¿Qué es la microscopía por fluorescencia? La microscopia básica se basa en teñir mediante colorantes los componentes celulares que normalmente son incoloros y no se pueden distinguir al microscopio. Entonces mediante el contraste se permite distinguir las estructuras para su estudio. La microscopía de fluorescencia tomó esta idea fundamental y la modifico para su propio uso. Entonces decidieron suplantar colorantes comunes por tintes fluorescentes que son moléculas capaces de absorber la luz en una longitud de onda específica. Para posteriormente con cierto tiempo de retraso emitir o reflectar su propia luz en una longitud de onda más larga de la que recibió. El retraso entre la absorción y la emisión es realmente insignificante, ya que hablamos de nanos segundos. A estos tintes que poseen esta capacidad se les conoce como fluorocromos o fluoróforos. (Tovar, 2016) La fluorescencia refiere al proceso mediante el cual un espécimen absorbe y subsecuentemente irradia luz, en un intervalo de tiempo (entre la absorción de la luz de excitación y la emisión de la luz fluorescente) que es usualmente de pocos nanosegundos. (Pietrasanta & Bilderling, 2011) La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia, propiedad de ciertos elementos químicos denominados fluorocromos o fluoróforos. El fluorocromo es utilizado como un marcador colorante fluorescente para crear contraste en zonas determinadas de elementos de interés (desde simples moléculas hasta microorganismos). El fluoróforo es una parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que tiene propiedad de fluorescencia, i.e. que absorbe fotones con longitudes de onda cortas y emite fotones con mayores longitudes onda. La Figura 1 muestra el espectro de absorción de una substancia fluorescente y su respectivo espectro de emisión que está desplazado a mayores longitudes de onda. (Ormachea & Villazón, 2017) Fundamentos de la microscopia de fluorescencia CONSTITUCION FUNDAMENTAL: Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta. Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos: *El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente. *El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecc

1. Practica 1.
Presenta:
 Colmenares Ocaña Itzel Montserrat.
5° semestre grupo “b”
Profesor: Luis Humberto Rosales
Furukawa

2. Contenido
¿Qué es la microscopía por fluorescencia?................................................................................. 3
Fundamentos de la microscopia de fluorescencia...................................................................... 3
Partes y funcionamiento del microscopio de fluorescencia....................................................... 5
¿Cuáles son los tipos y las características de las muestras en la que se utiliza este tipo de
microscopía?..................................................................................................................................... 6
¿Qué técnicas de preparación y tinción se necesita realizar a la muestra para poder ser
observada por este tipo de microscopía?..................................................................................... 7
Fundamento, ventajas, variantes y uso de la técnica de inmunofluorescencia...................... 8
Fundamento de la tinción auramina-rodamina (AR),.................................................................. 9

3. ¿Qué es la microscopía por fluorescencia?
La microscopia básica se basa en teñir mediante colorantes los componentes celulares que
normalmente son incoloros y no se pueden distinguir al microscopio. Entonces mediante el
contraste se permite distinguir las estructuras para su estudio. La microscopía de
fluorescencia tomó esta idea fundamental y la modifico para su propio uso.
Entonces decidieron suplantar colorantes comunes por tintes fluorescentes que son
moléculas capaces de absorber la luz en una longitud de onda específica. Para
posteriormente con cierto tiempo de retraso emitir o reflectar su propia luz en una longitud
de onda más larga de la que recibió. El retraso entre la absorción y la emisión es realmente
insignificante, ya que hablamos de nanos segundos. A estos tintes que poseen esta
capacidad se les conoce como fluorocromos o fluoróforos. (Tovar, 2016)
La fluorescencia refiere al proceso mediante el cual un espécimen absorbe y
subsecuentemente irradia luz, en un intervalo de tiempo (entre la absorción de la luz de
excitación y la emisión de la luz fluorescente) que es usualmente de pocos nanosegundos.
(Pietrasanta & Bilderling, 2011)
La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia, propiedad de ciertos elementos
químicos denominados fluorocromos o fluoróforos. El fluorocromo es utilizado como un
marcador colorante fluorescente para crear contraste en zonas determinadas de elementos
de interés (desde simples moléculas hasta microorganismos). El fluoróforo es una parte de
una molécula (fluorocromo, proteína) que tiene propiedad de fluorescencia, i.e. que absorbe
fotones con longitudes de onda cortas y emite fotones con mayores longitudes onda. La
Figura 1 muestra el espectro de absorción de una substancia fluorescente y su respectivo
espectro de emisión que está desplazado a mayores longitudes de onda. (Ormachea &
Villazón, 2017)
Fundamentos de la microscopia de fluorescencia
CONSTITUCION FUNDAMENTAL:
Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad
de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la
preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común

4. Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.
Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando
pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número
de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos:
*El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de
ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea
alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían
ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta
completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de
onda de emisión del fluorocromo.
*Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.
Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada
y la longitud de onda más larga lo atraviesa.
FUNDAMENTO FISICO
La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro
excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda
deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente
del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan
y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta
luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático
y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia
de la radiación de excitación. Ejemplo:
1. Primer filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En
el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)
2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras.
En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz
incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando
pasar la luz verde emitida por el fluorocromo.
3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda
fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. Entre
otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos:
 El largo de onda de la fluorescencia (emisión) es generalmente más largo
que el largo de onda de la luz excitadora
 Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz.
Por lo tanto, la energía de la fluorescencia es más baja que la luz absorbida.
 La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de
la luz de excitación

5.  La fluorescencia se desvanece.
 Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico. (Díaz,
2019)
Partes y funcionamiento del microscopio de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia es una variación de luz ultravioleta en que los
objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.
Oculares: Son los sistemas de lentes más cercanos a la mira del observador.
Objetivos: Son las lentes que se regulan mediante el revólver.
El revólver: Es una pieza giratoria en la que se enroscan los objetivos.
Condensador: Es un sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y
los concentra en la muestra proporcionando mayor o menor contraste.
Diafragma: También conocido como iris, se encuentra sobre el reflector de la luz.
A través de este se puede regular la intensidad de la luz abriéndolo o cerrándolo.
El pie: Constituye la base del microscopio y su apoyo principal.
La platina: La platina es la pieza metálica plana en la que se coloca la muestra a
observar. Tiene un orificio en el eje óptico del tubo que permite que pase el rayo de
luz en dirección a la muestra.
El tornillo macrométrico: Hace que el tubo del microscopio se
deslice verticalmente gracias a un sistema de cremallera. Estos movimientos
permiten que se enfoque rápidamente la preparación.
El tornillo micrométrico: Este mecanismo ayuda a enfocar la muestra con un
enfoque exacto y nítido a través del movimiento casi imperceptible de la platina.
Cabezal de observación: Contiene los sistemas de lentes oculares.
Anillo de compensación: Corrige la diferencia de la potencia visual entre el ojo
izquierdo y el derecho, para así poder contemplar infatigablemente una imagen clara
y nítida con ambos ojos.
Diafragma de apertura: Un diafragma de apertura limita la iluminación.
Diafragma de campo: Un diafragma de campo limita el tamaño angular del haz.
(Lynch, 1997)
Como hemos visto el microscopio de fluorescencia es básicamente un microscopio
óptico modificado. Por lo que estructuralmente posee los mismos elementos
básicos, entonces, a continuación, mencionaremos aquellos que han sido
agregados o modificados. Los cuales son los siguientes:

6. Fluorocromos ó Tintes fluorescentes: Son compuestos químicos fluorescentes
típicamente algunos grupos aromáticos combinados a moléculas planas o cíclicas.
Los cuales poseen la capacidad de emitir luz tras la excitación por luz, han sido
creados en muchísimas versiones. Generalmente se modifican para que se unan a
la molécula biológica de interés en el estudio.
Fuente de luz: La luz que se emplea en este microscopio es de ciertos tipos
específicos para lograr la correcta absorción y posterior excitación del fluorocromo.
Entonces podemos mencionar cuatro tipos que son los más empleados. Se
encuentran incluidas la luz LED, lámparas de arcón de xenón, láseres y lámpara de
vapor de mercurio.
Filtro de excitación: Es un filtro de banda que
solo permite el paso de las longitudes de onda
específicas que son absorbidas por el
fluorocromo. Minimizando y evitando la
excitación por otras fuentes fluorescentes.
Espejo dicroico: Es un segundo filtro un poco
más específico, es de tipo color que se emplea
para pasar luz de forma selecta en una precisa
gama de colores.
Filtro de emisiones: Es un tercer filtro ya no
direccionado a la luz de incidencia si no a la de
emisión de la muestra. Es un filtro de banda
que solo permite el paso de las longitudes
especificas emitidas por el tinte fluorescente.
Bloqueando así toda luz no deseada,
especialmente la luz de excitación. Así se
garantiza una obtención de fluorescencia clara
con fondo oscuro. (Tovar, 2016)
¿Cuáles son los tipos y las características de las muestras en
la que se utiliza este tipo de microscopía?
Las muestras pueden ser células vivas o las células fijas muertas que mantienen su
estructura celular, con la preparación de la célula difiriendo entre los dos.
Prácticamente va a evidenciar tanto los gérmenes vivos como los muertos y va a
requerir solamente de pequeñas cantidades de antígeno. La microscopía de
fluorescencia permite determinar la distribución de una sola especie de molécula,
su cantidad y su ubicación dentro de una célula. Además, se pueden realizar
estudios de colocalización e interacción, y se pueden observar concentraciones de
iones, así como procesos intracelulares e intercelulares como la endocitosis y la
exocitosis.

