro del rango ultravioleta y visible (por lo general este rango se encuentra dentro de los valores de 190 a 1,100 nm).
Descripción del equipo:
Está compuesto por una fase luminosa, monocromador, elementos fotodetectores y un sistema de registro.
• Fase luminosa: una bombilla pequeña de filamento enrollado es ideal para concentrar la luz en un haz intenso. La incandescencia causada por la luz visible de la lámpara de tungsteno-halógeno se basa en las altas temperaturas de calentamiento que alcanzan el filamento.
• Moncromadores: descompone la luz incidente de un espectro de luz, es decir, se encarga de separar y seleccionar la radiación de onda que se quiere analizar. Está compuesto por las rendijas de entradas y salida de, colimadores y el elemento de dispersión, en los monocromadores convencionales se usa el prisma como elemento de dispersión.
Cuando un haz de luz atraviesa un medio que contiene un analito absorbente, su intensidad disminuye a medida que interacciona con el analito. En este sentido, en el estudio de un compuesto por espectrofotometría, el analito debe cumplir dos requisitos: a) que pueda absorber luz, y b) la absorción debe distinguirse de la de otras sustancias en la muestra. Para una disolución de analito a una concentración dada, cuanto mayor sea la trayectoria en el medio por el cual pasa la luz, más absorbentes habrá en la trayectoria y mayor será la atenuación. De manera similar, para una longitud de la trayectoria de la luz dada, cuanto mayor sea la concentración de los absorbentes, mayor será la atenuación. A este fenómeno se le conoce como la ley de Beer-Bouguer-Lambert, comúnmente conocida como ley de Beer.
practica 1 microscopia por flouresencia.pdfMontsColmena
¿Qué es la microscopía por fluorescencia?
La microscopia básica se basa en teñir mediante colorantes los componentes celulares que normalmente son incoloros y no se pueden distinguir al microscopio. Entonces mediante el contraste se permite distinguir las estructuras para su estudio. La microscopía de fluorescencia tomó esta idea fundamental y la modifico para su propio uso.
Entonces decidieron suplantar colorantes comunes por tintes fluorescentes que son moléculas capaces de absorber la luz en una longitud de onda específica. Para posteriormente con cierto tiempo de retraso emitir o reflectar su propia luz en una longitud de onda más larga de la que recibió. El retraso entre la absorción y la emisión es realmente insignificante, ya que hablamos de nanos segundos. A estos tintes que poseen esta capacidad se les conoce como fluorocromos o fluoróforos. (Tovar, 2016)
La fluorescencia refiere al proceso mediante el cual un espécimen absorbe y subsecuentemente irradia luz, en un intervalo de tiempo (entre la absorción de la luz de excitación y la emisión de la luz fluorescente) que es usualmente de pocos nanosegundos. (Pietrasanta & Bilderling, 2011)
La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia, propiedad de ciertos elementos químicos denominados fluorocromos o fluoróforos. El fluorocromo es utilizado como un marcador colorante fluorescente para crear contraste en zonas determinadas de elementos de interés (desde simples moléculas hasta microorganismos). El fluoróforo es una parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que tiene propiedad de fluorescencia, i.e. que absorbe fotones con longitudes de onda cortas y emite fotones con mayores longitudes onda. La Figura 1 muestra el espectro de absorción de una substancia fluorescente y su respectivo espectro de emisión que está desplazado a mayores longitudes de onda. (Ormachea & Villazón, 2017)
Fundamentos de la microscopia de fluorescencia
CONSTITUCION FUNDAMENTAL:
Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común
Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.
Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos:
*El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecc
PRÁCTICAS PEDAGOGÍA.pdf_Educación Y Sociedad_AnaFernández
Fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia
1. BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA
DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
LIC.QUIMICO FARMACOBIOLOGO
Análisis espectrofotométrico
Catedrático: Hilda Aguilar Rueda
Fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia
3. ÍNDICE
Fluorescencia • Definición
• Rendimiento cuántico y tiempo de vida.
