Este documento describe los métodos de amplificación de ácidos nucleicos, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Explica las etapas de la PCR, incluida la preparación de los reactivos, los ciclos térmicos de desnaturalización, alineamiento y extensión, y los métodos posteriores como la electroforesis. Finalmente, destaca las ventajas de la PCR para aplicaciones como el diagnóstico molecular, la ingeniería genética y la medicina legal.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”Carlos Joel Beltran Ube
La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”Carlos Joel Beltran Ube
La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
Twitter.com/@bryanpriegop
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
Twitter.com/@bryanpriegop
A detailed description about the basic steps involved in the - PCR - Polymerase Chain Reaction, its applications,its limitations and steps to overcome it.
Análisis de expresión génica en el hipotálamo humano en depresión por microdisección láser y PCR en tiempo real: la presencia de múltiples desequilibrios del receptor
Droplet digital PCR | Aplicaciones y casos de éxitoBiodiagnostico
La tercera generación de PCR ya está disponible en Uruguay a través de Biodiagnóstico. Conozca el Droplet Digital PCR de Biorad, formas de uso y casos de éxito.
Lo que antes era indetectable con otros métodos, ahora se puede cuantificar con Droplet Digital PCR. Descubrilo.
Presentació de Elena Cossin i Maria Rodriguez, infermeres de Badalona Serveis Assistencials, a la Jornada de celebració del Dia Internacional de les Infermeres, celebrada a Badalona el 14 de maig de 2024.
IA, la clave de la genomica (May 2024).pdfPaul Agapow
A.k.a. AI, the key to genomics. Presented at 1er Congreso Español de Medicina Genómica. Spanish language.
On the failure of applied genomics. On the complexity of genomics, biology, medicine. The need for AI. Barriers.
En el marco de la Sexta Cumbre Ministerial Mundial sobre Seguridad del Paciente celebrada en Santiago de Chile en el mes de abril de 2024 se ha dado a conocer la primera Carta de Derechos de Seguridad de Paciente, a nivel mundial, a iniciativa de la Organización Mundial de la Salud (OMS).
Los objetivos del nuevo documento pasan por los siguientes aspectos clave: afirmar la seguridad del paciente como un derecho fundamental del paciente, para todos, en todas partes; identificar los derechos clave de seguridad del paciente que los trabajadores de salud y los líderes sanitarios deben defender para planificar, diseñar y prestar servicios de salud seguros; promover una cultura de seguridad, equidad, transparencia y rendición de cuentas dentro de los sistemas de salud; empoderar a los pacientes para que participen activamente en su propia atención como socios y para hacer valer su derecho a una atención segura; apoyar el desarrollo e implementación de políticas, procedimientos y mejores prácticas que fortalezcan la seguridad del paciente; y reconocer la seguridad del paciente como un componente integral del derecho a la salud; proporcionar orientación sobre la interacción entre el paciente y el sistema de salud en todo el espectro de servicios de salud, incluidos los cuidados de promoción, protección, prevención, curación, rehabilitación y paliativos; reconocer la importancia de involucrar y empoderar a las familias y los cuidadores en los procesos de atención médica y los sistemas de salud a nivel nacional, subnacional y comunitario.
Y ello porque la seguridad del paciente responde al primer principio fundamental de la atención sanitaria: “No hacer daño” (Primum non nocere). Y esto enlaza con la importancia de la prevención cuaternaria, pues cabe no olvidar que uno de los principales agentes de daño somos los propios profesionales sanitarios, por lo que hay que prevenirse del exceso de diagnóstico, tratamiento y prevención sanitaria.
Compartimos el documento abajo, estos son los 10 derechos fundamentales de seguridad del paciente descritos en la Carta:
1. Atención oportuna, eficaz y adecuada
2. Procesos y prácticas seguras de atención de salud
3. Trabajadores de salud calificados y competentes
4. Productos médicos seguros y su uso seguro y racional
5. Instalaciones de atención médica seguras y protegidas
6. Dignidad, respeto, no discriminación, privacidad y confidencialidad
7. Información, educación y toma de decisiones apoyada
8. Acceder a registros médicos
9. Ser escuchado y resolución justa
10. Compromiso del paciente y la familia
Que así sea. Y el compromiso pase del escrito a la realidad.
