Recomendados
Más contenido relacionado
La actualidad más candente
La actualidad más candente (20)
Similar a Clase transfecciones
Similar a Clase transfecciones (20)
Último
Último (20)
Clase transfecciones
- 1. TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo
- 2. Interacción de proteínas: Doble híbrido en células de levaduras
- 3. pAD
- 4. pBD
- 6. Interacción de proteínas: Doble híbrido en células de mamífero
- 7. pBIND
- 8. pACT
- 9. pG5/luc
- 11. Enriquecimiento de transfectantes • Cell sorting Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes
- 12. Transfección estable • Por integración • Por recombinación homóloga • Como episoma • Requiere de un marcador de selección en el vector • Util para estudios que impliquen inducción de la expresión
- 14. Marcadores de selección eucariontes • Agent Action Marker Gene • Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase • Hygromycin B proteica Gen hyg o hph • Puromycin • G-418 Neomycin phosphotransferase • Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une • MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase
- 15. Marcadores de selección • G418 (Geneticina) – Bloquea la traducción – La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor ) – Para células de mamífero, plantas y levaduras • Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)
- 16. Sistema reprimible por tetraciclina
- 17. Sistema inducible por tetraciclina
- 18. Vector de expresión del regulador
- 19. Vector de expresión del regulador
- 20. Vector de clonado del gen de interés
- 21. Vector de expresión para dos genes regulados por tet
- 22. Vector episomal
- 23. Sistema de recombinación homóloga • Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae • Sitio FRT (Flp recombination target) • Recombinasa Flp
- 24. Vector que contiene el sitio FRT
- 25. Pasos de recombinación homóloga 1- Generar línea que posea el sitio FRT
- 26. Vector de clonado del gen de interés
- 27. Vector de clonado del gen de interés
- 28. Vector de expresión de la recombinasa
- 29. 2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa
- 30. Resultado
- 31. Disminuir expresión de un gen -Ribozimas aaaaa--------auucg--------ccguuua---- ----uaagc-- ggcaaau---- cDNA ribozima Clivado del mRNA blanco
- 32. -Antisentido aaaaa----------------caaucggccccuucguuua---- gttagccggggaagcaaat 1-Oligonucleótido pequeño simple cadena (15 -25 bases) Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA Disminuir expresión de un gen
- 33. cDNA aaaaaa5’ 3’ a b c 2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco. a’ b’ c’ mRNA Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA
- 34. Disminuir expresión de un gen
- 35. Síntesis in vitro • Síntesis química • Transcripción in vitro • Digestión de los dsRNA por RNase III/DICER Expression in vivo • Plásmidos • Templados para PCR (cassette de expresión siRNA) • Vectores virales
- 36. -RNAi (siRNA) Clivado del mRNA blanco aaaaa----------------caaucggccccuucguuua---- guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaacRNAi (30 a 50 nucleotidos) mRNA a) Síntesis cDNA Degradación por RNAsa Procesados por la maquinaria celular (dicer…)
- 38. Expresión de siRNA in vivo Promotor/Enhancer • • Pol III (U6, H1) • • Pol II (CMV) Secuencia de terminación • Pol III: string of 3-5 T’s) Señal de poly(A) SV40 siRNA Templado Templado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA
- 39. Vector siRNA
- 40. Vectores Plasmídicos Expresión transiente • No se trabaja con RNA • Produce gran cantidad de vector • Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o selección Expresión Estable (marcadores de selección) • Produce líneas estables • Animales transgénicos
- 44. Control siRNA