Tesis para optar por el Grados de MSc. Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá.

1. BIOTECNOLOGÍA ANIMALBIOTECNOLOGÍA ANIMAL
LCPA - 425LCPA - 425
Módulo. 6
Prof. Dr. Reinaldo de Armas PhD.

2. Módulo 6.Técnicas básicas en lasMódulo 6.Técnicas básicas en las
áreas de biología molecular yáreas de biología molecular y
biotecnologíabiotecnología
Técnicas de determinación de ADN y
ARN.
Reacción en cadena a la polimeraza.
Técnicas de aislamiento de colonias.
Técnicas de cultivo in vitro.

5. OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN POR RESTRICTASAS
(RFLP)
-El ADN de cualquier organismo puede ser cortado en fragmentos
(fragmentos de restricción) lo suficientemente pequeños para ser
analizados y manipulados, gracias a las restrictasas.
-Las restrictasas son endonucleasas que poseen muchas bacterias y
que tienen la propiedad de cortar el ADN extraño que penetra en la
célula. Lo cortan por sitios específicos llamados secuencias de
reconocimiento, formadas por cuatro u ocho pares de bases, que,
en la bacteria original, están protegidas para evitar que se destruya
su propio ADN.

6. -Estas enzimas 'tijeras biológicas' cortan el ADN de forma que en
cada extremo queda un trozo de hebra monocatenaria formada por
las bases de la secuencia de reconocimiento.
Estos extremos se llaman adherentes o cohesivos, ya que es por
ellos por donde se pueden unir a otros fragmentos de ADN cortados
por la misma enzima de restricción, al ser sus bases
complementarias.
-Los fragmentos así obtenidos se pueden separar para su estudio.

8. Técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa):
-Gracias a esta técnica se replican pequeños fragmentos de ADN 'in vitro', a
una velocidad mucho mayor que mediante la clonación molecular. (A título
anecdótico, se produce un ciclo cada 4 o 5 minutos, lo que supone
aproximadamente unos 100.000 millones de copias en una sola tarde...)
-El procedimiento PCR requiere conocer las secuencias de bases del
fragmento de ADN que se pretende replicar.
Con estas secuencias se deben sintetizar pequeñas cadenas
complementarias de ADN (de unos 20 nucleótidos), que actuarán como
cebador o primer para la ADN-polimerasa.

9. -En resumen, la técnica PCR se desarrolla así:
a) El fragmento de ADN a replicar se introduce en una disolución que
contiene ADN-pol.
b) Se añaden desoxirribonucleótidos en cantidad y las moléculas de
cebador sintetizadas.
c) Al calentar, se separan las hebras complementarias de los fragmentos
de ADN.
d) Si se enfría, se unen los cebadores a las hebras simples de
nucleótidos, lo cual es reconocido por la ADN-pol que comienza a añadir
nucleótidos formando la hebra complementaria.
e) Calentando y enfriando alternativamente la solución, se pueden
obtener millones de copias de ADN en períodos de tiempo cortos.

12. SECUENCIACIÓN DEL ADN
-Una de las técnicas más empleadas para la determinación de la
secuencia de nucleótidos de un ADN es la conocida 'técnica de
terminación de Singer (Nobel Química, 1980) o también llamada
'técnica del didexosi' (basada en la síntesis del ADN).
Se la califica así porque precisa de didesoxirribonucleótidos, que
no son más que nucleótidos que han perdido el grupo -OH del
carbono 3'.

13. Para llevar a cabo la secuenciación se necesita:
a)Una de las cadenas del fragmento de ADN que se quiere
secuenciar y que se utiliza como 'molde'.
b) Un cebador complementario del extremo de la cadena.
c) Los cuatro desoxirribonucleótidos correspondientes (dAMP, dTMP,
dCMP y dGMP).
d) Los cuatro 'didesoxis' (ddAMP, ddTMP, ddCMP y ddGMP).
-Supongamos que el fragmento que deseamos secuenciar y el
cebador son los siguientes:

14. Entonces, el proceso de secuenciación lo ejecutamos
así...
1) Iniciamos el proceso añadiendo dos componentes:
a)ADN pol, para que comience la polimerización en el cebador
b)un 'didesoxi', por ejemplo, ddCMP
2) La síntesis de la nueva hebra se detendrá cuando se incorpore el
ddCMP.
Esto indicará que, en la cadena original de ADN, en ese lugar estará
el nucleótido complementario que lleva guanina (G).
Nos quedará, por tanto, un pequeño fragmento de ADN de 5
nucleótidos (sin contar el cebador).

15. 3) Continuamos la síntesis añadiendo más ADN pol y ddCMP.
Volverá a interrumpirse cuando nuevamente vuelva a incorporarse
el 'didexosi' ddCMP, por la misma razón que antes.
Nos quedará un fragmento de 7 nucleótidos (sin contar el
cebador).
4) Repetimos la operación y nos vuelve a quedar un fragmento de
13 nucleótidos (sin contar el cebador).
5) Volvemos a preparar las mismas reacciones con los otros tipos
de 'didesoxis', y obtenemos:
a) con ddGMP: fragmentos de 1, 4, 10 y 15 nucleótidos.
b) con ddTMP: fragmentos de 3, 8, 9 y 12 nucleótidos.
c) con ddAMP: fragmentos de 2, 6 11 y 14 nucleótidos.

16. 6) Cada uno de estos
fragmentos, mediante
determinadas técnicas se
separan y 'radiografían' y,
entonces, la 'sucesión de
bandas' de cada una de las
reacciones con los cuatro tipos
de 'didesoxi', comparándolas
entre sí, dan la secuencia del
ADN (como puede observarse
en el esquema adjunto).