Presentació de Isaac Sánchez Figueras, Yolanda Gómez Otero, Mª Carmen Domingo González, Jessica Carles Sanz i Mireia Macho Segura, infermers i infermeres de Badalona Serveis Assistencials, a la Jornada de celebració del Dia Internacional de les Infermeres, celebrada a Badalona el 14 de maig de 2024.
5. MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN
MÉTODOS DE
AMPLIFICACIÓN
DE LAS DIANAS
PCR
TÉCNICAS
ISOTÉRMICA
S
MÉTODOS DE
AMPLIFICACIÓN
DE SONDA
AMT
AANBS
ADH
TECNOLOGÍA
INVASORA/ENZI
MA DE ROTURA
GRCL
RCL
MÉTODOS DE
AMPLIFICACIÓN
DE SEÑALES
DNA
RAMIFICA
DO
ENSAYO DE
CAPTURA DE
HÍBRIDOS
6. PCR (POLYMERASE
CHAIN REACTION:
REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA)
Es una tecnología de amplificación que
permite mediante procesos in vitro
mediados por enzimas generar copia
ilimitadas de un segmento determinado
de DNA
8. OBJETIVOS
GENERALES:
• Conocer el procedimiento a
seguir para efectuar la PCR.
ESPECÍFICOS:
– Identificar la secuencia de
acontecimientos
requeridos
para este fin.
– Integrar la teoría con la
práctica.
– Valorar su utilidad.
15. REACTIVOS
Muestra de DNA
dNTPs:
dATP, dTTP, dGTP, dC
TP
• 20-200μM
• Concentraciones
equimolares de los 4
DNA Polimerasa (Taq)
Catalizadores
• MgCl2
Primers u
Oligonucleótidos
Iniciadores
• 0,5-1μM
por
c/100μL
Buffer o Tapón
19. ETAPAS
PREPCR
• Recepción de la muestra
• Procesamiento de la muestra
• Purificación de la muestra
• Extracción del DNA
• Cuantificación del DNA
PCR
• Preparación
del coctel
• Ciclos
POSTPCR
•
•
•
•
Tinción de la muestra
Siembra
Corrida electroforética
Revelado
29. CUIDADOS DE LA PCR
Lugar propio
Instrumental
exclusivo,
estéril
(lavado con H2O destilada)
Reactivos apropiados
• Conservación: -20°C
• > concentración que la requerida para la
reacción.
Uso de guantes por el manipulador
30. POST-PCR
ELECTROFORESIS
• Separación en placa por
tamaño y carga eléctrica.
• REVELADO:
– Radioautografía
• Bromuro de etidio
– Fluorescencia
• Lámpara de luz UV
33. PCR ANIDADA (>sensibilidad y
especificidad)
• 2 pares de cebadores y 2
rondas de PCR.
• DESVENTAJAS:
Contaminación
en
transferencia.
• SUSTIUÍDA:
Hibridación del DNA
con sonda.
34. PCR MÚLTIPLE
• Co-amplificación en
mismo tubo.
• REQUERIMIENTOS:
un
– Cebadores con temperaturas
de amplificación semejantes.
– Ausencia
de
complementariedad entre los
cebadores.
• VENTAJA: Determinación
de múltiples dianas en una
reacción.
• DESVENTAJA:
Baja
sensibilidad.
35. PCR CUANTITATIVA
DETERMINANTES
Eficiencia de la Amplificación
• Preparación de la muestra
• Procedimientos
de
purificación
del
ácido
nucleico
• Presencia de inhibidores
• Actuación del termociclador
PCR COMPETITIVO (PCRc )
• Co-amplificación
de
secuencias diferentes en el
mismo tubo que compartan los
cebadores.
• COMPETIDORES:
– Tamaño similar
– Composición de bases igual a la
diana
• CÁLCULO:
– Yc=Ic(1+e)n
– Yt=It(1+e)n
– Yc/Yt=Ic/It
36. PCR EN TIEMPO REAL
• Amplificación y detección
de DNA simultánea en el
mismo tubo.
