informativo

1. Astra
En esta revisión se describe el estado actual de las técnicas de manipulación genética y
métodos de transformación para especies del género Aspergilo. Se describen en detalle las
cepas huésped, los marcadores selectivos y los materiales experimentales necesarios para la
manipulación genética y la transformación fúngica. Además, se describen las ventajas y
desventajas de estas técnicas.
Introducción
Especies del género Aspergilo están ampliamente distribuidos en ambientes naturales y tienen
varios efectos en los humanos, sirven como fábricas que producen los ácidos orgánicos y las
enzimas que se requieren para diversas industrias. Para la industria alimentaria, los hongos
generalmente reconocidos como seguros se utilizan en la preparación de alimentos
fermentados tradicionales. A pesar de Aspergilo especies tienen efectos perjudiciales para los
humanos, estas especies también son beneficiosas para las industrias alimentaria y
farmacéutica. infectan los cultivos agrícolas durante las etapas de cosecha o poscosecha, y
estropean los cultivos o producen en ellos metabolitos secundarios perjudiciales, llamados
micotoxinas, causando contaminación. Hasta la fecha se han identificado más de 300 especies,
de las cuales varias cepas también tienen efectos perjudiciales o beneficiosos para los
humanos. Por ejemplo, Aspergillus fumigatus y otros patógenos humanos, Algunas especies
causan aspergilosis, incluida la aspergilosis invasiva, la aspergilosis pulmonar crónica y la
aspergilosis broncopulmonar alérgica. Muchos investigadores están investigando el desarrollo
de nuevas cepas de hongos, sistemas de expresión heterólogos y nuevos metabolitos
secundarios mediante técnicas avanzadas de manipulación genética debido a la utilidad de
estos hongos Uno de los puntos más importantes de todo el experimento
2.cepaz huésped y marcadores selectivos:
es la selección de una cepa huésped y
un gen marcador selectivo adecuado para los métodos de
manipulación genética. Las cepas huésped apropiadas y los
marcadores selectivos son esenciales para reducir la
probabilidad de transformantes falsos positivos y obtener un
producto final de alto rendimiento.
2.1 Cepas hospedadoras de hongos: Las cepas silvestres pueden usarse para ingeniería
genética en algunas especies de hongos porque la información del genoma está disponible. Por
ejemplo, las cepas deficientes en proteasa se utilizan generalmente en sistemas de expresión
de proteínas heterólogas. El elemento más importante a considerar al seleccionar cepas
huésped es qué el marcador selectivo auxotrófico, excepto los marcadores resistentes a
medicamentos, se utiliza en la ingeniería genética. Sin embargo, las cepas modificadas
generalmente se utilizan para aumentar la eficiencia de los ensayos y experimentos. Se
informó que la frecuencia de integración homóloga aumentó en mutación deficiente en la
mayoría de los hongos filamentosos Esto se debe a que se deben utilizar cepas huésped con de

2. elecciones genéticas específicas cuando se utiliza un marcador selectivo auxotrófico en
ingeniería genética.
2.2 Genes marcadores selectivos: Los genes de resistencia a fármacos (antibióticos)se utilizan
generalmente como marcadores de selección dominantes que no son necesarios para cepas
huéspedespeciales.38]. 2.2. Genes marcadores selectivos En especies deAspergilo,2
marcadores selectivos, marcadores de resistencia a medicamentos y marcadores
auxotróficos se utilizan ampliamente para experimentos de ingeniería genética, El gen
marcador más comúnmente utilizado es un gen de resistencia a la higromicina, que puede
usarse en la mayoría delos hongos filamentosos, incluidos A. fumigases, nidulans. Si uno de
los Aspergilo especie es susceptible a un antibiótico, puede usarse ampliamente en cualquier
especie es resistente a la higromicina y no puede usarse para transformación. Sin embargo,
A. En lugar de higromicina, se han utilizado genes de resistencia a fleomicina y piritiamina
para A. flavus transformación
3. Métodos de transformación fúngica. A diferencia de las bacterias o las cepas de levadura,
la eficiencia de transformación es baja en los hongos filamentosos y, por lo tanto, el proceso
de transformación se considera un cuello de botella en la ingeniería genética.21,49].
Nidulansy A. Asimismo, especies de Aspergilo contienen una pared celular rígida, que es el
principal obstáculo para aumentar la eficiencia de la transformación. Por lo tanto, el proceso
y las estrategias para estos tres métodos se analizarán a continuación. Actualmente se han
desarrollado varios métodos de transformación para Aspergilos especies incluida la
transformación mediada por polietilenglicol (PEG) Agrobacterium- (PMT), mediado La
transformación (AMT) y la electroporación (EP) se utilizan principalmente y Sólo se han
realizado unos pocos estudios mediante el sistema de transformación biolística(BT)
3.1 Transformación mediada por PEG
Entre los diversos métodos de transformación, PMT es el método más utilizado con especies
de Aspergilo. La PMT se exploró principalmente en levaduras. El procedimiento PMT
simplemente implica cultivo de hongos, preparación de protoplastos a través de
degradación de la pared celular, entrega de ADN a través de incubación de PEG,
regeneración transformante y selección. Los protoplastos son células a las que se les ha
quitado la pared celular y se utilizan principalmente como células receptoras de PMT.56]. El
proceso de generación de protoplastos es un paso clave en PMT.
3.3. Electroporación
EP es un método altamente eficiente para introducir ADN
exógeno en una célula mediante la aplicación de un pulso
eléctrico de alto voltaje. EP se utilizó por primera vez en A.
nidulans, y en este momento, los protoplastos se están
utilizando para células receptoras de ADN exógeno. Para
aumentar la eficiencia y reducir el tiempo eliminando el
proceso de preparación de protoplastos, Además, se deben optimizar