• instrumentación
• Aplicaciones
Fosforescencia *Definición
*Aplicaciones
*instrumentación
quimioluminiscencia • Definición
• ejemplo
4. Fenómeno por el cual
algunas sustancias
tienen la capacidad de
absorber luz a una
determinada longitud
de onda, por lo general
en el rango ultravioleta,
y luego emiten luz en
una longitud más larga.
Fluorescencia
6. RENDIMIENTO CUÁNTICO
• Se define como la proporción entre el número de fotones
emitidos y el de fotones absorbidos <1
•
• El máximo rendimiento cuántico de fluorescencia es por lo
tanto 100%; esto significa que cada fotón absorbido resulta en
un fotón emitido. Sin embargo compuestos con rendimientos
cuánticos de 0.10 se consideran aún bastante fluorescentes.
7. TIEMPO DE VIDA
• El tiempo de vida de la fluorescencia depende básicamente del tiempo
promedio que permanece la molécula en su estado de excitación antes de
emitir un fotón.
• La fluorescencia típicamente sigue una cinética de primer orden:
Donde [S1] es la concentración de moléculas en estado de excitación en el
tiempo (t),[S1]0 es la concentración inicial y Γ es la tasa de decaimiento o
el inverso del tiempo de vida de la fluorescencia.
8. • Efecto de la concentración en la intensidad de
fluorescencia
• La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la
potencia radiante del haz de excitación absorbido por el
sistema. Esto es,
• F = K'(Po- P)
•
• Donde Po es la potencia del haz que incide sobre la disolución y
P es su potencia después de atravesar una longitud b del
medio. La constante K' depende de la eficacia cuántica del
proceso de fluorescencia.
10. • Ambos tipos usan el siguiente esquema: La luz
procedente de una fuente de excitación pasa a través
de un filtro o un monocromador y golpea la muestra.
Una porción de la luz incidente es absorbida por la
muestra y algunas de las moléculas en la muestra
fluorescente. La luz fluorescente es emitida en todas
las direcciones. Algunas de estas luces fluorescentes
pasan a través de un segundo filtro o un monocromador
y alcanzan un detector, el cual es usualmente colocado
a noventa grados de la incidencia del haz de luz para
minimizar el riesgo de la transmisión o reflejo de la
incidencia de la luz buscada en el detector.
14. FUENTES • La lámpara mas corriente para los
fluorimetros de filtro es lámpara de arco de
mercurio a baja presión equipada con una
ventana de sílice fundida. Esta fuente
produce líneas muy intensas a 254, 366,405,
436, 546,577, 691 y 773 nm .
• Para los espectro fluorimetros, en donde se
requiere una fuente de radiación continua,
normalmente se utiliza una lámpara de arco
de xenón a elevada presión, el espectro de
la lámpara de xenón es es continuo desde
aproximadamente 300 a 130 nm
15. FILTROS Y MONOCROMADORES
• La mayoría de los espectrofluorimetros están equipados con
monocromadores de red
16. LÁSERES.
• La mayoría de los espectrofluorímetros
comerciales utilizan lámparas como fuentes,
por ser menos caras y menos complicadas de
uso. Sin embargo, las fuentes de láser ofrecen
importantes ventajas en determinados casos:
por ejemplo, cuando las muestras son muy
pequeñas como en cromatografía con
microcolumnas y en electroforesis capilar
donde la cantidad de muestra es de un
microlitro o menor; en los sensores de control
remoto, como en la detección fluorimétrica de
radicales hidroxilo en la atmósfera de clorofila
en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza
colimada de los haces de láseres vital: o
cuando se requiere una radiación de excitación
altamente monocromática para minimizar los
efecto de las interferencias
17. DETECTORES
La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por tanto, se
necesitan factores de ampliación altos para estas medidas. Los
fotomultiplicadores han sido ampliamente utilizados como detectores
en instrumentos de fluorescencia sensibles. Los detectores de diodos
alineados también han sido propuestos para los espectrofluorimetros
18. Cubetas y
compartimiento
s para la cubeta
Para medidas de fluorescencia se
utilizan tanto cubetas cilíndricas
como rectangulares fabricadas
con vidrio de sílice. Con este
objeto se introducen a menudo
deflectores en el compartimiento
19. APLICACIONES • Este fenómeno tiene múltiples aplicaciones,
desde los tubos de luz fluorescentes que
podemos ver habitualmente en casas y
oficinas, hasta técnicas de laboratorio para
detectar antígenos y anticuerpos, pasando por
técnicas de oftalmología para detectar
lesiones en la córnea.