• REQUERIMIENTOS
(REVELADO ÓPTICO
POR
FLUORESCENCIA):
– Termocicladores
de
precisión óptica
– Colorantes
fluorescentes
que se unen al DNA de
doble hebra
– Sondas de hibridación
(especificidad)
37. PCR EN TIEMPO REAL
• REQUERIMIENTOS
[REVELADO
POR
TRANSFERENCIA DE • REQUERIMIENTOS
(REVELADO
POR
RESONANCIA
DE
GUÍAS
FLUORESCENCIA
MOLECULARES)
(TERF)]
– 2 sondas por c/cadena de
DNA: 3’: donador y 5’:
aceptador [proporcional
a la magnitud del
producto (Y)]
– Sondas marcadas con
fluoróforos en forma de
horquilla.
38. PCR EN TIEMPO REAL
• VENTAJAS:
– Reducción del tiempo
para la entrega de
resultados.
– Menor contaminación (se
obvia el procesamiento
Post-PCR)
– Aplicación cuantitativa.
40. VENTAJAS DE LA PCR
A partir de una muestra pequeña de
ADN se puede obtener una cantidad
considerable.
El producto se puede utilizar para
clonar, secuenciar y analizar.
Se puede amplificar ADN de
cualquier organismo vivo o muerto.
41. DESVENTAJAS DE LA PCR
Se puede reproducir solamente partes del genoma
en donde se conoce por lo menos una mínima
secuencia de 20 – 40 pb.
Se necesitan “primers” específicos que sean
complementarios al fragmento que se desea
sintetizar.
La polimerización puede tener errores al sintetizar
el ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del
mismo investigador o de cualquier otro.
42. UTILIDAD
INGENIERÍA GENÉTICA
• Clonación
• Tecnologías de DNA recombinate
• Análisis y cuantificación de la expresión genética (RNAm)
DIAGNÓSTICO MOLECULAR:
• Genética
• Inmunología
• Microbiología
• Oncología
TERAPIA GÉNICO-MOLECULAR
• Proyecto Genoma Humano
• Detección de mutaciones
• Dx. Prenatal y preimplantación
MEDICINA LEGAL
ARQUEOLOGÍA
44. UTILIDAD EN MICROBIOLOGÍA
Diagnóstico etiológico y epidemiológico
(gold estándar)
Genotipificación:
•
•
•
•
Virulencia
Resistencia a fármacos
Mutaciones
Epidemiología:
VIH,
VHB,
VHC,
Citomegalovirus, Virus de Epstein Barr, VPH.
45.
46. BIBLIOGRAFÍA:
•
•
•
•
•
•
Kindt, T.; Goldsby, R.; Osborne, B. Inmunología de Kuby. VI Edición. Editorial Mc GrawHill. México D.F.-México. 2007.
Lodish, H. et all. Biología Celular y Molecular. 5ta. Edición. Editorial Panamericana. Buenos
Aires - Argentina. 2011.
Redondo, O. Conceptos generales de Biología Molecular. Extracción de DNA y Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR). Hospital Universitario de Guadalajara. [Actualizado 25 Abr
2007.
Accesado
20
May
2013]
Disponible
en:
http://www.aebm.org/jornadas/guadalajara/EXTRACCI%D3N%20DE%20DNA%20Y%20PC
R.pdf
Regueiro J., López C., González S., Martínez E. Inmunología. IV Edición Revisada. Ed.
Médica Panamericana. Madrid - España. 2012.
Rojas, W., Anaya J., Aristizábal B., Cano L., Gómez L., Lopera D. Inmunología de Rojas. XV
Edición. Corporación para la
Torres, A.; Baca, B. Reacción en Cadena de la Polimerasa. Centro de Investigaciones
Microbiológicas. Instituto de Ciencias. Universidad de Puebla. . [Accesado 20 May
2013] Disponible en: http://www.elementos.buap.mx/num23/pdf/16.pdf