17. En la actualidad, los estándares aceptados para la detección
de microorganismos se basan en su cultivo a partir del hasta
llegar a su aislamiento e identificación en medios selectivos.
Es un proceso sencillo pero que requiere de mucho tiempo.
Los análisis microbiológicos tradicionales se complementan
con tecnologías rápidas de biología molecular que son
capaces de identificar los microorganismos contaminantes

19. MICROPROPAGACIÓN
Micropropagar es el proceso de multiplicar plantas in vitro.
A través de la micropropagación, a partimos de un fragmento
(explanto) de una planta madre, se obtiene una descedencia
uniforme en condiciones de asepsia.
Este proceso incluye varias fases:
FASE 0 : Preparacion de la planta madre
FASE I : Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia
FASE II : Multiplicación de brotes
FASE III : Enraizamiento
FASE IV: Aclimatación

20. FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se
deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de
desarrollo adecuado.
Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las
plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre
unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va
a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y
con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia
recibida.

21. FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN
CONDICIONES DE ASEPSIA
Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a
partir de los cuales se obtendrán los explantos.
Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los
fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes
externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe
mantener en condiciones de asepsia.
Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo
laminar) se extraerán los explantos del material vegetal y se
pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo
de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los
explantos.

22. FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES
Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron
de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia)
con varios entrenudos.
Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un
nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de
cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se
realizan en la cámara de flujo laminar.

23. FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO
DE ENRAIZAMIENTO DE LOS
EXPLANTOS
Para enraizar los explantos se utilizan
principalmente dos métodos:
ENRAIZAMIENTO IN VITRO Se
transfieren los brotes obtenidos
durante la fase de multiplicación a un
medio libre de reguladores de
crecimiento o que solo contenga
auxinas. Esta operación se realiza en la
cámara de flujo laminar. Este método
permite ser mas flexible a la hora de
escoger los brotes, ya que éstos
obtienen del medio la fuente de energía
para enraizar, y por tanto no es
necesario que tengan las hojas muy
bien desarrolladas para realizar la
fotosíntesis.

24. ENRAIZAMIENTO EX VITRO
Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no
necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con
perlita o vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté
libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien
desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta
tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.
Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un
plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos
enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un
invernadero en un área sombreada con "fog-system" o "mist-
system".

25. Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el
momento en que se extraen los explantos de los recipientes de
enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya
que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una
humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas
perezosos para responder al descenso de la humedad relativa,
demasiado lentos para para evitar la desecación del explanto. Por
otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar
la falta de una cutícula cérea bien desarrollada, la barrera para evitar
la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

27. La utilización de la terapia celular, basada en la transferencia de células o tejidos a los tejidos u
órganos dañados, es una de las grandes esperanzas de la Medicina Regenerativa del futuro. El
establecimiento de cultivos celulares de tejidos humanos en el laboratorio es a veces difícil y en
determinados casos, incluso, imposible. Por ello, desde el punto de vista clínico sería innegable
el avance que supondría la posibilidad de poner a punto técnicas que permitieran obtener
cualquier tipo de cultivos de tejidos y, acaso, de órganos. En este contexto, no cabe duda que el
uso de las células troncales puede resultar fundamental.
En el organismo humano adulto se estima que existen unos 200 tipos de células diferentes cuyo
origen se puede retrotraer a las células troncales embrionarias pluripotentes indiferenciadas
presentes en la masa celular interna (MCI) del embrión en fase de blastocisto. Desde el punto de
vista científico, la cuestión está en llegar a conocer cuáles son las instrucciones por las que una
célula pluripotente indiferenciada se diferencia hacia un determinado tipo celular.

28. CULTIVO DE CELULAS MADRECULTIVO DE CELULAS MADRE
La utilización de la terapia celular, basada en la transferencia de células o
tejidos a los tejidos u órganos dañados, es una de las grandes esperanzas
de la Medicina Regenerativa del futuro. El establecimiento de cultivos
celulares de tejidos humanos en el laboratorio es a veces difícil y en
determinados casos, incluso, imposible. Por ello, desde el punto de vista
clínico sería innegable el avance que supondría la posibilidad de poner a
punto técnicas que permitieran obtener cualquier tipo de cultivos de tejidos
y, acaso, de órganos. En este contexto, no cabe duda que el uso de las
células troncales puede resultar fundamental.
En el organismo humano adulto se estima que existen unos 200 tipos de
células diferentes cuyo origen se puede retrotraer a las células troncales
embrionarias pluripotentes indiferenciadas presentes en la masa celular
interna (MCI) del embrión en fase de blastocisto. Desde el punto de vista
científico, la cuestión está en llegar a conocer cuáles son las instrucciones
por las que una célula pluripotente indiferenciada se diferencia hacia un
determinado tipo celular.

29. Las células Madres pueden obtenerse esencialmente de tres fuentes:
1) de la masa celular interna (MCI) de embriones obtenidos por fecundación in
vitro (FIV) con el único propósito de obtener cultivos de tejidos;
2) de la MCI de embriones sobrantes de programas de FIV;

30. 3) de la MCI de embriones somáticos obtenidos por técnicas de clonación
mediante transferencia de núcleos: método idóneo para evitar el rechazo
inmunológico del trasplante al facilitar un posible autotrasplante. Este sería el caso
de la aplicación de la técnica de clonación no reproductiva con fines terapéuticos
(clonación terapéutica).
Técnica de clonación terapeútica para la obtención de cultivos de tejidos a partir de las células
troncales pluripotentes de la masa celular interna de la vida".