• Otro de las aplicaciones de este fenómeno es
en la diferenciación de billetes falsos de
verdaderos, ya que únicamente los verdaderos
tienen una impresión con tinta fluorescente,
sólo visible bajo una luz especial.
21. DEFINICIÓN
• Es el fenómeno en el cual el fotón es absorbido, excitando
un electrón hacia un nivel de energía mayor, y luego, al
volver el electrón al nivel de energía que le corresponde,
libera el fotón. En el caso de la fosforescencia, la energía
aportada por el fotón trasladaría al electrón a un estado
de excitación de energía metaestable, en el cual
permanece por un cierto tiempo, ya que no puede regresar
inmediatamente a su estado de reposo. Cuando una
determinada cantidad de tiempo pasa, el electrón vuelve a
su estado original, emitiendo luz en el proceso.
22.
23. APLICACIONES
• Este fenómeno es aprovechado en aplicaciones tales como la pintura de las
manecillas de los relojes, o en determinados juguetes que se iluminan en la
oscuridad.
• La fosforimetría se ha utilizado para
• determinar una gran variedad de especies
• orgánicas y bioquímicas que incluyen
• sustancias como ácidos nucleicos,
• aminoácidos, pirina y pirimidina, enzimas,
• hidrocarburos del petróleo y pesticidas
Científicos en el Reino Unido, están probando
una nueva técnica para operar tumores
cerebrales, en la que los pacientes que lo
padezcan reciben una dosis de ácido 5-
aminolevulínico (5-ALA), sustancia que
provoca que en el tumor se generen agentes
químicos fosforescentes o luminiscencia,
marcando el tumor y el cerebro de color
rosado
24. •Variables que afectan a la fosforescencia
•Tanto la estructura molecular como el entorno
químico van a influir en que una sustancia sea o
no luminiscente; estos factores también
determinan la intensidad de emisión cuando tiene
lugar la fotoluminiscencia.
26. Fosforímetros
• .
Los instrumentos que se utilizan para estudios de
fosforescencia tienen diseños similares a los
fluorómetros y a los espectrofluorímetros antes
considerados, sólo difieren en que requieren dos componentes
adicionales. El primero es un dispositivo que irradia
alternativamente la muestra y, después de un retraso en el
tiempo adecuado, mide la intensidad de fosforescencia.
El retraso en el tiempo es necesario para diferenciar la
emisión fosforescente de larga vida de la emisión
fluorescente de corta vida que podrían originarse en la misma
muestra. Se utilizan dispositivos mecánicos y electrónicos y
muchos instrumentos de fluorescencia comerciales tienen
accesorios para medidas de fosforescencia. Un ejemplo de un
tipo de dispositivo mecánico se muestra en la Figura
28. Definición • Bajo quimioluminiscencia se entiende el
fenómeno por el que, en algunas
reacciones químicas se da una especie
electrónicamente excitada la cual
emite radiación para volver al estado
fundamental, la energía liberada no
sólo se emite en forma de calor o de
energía química, sino también en forma
de luz, se produce cuando, en una
reacción química, los electrones saltan
de las capas más altas de los átomos a
las más bajas
29.
30. • .
Ejemplos
El ejemplo más conocido es la
oxidación de los vapores del fósforo
blanco al oxígeno que emite una luz
pálida y que ha dado nombre a este
elemento.
Una reacción ampliamente utilizada
en química forense es la oxidación de
luminol con agua oxigenada en
presencia de un catalizador de
hierro. Esta reacción se utiliza por
ejemplo en la detección de restos de
sangre que sirve en este caso para
catalizarla
31.
32. SEMEJANZAS
Sus moléculas de analito dan una especie
cuyo espectro de emisión suministra
información para un análisis cualitativo
Sus métodos de análisis se conocen como
luminiscentes
Emiten luz