7. Es decir, se puede visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo,
vacuolas, retículo endoplásmico, etc.
Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular, cambios en el potencial
de membrana, endocitosis y exocitosis.
Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc.
Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no se resolverían.
¿Qué técnicas de preparación y tinción se necesita realizar a
la muestra para poder ser observada por este tipo de
microscopía?
Una técnica usada para las muestras de células fijas es la inmunofluorescencia
que utiliza las capacidades requeridas específicas de pruebas a su
resistente. Unos requisitos específicos, llamados unos requisitos primarios, atará a
la proteína determinada que es determinada. Hay dos variantes de la
inmunofluorescencia:
1. Inmunofluorescencia directa (en cuál está limitado el grado directamente
primario a un fluoróforo).
2. Inmunofluorescencia indirecta (en cuál ata los títulos primarios a un título
secundario fluorescente, que emite la luz y determina la situación de la
proteína).
La inmunofluorescencia directa es más rápida que la versión indirecta del método
pues los pasos indirectos del lavado y de la incubación no se requieren. Sin
embargo, el método indirecto ofrece más adaptabilidad mientras que los
seleccionados secundarios fluorescentes se pueden combinar con diversos
estudios primarios. La inmunofluorescencia no se puede utilizar en proyección de
imagen de la vivo-célula y es reservada con la necesidad de encontrar las pruebas
que confirman la proteína del interés.
La fijación de la muestra tiene que ocurrir primero de modo que la muestra
apareció tan cerca como sea posible a una muestra viva sin la baja de proteínas,
de lípidos o de otras moléculas. La fijación de la interconexión es una técnica en la
cual los grupos del aldehído reticulan las moléculas dentro de la célula, aunque
ésta puede impedir el atascamiento del endurecimiento. Los disolventes orgánicos
tales como metanol o acetona se pueden también utilizar para reparar las
proteínas a sus contextos celulares. La estructura de la célula se mantiene, sin
embargo, algunos disolventes pueden destruir el epítopo de un resistente. El
método de fijación tiene que ser específico al requisito elegido, donde un equilibrio
entre la buena debe y la capacidad obligatoria se encuentra.

8. Tambien una de las tinciones que se utiliza es la tinción de auramina-
rodamina (AR), también conocido como el Tinción de auramina-RHODAMINA
ausentismo, es un histológicas técnica utilizada para visualizar los
bacilos utilizando Microscopía de fluorescencia, en particular las especies en
el Mycobacterium Género.
Técnica
1. Extensión
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir la preparación con el colorante auramina-rodamina
previamente filtrado. Mantenerlo así durante 15 min. No hay que calentar.
5. Lavar con agua destilada.
6. Decoloración con alcohol -HCl. Cubrir la preparación con el decolorante y
dejar actuar de 3 a 4 minutos.
7. Lavar con agua destilada.
8. Añadir permanganato potásico al 0,5% en agua destilada y dejar actuar de
2 a 4 minutos. El permanganato se utiliza para eliminar la fluorescencia
residual de los desechos de fondo. Pero debe evitarse el tratamiento
excesivo con el contra colorante porque puede rebajar la intensidad
fluorescente de los bacilos coloreados.
9. Lavar con agua destilada.
10.Secar al aire y observar con el microscopio de fluorescencia. El agudo
contraste entre las micobacterias coloreadas brillantemente y el fondo
oscuro ofrece las grandes ventajas de una fácil, rápida y completa
observación.
Puede usarse un objetivo de 25X (100X en la tinción de Ziehl-Neelsen y
similares), para observar el frotis, lo que permite la inspección de un área
extensa en poco tiempo. Otras ventajas son el mejor contraste, el mínimo
esfuerzo visual y la relativa falta de Importancia de la agudeza para el color
del observador.
Fundamento, ventajas, variantes y uso de la técnica de
inmunofluorescencia
El fundamento de la técnica radica en la capacidad que muestran algunos
elementos o compuestos fluorescentes, denominados fluorocromos, en fijarse a
los anticuerpos mediante un enlace químico estable que no puede romperse
durante el curso de la reacción inmunológica. Se encuentran diversos ejemplos de
fluorocromos naturales, como algunas vitaminas, esteroides, porfirinas, etc. Otros
compuestos que fluorescen –rodamina, auramina, fluoresceína, colorantes de
acridina– se utilizan en distintas técnicas de tinción, como la tinción de

