Diagnóstico molecular en micología

1. MASTER EN ANÁLISIS CLÍNICOS (CEMP) FECHA:20/03/2023
TRABAJO: Actividad Final de Módulo 8 ALUMNO: Jesús González Pérez Salazar
MICOLOGÍA: Fundamentos, utilidad y limitaciones de las técnicas de diagnóstico molecular de las enfermedades micóticas.
Antecedentes
Las células micóticas son eucariotas, con membrana nuclear y organelos celulares propios de este
tipo de células. Las hay unicelulares como las levaduras o pluricelulares como los mohos cuyas hifas
forman micelios. Algunas especies de hongos son dimórficos, que en función de las condiciones
ambientales pueden adoptar características de levadura o de hongo filamentoso. Su genoma de
ADN es de tamaño muy variable, así como variables son sus estructuras reproductivas.
Se distinguen de otros eucariotas por la presencia de una pared celular rígida, que en su mayoría
está formada por quitina, glucano y en algunas especies por manano y porque su membrana celular
contiene ergosterol como principal lípido esteroideo.
Se conocen más de 90,000 especies de hongos, aunque menos de 200 se han identificado como
patógenas para humanos. Las características anteriormente descritas son herramientas útiles para
su identificación, tanto microscópica, como bioquímica y de cultivo, pero pueden ser insuficientes
para identificar más allá del género.
El tiempo de identificación de los hongos es otro factor a considerar. Algunas cepas son de
crecimiento rápido, pero la mayoría requiere de tiempos de cultivo medianamente prolongados.
Todo lo anterior, lleva a la necesidad de mejorar y acelerar las técnicas diagnósticas utilizando
metodologías modernas de diagnóstico molecular (Ryan K., 2017)
A continuación se analizan las principales técnicas moleculares y su utilidad en micología.

2. Metodología
y descripción
Utilidad en
micología
Ventajas Desventajas o limitaciones Diagrama del procedimiento
PCR
Convencional
o de punto
final
Identificación de
ADN libre en sangre
de Aspergillus spp y
confirmación de
cepas de cultivo de
Alternaria, Fusarium
y Trchosporon
Metodología de complejidad
moderada, aunque muy
estandarizada y de relativamente
fácil implementación, cuyos costos
han disminuido con el tiempo.
Proceso razonablemente rápido y
sensible.
Requiere instrumental sofisticado. los
especímenes a estudiar para patologías
fúngicas, suelen tener muy poco DNA,
disminuyendo su sensibilidad diagnóstica
y la técnica es muy sensible a la
contaminación.
PCR anidada
Implica dos
rondas de
amplificación
Para identificación
de S. schenckii,
especies de Candida
y Cryptococcus
La 2a amplificación utiliza
cebadores más específicos que
incrementan sensibilidad y
especificidad.
Toma más tiempo que la PCR
convencional y requiere equipamiento y
reactivos costosos.
PCR
múltiplex Pcr
de punto
final para
identificar
múltiples
objetivos
moleculares
Identificación de
Aspergillus ssp,
Rhizopus ssp y en la
identificación y
diferenciación de
aalgunas especies
de Candida
Técnica que permite la detección e
identificación simultánea de genes
de distintos agentes etiológicos de
interés, lo que ahorra tiempo y
dinero.
Especificidad y sensibilidad más baja que
la PCR convencional. Las longitudes de
los amplicones deben ser
suficientemente diferentes para que las
bandas sean distinguibles. La secuencia
del procedimiento y los cebadores deben
ser adecuados para que los amplicones y
su concentración sean los correctos. La
identificación suele limitarse al género.
PCR in situ
FISH / CISH
Hibridación
de sondas
específicas de
ADN con
revelado
cromógeno o
fluorescente
Identificación de
Aspergillus spp en
muestras de tejido
así como en la
identificación de
especies de
Fusarium y
Scedosporium
Es una potente herramienta para
localizar objetivos de ácidos
nucleicos específicos en células y
tejidos previamente fijados y que
pueden ser de diversas especies.
Los resultados se obtienen en
corto tiempo porque se practica
sobre la muestra directa.
Hay que tener precaución para evitar
contaminación cruzada con el
instrumental y espacios donde se
procesan las muestras histológicas.
También se debe tener precaución con el
tiempo de fijación de los tejidos con
formol. La fijación del tejido puede
producir ruptura del ADN, que impediría
su amplificación. Técnica que requiere
personal especializado.