3. varios factores, incluida la intensidad del campo eléctrico,
la condición del pulso, la concentración de ADN y la
composición del buffer. Aunque EP es un método
simple y conveniente en comparación con otros métodos
de transformación, se requiere instrumentación costosa
para EP. Actualmente, los investigadores rara
vez utilizan la EP para estudios de hongos.
4. Herramientas de manipulación genética : La manipulación genética de hongos
filamentosos ha sido fundamental para comprender la biología de los hongos y desarrollar
especies de hongos para las industrias. De estos métodos, dos herramientas de edición del
genoma, como la selección de genes mediada por recombinación homóloga (HR) y la edición
del genoma CRISPR/Cas9, se utilizan comúnmente en la investigación de hongos y se
analizarán a continuación En particular, la identificación y producción de nuevos metabolitos
fúngicos mediante manipulación genética se ha utilizado en los campos farmacéutico e
industrial.
4.1. orientación genética medida por hr: Este método se puede utilizar en muchas
investigaciones sobre especies de Aspergilo debido a la alta eficiencia de transformación de
cepa deficiente, la fácil producción de productos basados en PCR y la optimización de
métodos de transformación y marcadores selectivos. El sistema de marcadores divididos
requiere 2 productos de ADN que contienen fragmentos superpuestos de un marcador
selectivo como. Orientación genética mediada por HR La selección de genes mediada por HR
es una herramienta poderosa y se utiliza con mayor frecuencia para eliminar genes de
interés, insertar etiquetas de epítopos y reemplazar promotores en especies de Aspergilio.
Especialmente, la construcción de casetes basada en PCR para HR tiene la ventaja de acortar
el tiempo de clonación y aumentar la eficiencia de la transformación que la clonación
mediante el método basado en vectores. Para generar el producto de PCR para HR, se
utilizan principalmente dos sistemas, como los sistemas de PCR demarcador dividido y de
fusión (o conjunto).55,85] (Figura 2(A)). El sistema de PCR de fusión generalmente requiere 3
productos de PCR, 2 fragmentos para el HR en el ADN genómico que descama una región de
selección y el otro para un marcador selectivo con o sin las etiquetas o el promotor
reemplazable. Estos 3 fragmentos se fusionan mediante PCR conjunta generando un casete
lineal adecuado para la transformación. Los casetes de PCR lineal elaborados con el método
de PCR de fusión generalmente se introducen mediante métodos PMT en las células fúngicas
receptoras, principalmente kucepas deficientes. Se introducen dos fragmentos de ADN en las
cepas receptoras y luego estos productos reemplazan el gen de interés a través delos
eventos de recursos humanos
4.2. El sistema CRISPR/Cas: Fue descubierto en organismos procarióticos para un sistema
inmunológico adaptativo contra elementos extraños y se ha desarrollado un útil sistema de
edición del genoma para la mayoría de los sistemas eucariotas.92,93]. CRISPR-Sistema Cas
En los últimos años, se ha desarrollado y utilizado ampliamente en casi todos los sistemas
eucariotas la edición del genoma utilizando nucleasas bacterianas o genéticamente

4. modificadas, como las nucleasas de zinc, las nucleasas efectoras tipo activador de la
transcripción y las nucleasas asociadas a CRISPR-Cas. Aunque estas nucleasas también se
utilizan en hongos filamentosos, el sistema CRISPR-Cas es el más utilizado en muchos hongos
filamentosos
Conclusión
Especies del género Aspergilo Han sido hongos de gran importancia debido a sus efectos
beneficiosos y perjudiciales para el ser humano estas . Especies de Aspergilo pueden
producir diversas enzimas y ácidos orgánicos, considerándolos como fábricas de células.
Estudios recientes informaron que especies de Aspergilo Puede descomponer plásticos y
contaminantes, por lo que estos hongos pueden utilizarse para el ámbito medio ambiental.
Además, gracias al desarrollo de la ingeniería genética y la biología sistémica, muchos
investigadores buscaron utilizar hongos filamentosos como fábricas de células. Desarrollar
Aspergilo Como fábricas de células, actualmente, la selección de genes mediada por PMT y
HR se utilizan principalmente en ingeniería genética. A diferencia de las bacterias o las
levaduras, los métodos de edición de genes disponibles y la eficiencia de transformación son
bajos, pero los hongos filamentosos siguen siendo fábricas de células atractivas para la
industria. Por tanto, es necesario desarrollar un método de transformación más eficiente y
un sistema de manipulación genética.