9. microorganismos ácido-resistentes con auraminarodamina en muestras de tejido y
esputo.
La inmunofluorescencia conjuga la observación de la morfología con la
especificidad inmunológica, evidencia tanto los gérmenes vivos como los muertos
y requiere solamente de pequeñas cantidades de antígeno (Ag), lo que permite
evidenciar cantidades mínimas de Ag aun en un medio complejo de gérmenes no
cultivables, así como investigar anticuerpos (Ac) con Ag difíciles de preparar.
Además, empleando la técnica se pueden revelar Ac llamados incompletos, que
no precipitan, no aglutinan y no fijan el complemento. La inmunofluorescencia
permite identificar un Ag con la ayuda de un inmunosuero conocido e investigar y
titular un Ac con la ayuda de un Ag conocido.
Existen dos formas principales de inmunofluorescencia: directa e indirecta. En la
variante directa el Ag se fija directamente a un Ac homólogo conjugado
previamente con un fitocromo. Por tanto, se requieren antisueros marcados para
cada bacteria [Klement et al., 1990], lo que hace que el método, aunque es más
especifico, hoy sea menos utilizado.
Con la inmunofluorescencia indirecta (IFI) se logra poner en función un único
antisuero marcado, común para cualquier Ag bacteriano que se logra mediante la
inmunización de una cabra u oveja, con la inmunoglobulina de un conejo sano, de
donde se obtiene un complejo inmunológico de Ac anti-inmunoglobulina de conejo.
Este complejo se marca con fitocromo (FITC) y puede reaccionar por tanto con
cualquier Ac de conejo como si se tratase de un Ag.
La observación al microscopio de fluorescencia puede efectuarse sobre un
portaobjeto diseñado especialmente para esta técnica o bien sobre una membrana
de 0,2 µm sobre la cual se ha fijado la bacteria y que se coloca en un portaobjeto
común que sirve de soporte [Brlansky, 1990].
También se conoce el método de la inmunofluorescencia de tinción de colonias
para la detección sensible y cuantitativa de bacterias cultivables. Está basado en
una combinación de aislamiento en placas con serología para el reconocimiento
de colonias específicas. Los antisueros empleados por esta técnica son marcados
por lo general con fluorocromo, lo que permite la identificación de las colonias
específicas a través de la observación en un microscopio de fluorescencia.
Fundamento de la tinción auramina-rodamina (AR),
Es una tinción muy usada para micobacterias, cuando el volumen de muestras a
examinar es elevado. Se fundamenta en la afinidad que poseen los ácidos
micólicos de la pared celular de las micobacterias por los colorantes fluorescentes
o fluorocromos Auramina y Rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias
que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo oscuro.

10. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramina es que luego los frotis
pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente
sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión.
Bibliografía
Díaz, J. B. (junio de 2019). Slideshare. Obtenido de
https://es.slideshare.net/camilayfranco/microscopia-de-fluorescencia-178365475
Lynch, R. J. (1997). Métodos de laboratorio. México: Nueva Editorial Interamericana.
Ormachea, O., & Villazón, A. (2017). DESARROLLO DE UN MICROSCOPIO DE EPIFLUORESCENCIA DE
BAJO COSTO. Bolivia: upb.
Pietrasanta, L., & Bilderling, C. v. (2011). Tópicos en Biofísica Molecular. Obtenido de
http://users.df.uba.ar/catalina/TBM/TBM_labo3.pdf
Tovar, D. (2016). materialesdelaboratoriohoy.us. Obtenido de
https://materialesdelaboratoriohoy.us/quimica/microscopio-de-fluorescencia/
Yuliet, F. C. (2005). "LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y SU APLICACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO".
Fitosanidad, 65-68.