3. Metodología
y descripción
Utilidad en
micología
Ventajas Desventajas o limitaciones Diagrama del procedimiento
AFLP PCR ADN
Amplificación
de poli-
morfismos de
longitud de
fragmentos
Para realizar
análisis
filogenético y
comparación de
fingerprints de
genómas fúngicos
en epidemiología
Técnica de fingerprinting, muy
específica para el análisis de la
variación genética
Se utiliza equipo costoso y personal
altamente especializado. Requiere
grandes cantidades de ADN. Sensible a la
concentración de Mg. Laborioso proceso
de hibridación. Los resultados toman
tiempo porque implica elaborar una PCR
y análisis de resultados por electroforesis
SSCP PCR ADN
Amplificación
de poli-
morfismos de
conformación
de cadena
simple
Para identificar
especies y
resistencias a
antifúngicos de los
complejos de A.
fumigatus y
S. apiospermum
Técnica de fingerprinting, muy
específica para el rastreo de
mutaciones puntuales
Se utiliza equipo costoso y personal
altamente especializado. Requiere
grandes cantidades de ADN. Sensible a la
concentración de Mg. Laborioso proceso
de hibridación. Los resultados toman
tiempo porque implica elaborar una PCR
y análisis de resultados por electroforesis
WGS
Secuenciació
n completa
del genoma
En identificación de
especies de hongos
relacionados a la
enfermedad de
Crohn
Es una metodología con mucho
potencial diagnóstico, muy
sensible y específica. Útil para
estudios epidemiológicos de las
enfermedades micóticas
Técnica costosa y compleja. Por el tiempo
de obtención de resultados es un
método aún inviable para el laboratorio
de micología, tanto para el servicio de
emergencias como el de rutina
qPCR o
RT-PCR
Reacción en
cadena de la
polimerasa
cuantitativa,
en tiempo
real
Cuantificación de
ADN de
Aspergillus spp en
Aspergilosis
invasiva y en la
identificación de
algunas especies
del género Candida
Técnica cuantitativa, con alta
especificidad y sensibilidad
analíticas por los amplios rangos
dinámicos de límite de detección.
Es menos susceptible a inhibidores
como el formol utilizado para fijar
tejidos y los resultados se obtienen
más rápido que con las pruebas
PCR panfúngicas de punto final,
que suelen requerir técnicas de
revelado adicional
La presencia de mutaciones en las
regiones de los cebadores y sondas,
pueden derivar en resultados falsos
negativos en la identificación del
patógeno. Requiere equipo complejo y
personal altamente especializado

4. Metodología
y descripción
Utilidad en
micología
Ventajas Desventajas o limitaciones Diagrama del procedimiento
LAMP
Amplificación
isotérmica
mediada por
bucle
Se empieza a usar
para identificación
de Aspergillus en
humanos. La amplia
experiencia en el
diagnóstico fúngico
en el ámbito
fitosanitario, puede
extrapolarse al
“Point of care”
Tiene mayor sensibilidad y
especificidad que la PCR
convencional, por el uso de más
pares de cebadores. Los resultados
se obtienen en menor tiempo
porque no se requiere
desnaturalizar el ADN. Utiliza
equipo simple de bajo costo, que
puede ser portátil. La lectura
puede hacerse visualmente
El diseño de los cebadores es mucho más
complejo y requiere análisis y programa
informático especializado. La polimerasa
utilizada no es tan temoestable y se
puede inactivar con pequeñas
variaciones de temperatura. No es 100 %
eficiente y puede presentar ruido de
fondo. Técnica menos conocida que
compite con la PCR convencional y RT-
PCR que tienen mucha aceptación
RCA
Amplificación
isotérmica en
círculo
rodante
Se ha utilizado con
éxito en la
identificación de
especies de hongos
Mucorales Rhizopus,
Rhizomucor y
Mucor y de generos
Cryptococcus y
Exophiala
Por la polimerasa utilizada, permite
una gran amplificación del objetivo
y es resistente a contaminantes.
Los resultados se obtienen en
menor tiempo porque no se
requiere desnaturalizar el ADN.
Utiliza equipo simple de bajo costo,
que puede ser portátil. La lectura
puede hacerse visualmente
No es 100 % eficiente y puede presentar
ruido de fondo por la aparición de
productos inespecíficos, probablemente
por cebado falso en sitios donde se
forman dímeros del cebador. Técnica
menos conocida que compite con la PCR
convencional y RT-PCR que tienen mucha
aceptación.
NASBA
Amplificación
isotérmica
basada en
secuencia de
ácidos
nucleicos
Su utilización se ha
concentrado en
estudios
bacteriológicos,
pero su potencial es
alto para análisis
genómicos
Permite la amplificación de ARN, lo
que incrementa su sensibilidad, por
la ubicuidad de este ácido nucleico.
Los resultados se obtienen en
menor tiempo. Utiliza equipo
simple de bajo costo, que puede
ser portátil. La lectura puede
hacerse visualmente
Técnica mas costosa por requerir tres
enzimas diferentes. Susceptible a falsos
positivos que requerirían métodos de
comprobación adicional. Técnica menos
conocida que compite con la PCR
convencional y RT-PCR que tienen mucha
aceptación
(Jiménez-Moraleda B., et al., 2021; Refojo N, 2021; Unda F., Agüero J., Fariñas M.C., Martínez-Martínez L., 2011; Ryan K., 2017)

