Los ácidos nucleícos y los lípidos.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
Trabajo Práctico Nº6
BIOMOLÉCULAS ORGÁNICAS II: Acidos Nucleicos y lípidos
1. Reconocimiento de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos son grandes polímeros formados por la repetición de
monómeros denominados nucleótidos. Los nucleótidos se unen entre si mediante
enlaces fosfodiéster. Forman así largas cadenas; Los ácidos nucleicos almacenan
la información genética de los organismos vivos y son los responsables de la
transmisión hereditaria. Existen dos tipos , el ácido desoxirribonucleico (ADN) y
el ácido ribonucleico (ARN). El ADN es el responsable de almacenar toda la
información necesaria para “fabricar” un ser vivo. En su secuencia de nucleótidos
contiene las instrucciones para construir los distintos componentes de la célula
Extracción de ADN
La extracción de ADN de una muestra se basa en el hecho de que los iones
salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su
disolución y posterior extracción de la célula. Para extraer el ADN de una
muestra primero hace falta liberarlo del interior celular en el que se encuentra
contenido. Se comienza entonces por romper las membranas y paredes celulares,
esto se realiza a través de una lisis mecánica con la ayuda de un mortero,
licuadora o minipimer. Luego se utiliza un detergente que disuelve los lípidos
(moléculas grasas) y las proteínas de la membrana celular, rompiendo las uniones
que mantienen la integridad de la misma. De esta forma como resultado de la
acción mecánica aplicada y el uso del detergente se libera el contenido celular.
Además, este detergente forma complejos con los lípidos y las proteínas,
permitiendo que los mismos sean separados del ADN por filtración. Así se libera
el ADN.
Cátedra de Biología 1

2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
Luego se adiciona cloruro de sodio. La molécula de NaCl en agua se separa en Na+
y Cl-
. El ADN tiene altas cargas negativas dadas por los grupos fosfatos
constituyentes de los nucleótidos. La carga negativa de la molécula de ADN es
neutralizada por Na+
en la solución. El uso de NaCl ayuda entonces a mantener
estable a la molécula de ADN para que no pierda su estructura. El agua
interactua con ambos de manera que la sal y el ADN permaneces solubles. Por
otro lado, esta neutralización permitirá que el ADN precipite con el agregado de
alcohol. El alcohol frio hace que el ADN precipite ya que a diferencia del agua,
permite que los iones positivos de la sal se acerquen más a las cargas negativas
del ADN y lo neutralicen. Al perder sus cargas, las moléculas de ADN no pueden
permanecer en solución y precipitan en la interfase entre el alcohol y el agua
Materiales
• Multiprocesadora
• Bananas
• Agua
• NaCl o Sal de mesa
• Detergente o shampoo
• Algodón
• Alcohol 95% frio
Cátedra de Biología 2
+ Detergente

3. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
Procedimiento
a) Procesar con una minipimer ¼ de banana cortada en rodajas con unos 5-10
ml de agua. Procesar hasta obtener un puré homogéneo. Tomar un alícuota
de este puré y pasarlo a un vaso de precipitados.
b) Agregar una cucharadita de detergente líquido y una cucharadita de NaCl
o sal de mesa.
c) Disolver el detergente y la sal revolviendo lentamente sin formar espuma.
Dejar reposar por 5-10 minutos
d) Usando un embudo y algodón humedecido, filtrar la mezcla banana-agua-
shampoo-sal
e) Recogemos el filtrado en un tubo con alcohol 95% frio. Durante todo el
tiempo mantenemos el filtrado bien frío (colocar el tubo en un cubo con
hielo)
f) El ADN neutralizado precipita en el alcohol frio. Se observa como un
precipitado viscoso blanquecino.
g) Introducir una varilla y removerla hacia adelante y hacia atrás y poco a
poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado
un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el
ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón
mojado.
h) Graficar y describir lo observado
Electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis es una técnica muy utilizada para separar moléculas de acuerdo
a su diferente movilidad en un campo eléctrico. Básicamente la velocidad con la
que se mueve un electrolito es proporcional a la relación carga/masa. El ADN
tiene como ya se ha señalado, una fuerte carga negativa, por lo que si se lo
somete a un campo eléctrico, migra hacia el ánodo. Sin embargo, la relación
carga/masa se mantiene constante, pues cada unidad monomérica que se agrega
aporta la misma carga y masa, sin modificar así la relación. Con el objetivo de
separar moléculas de ADN de distinto tamaño, es necesario introducir en el
medio una malla (gel) que impida la difusión libre de las moléculas. De este modo,
los fragmentos de ADN de mayor tamaño, serán efectivamente retenidos en
relación a aquéllos más pequeños, consiguiendo así resolver una mezcla
heterogénea de fragmentos de acuerdo sólo al tamaño de los mismos. Los geles
se comportan entonces como un tamiz molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de ADN de diferente
tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa.
Cátedra de Biología 3

4. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
La agarosa es un polímero lineal extraído de un alga marina. Mediante
concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN
desde 200 hasta aproximadamente 500kb de longitud. Este tipo de geles
usualmente se corren en configuración horizontal, en un campo eléctrico de
fuerza y dirección constante. La agarosa forma una matriz, cuya densidad está
determinada por la concentración misma de la agarosa. Cuando se aplica un campo
eléctrico a través del gel, el ADN, cargado negativamente a pH neutro, migra
hacia el ánodo.
Para visualizar el ADN utilizamos un compuesto aromático, el bromuro de etidio,
que intercalándose entre las bases nitrogenadas de los pares de nucleótidos,
produce una concentración alta localizada en forma proporcional a la masa de
ADN presente en cada banda. De esta manera, cuando iluminamos el gel con luz
UV, ésta excita las moléculas de colorante emitiendo luz visible. Dado que el
colorante se ha concentrado en las bandas que contienen ADN, el fondo de luz en
el resto del gel es despreciable, y el método es de gran sensibilidad.
Objetivo
En esta práctica, se pretende que el alumno comprenda el fundamento teórico de
esta técnica y sus aplicaciones. Los docentes llevaran a cabo la separación
electroforética en gel de agarosa de ADN que el alumno va a aislar y purificar a
partir de banana.
Preparación del gel de agarosa (Esta actividad la realizan los docentes por
razones de Seguridad)
- 30 ml del buffer de electroforesis TBE y 0,21 g de agarosa (0,7 %).
- Se funde la solución de agarosa en un microondas o placa calefactora.
- Se deja enfriar la suspensión hasta que alcance unos 50ºCaproximadamente.
- Se coloca el peine que servirá para formar los pocillos del gel en el soporte
- Una vez que la solución de agarosa ha alcanzado los 50ºC, se le añaden 2 µL de
bromuro de etidio (10 mg/ml) y se mezcla bien. ¡MANIPULAR CON GUANTES!
- Se vierte la solución de agarosa con bromuro de etidio en el soporte,
previamente sellado. Se deja polimerizar durante unos 30 minutos.
Electroforesis
- Colocar el soporte del gel en la cubeta de electroforesis. ¡¡OJO!!: Los pocillos
deben de estar cerca del cátodo (polo negativo, color negro).
Cátedra de Biología 4

5. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
- Se añade buffer de electroforesis TBE, de forma que cubra bien el gel de
agarosa.
- Se aplican o “siembran” 10 µl de la muestra preparada (con buffer de siembra)
en los pocillos (en paralelo se siembra un Marcador de peso molecular)
- Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente
de alimentación. Se comprueba que está bien conectada.
- Se programa la fuente a unos 100 voltios y se comienza a correr la
electroforesis que durará unos 30-45 minutos.
- Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA
mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen.
Buffer Tris-borato (TBE)
Solución de trabajo: 0.5X: 0.045M Trisborato 0.001M EDTA
Solución stock: 5X: 54g Tris base
27.5g ac. Bórico
20ml 0.5M EDTA (Ph 8.0)
Esquema
Cátedra de Biología 5
Soporte o molde

6. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
2. Reconocimiento de lípidos
A diferencia de los carbohidratos y proteínas, los lípidos tienen diversas
estructuras y funciones, pero sus características de solubilidad son semejantes
entre ellos. Se definen operacionalmente como compuestos orgánicos insolubles
en agua o ligeramente solubles, que se encuentran en los sistemas biológicos. Los
lípidos son hidrofóbicos (no polares) y/o anfipáticos (que tienen componentes
polares y no polares).
Test para la detección de lípidos
Sudán III es un colorante soluble en grasa (liposoluble) que permite identificar
la presencia de lípidos; el cual pertenece al grupo de colorantes indiferentes,
que son aquellos que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. El
colorante (rojo) es insoluble en el agua
En el siguiente cuadro se describen las actividades a desarrollar para la
determinación en muestras biológicas que contienen lípidos del tipo ácidos
grasos.
Determinación de lípidos
Materiales y
procedimientos
1 2 3 4
Agua de canilla (ml) 5 4 4
Aceite de girasol ( ml) 5
Homogeneizado de
músculo de pescado (ml)
1
Homogeneizado de
hamburguesa de carne
(ml)
1
Sudán III (gotas) 4 4 4 4
Agitar vigorosamente los
tubos y dejar en reposo 5
minutos
x x x x
Registrar lo observado
(+/-)
Cátedra de Biología 6

7. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
Los homogeneizados de músculo de pescado y hamburguesa de carne se realizan
cortando pequeños trozos de cada material con bisturí y se pisan en mortero con
pisón en 2 ml de agua de canilla cada muestra
Cuestionario
1. ¿Qué tipos de riesgo acarrea la manipulación del bromuro de etidio?
Cátedra de Biología 7