5. Conclusión
La elección de la técnica dependerá de factores como la rapidez, la complejidad, la capacidad de discriminación, la reproducibilidad, el
coste de la metodología y la facilidad de la interpretación de resultados, que puedan ser cuantitativos y sin necesidad de
procesamiento posterior. Se debe tener en consideración la sensibilidad, que permita el análisis de muestras de procedencia diversa,
ya sea de cultivo puro o directamente de la lesión, de muestras líquidas o de tejido sólido, con células vivas o inviables, con o sin
tratamiento previo. La mayoría de las técnicas moleculares panfúngicas se basan en la amplificación e identificación de las secuencias
de ADNr, región repetitiva que codifica para los ARN ribosomales, comprendida por los genes 18s, 5.8s y 28s y los ITS 1 y 2 (18s-ITS1-
5.8s-ITS2-28s). La secuenciación del ITS2 no permite identificar todas las especies ya que es un gen pequeño de escasa variabilidad,
por lo que muchas veces sólo permite la identificación a nivel de género, sección o complejo. Refojo (2021), reporta algunas
reacciones cruzadas en técnicas panfúngicas y de qPCR entre los géneros Candida, Purpureocillium, Curvularia y Exophiala.
Para el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico molecular, hay otras características a considerar como el grado de especialización
requerido del personal, la sofisticación del equipo, su capacidad o volumen de análisis, el espacio e instalaciones necesarias y su
mantenimiento. Si el equipo es costoso, para que sea rentable deberá ser versátil y escalable para poder analizar otro tipo de
muestras y detectar amplio número de microorganismos. Las plataformas diagnósticas deben ofrecer posibilidad de identificar las
especies fúngicas, independientemente de si se encuentran en fase levaduriforme o filamentosa y poder demostrar la robustez del
método para conseguir las acreditaciones de los organismos reguladores internacionales (Wickes B., Wiederhold N.P., 2018).
Referencias bibliográficas
• Jiménez-Moraleda B., et al. (agosto 3, 2021). Diagnóstico y tipos de PCR. Revisión bibliográfica. Recuperado el 15 de marzo de 2023 de:
https://revistasanitariadeinvestigacion.com/diagnostico-y-tipos-de-pcr-revision-bibliografica/
• Refojo N., (2021). Diagnóstico molecular de la enfermedad fúngica invasora causada por hongos oportunistas. [Tesis de doctorado]. Universidad de Buenos Aires. Recuperado el 15 de
marzo de 2023 de: https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6833_Refojo.pdf
• Ryan K., et al., (2017). Hongos. Conceptos básicos. Access Medicina. (Ed.). En Sherris, Microbiología Médica (6ª Ed., pp 1-10). McGraw Hill Medical.
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookId=2169&sectionId=162985092#1143537556
• Unda F., Agüero J., Fariñas M.C., Martínez-Martínez L., (febrero 20, 2011). Identificación de hongos de importancia clínica mediante técnicas moleculares. Recuperado el 10 de marzo de
2023 de: https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-identificacion-hongos-importancia-clinica-mediante-S0213005X10005045
• Wickes B., Wiederhold N.P., (diciembre, 2018). Molecular diagnostics in medical mycology. Nat Commun. 3;9 (1):5135. Recuperado el 10 de marzo de 2023 de:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6277409/pdf/41467_2018_Article_7556.pdf