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EXTRACCION DEL ADN Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
CONTENIDO Generalidades sobre el ADN Muestras para extracción del ADN Condiciones sobre la remisión de muestras. Métodos de extracción del ADN -  Salting out
EL MATERIAL GENÉTICO
46 CROMOSOMAS  23 PARES DIPLOIDES UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE CROMOSOMA S
EL MATERIAL GENÉTICO   Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra. Está conformado por millones de unidades  de nucleótidos Cada nucleótido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato
EL MATERIAL GENETICO BN BN A P BN A P BN A P BASES  NITROGENADAS BN BN BN ADENINA GUANINA CITOSINA TIMINA
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Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN . Cantidad de material de partida  Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido  Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biológico
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DEGRADACION DE LAS MUESTRAS Humedad ambiental. Fenómenos meteorológicos, acción de insectos, entre otros. Recogida y envió al laboratorio de estas evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferación bacteriana y por consiguiente la degradación del material genético
DEGRADACION DE LAS MUESTRAS Exponer por mucho tiempo las muestras  a los rayos ultravioleta provoca  daños sobre la estructura del ADN,  o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN.
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CADENA DE CUSTODIA Nombre o identificación, firma. Fecha y hora de la recogida. Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envío.
METODOS DE EXTRACCION DE ADN SALTING – OUT CHELEX  FENOL - CLOROFORMO
FENOL  CLOROFORMO Técnica Orgánica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica  (Fenol),  después se realiza digestión con  proteinasa K.  El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS :  Reactivos altamente tóxicos Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.
CHELEX Técnica inorgánica Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al 5%. Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato. los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS : El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.
SALTING-OUT Técnica de tipo inorgánica Utiliza reactivos bajos en toxicidad Permite visualizar la malla del ADN. Desventajas:  Requiere una mayor cantidad de muestra.
1.  Lisis Celular 2.  Extracción 3. Precipitación 4. Resuspensión SALTING OUT
LISIS CELULAR Buffer de lisis I: ( lisis glóbulos rojos ). -  Sucrosa -  MgCl2 1M -  Triton x 100 Buffer de lisis II: ( lisis glóbulos blancos) EDTA de Na NaCL.
EXTRACCION Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas Perclorato de sodio 5M NaCl 6M
PRECIPITACION Isopropanol Etanol al 70% lava el exceso de sales.
RESUSPENSION Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede realizar en agua.
EXTRACCION SALTING OUT
CONCLUSIONES El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información contenida en los genes de generación en generación. El ADN esta presente en los indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. El Salting-out es uno de los métodos de extracción de ADN mas utilizados por su fácil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.
BIBLIOGRAFIA MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999. Grupo Español y portugués de la ISFG. Recomendaciones para la recogida y envío de la muestras con fines de identificación genética. Madeira, 2 de Junio 2000. MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988.
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Extraccion ADN

  • 1. EXTRACCION DEL ADN Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
  • 2. CONTENIDO Generalidades sobre el ADN Muestras para extracción del ADN Condiciones sobre la remisión de muestras. Métodos de extracción del ADN - Salting out
  • 4. 46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE CROMOSOMA S
  • 5. EL MATERIAL GENÉTICO Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra. Está conformado por millones de unidades de nucleótidos Cada nucleótido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato
  • 6. EL MATERIAL GENETICO BN BN A P BN A P BN A P BASES NITROGENADAS BN BN BN ADENINA GUANINA CITOSINA TIMINA
  • 7. REGIONES DEL ADN De secuencia única (genes) Medianamente repetitivas Altamente Repetitivas
  • 8. p q GEN REGIONES REPETIDAS HETEROCROMATINA EUCROMATINA CROMOSOMA ADN
  • 9. Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN . Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biológico
  • 10. MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN Sangre Semen Saliva Cabello Hueso Diente Tejido
  • 11. MUESTRAS PARA EXTRACCION DEL ADN Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina. Manchas: secado. Residuo metanolico: Chelex. Soportes: Absorbente o no.
  • 12. REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR La posibilidad de extraer el material genético en cualquier indicio biológico. Análisis por medio de técnicas como la PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de indicios biológicos en cantidades escasas
  • 13. REMISION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS DEL ADN NORMAS DE BIOSEGURIDAD. CADENA DE CUSTODIA. FORMATOS EN CASOS ESPECIFICOS.
  • 14. PROTECCION DEL PERSONAL Prevenir contacto directo Prohibir consumo de comidas y bebidas. Condiciones de asepsia y material desechable. Vacunación.
  • 15. PROTECCION DE LA MUESTRA CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO. CONTAMINACION MICROBIOLOGICA. CONTAMINACION QUIMICA. TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.
  • 16. CONTAMINACION POR MATERIAL MATERIAL BIOLOGICO HUMANO Depósito de material biológico humano sobre las muestras, con posterioridad a la toma de las mismas.
  • 17. CONTAMINACION MICROBIOLOGICA Este tipo de contaminación tiene lugar por el desarrollo de microorganismos y suele estar favorecida por la humedad y las altas temperaturas.
  • 18. CONTAMINACION QUIMICA Presencia de productos químicos que dificultan procesos del análisis genético, como PCR y extracción del ADN
  • 19. TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS. Debido al traslado de los indicios de una localización a otra puede dar lugar a una contaminación o puede ocasionar la pérdida de la prueba.
  • 20. DEGRADACION DE LAS MUESTRAS Humedad ambiental. Fenómenos meteorológicos, acción de insectos, entre otros. Recogida y envió al laboratorio de estas evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferación bacteriana y por consiguiente la degradación del material genético
  • 21. DEGRADACION DE LAS MUESTRAS Exponer por mucho tiempo las muestras a los rayos ultravioleta provoca daños sobre la estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN.
  • 22. DOCUMENTOS NECESARIOS Formulario de envio de muestras. Identificacion de Muestras. Cadena de Custodia.
  • 23. FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre. Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los hechos, lugar, fecha. Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional, causa de la muerte, relacion con el sospechoso. Datos del sospechoso:
  • 24. IDENTIFICACION DE LAS MUESTRAS Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, relación con el caso. Listado de indicios biológicos: numero de referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a quien pertenece y localización, tipo de indicio a estudiar.
  • 25. CADENA DE CUSTODIA Nombre o identificación, firma. Fecha y hora de la recogida. Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envío.
  • 26. METODOS DE EXTRACCION DE ADN SALTING – OUT CHELEX FENOL - CLOROFORMO
  • 27. FENOL CLOROFORMO Técnica Orgánica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), después se realiza digestión con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS : Reactivos altamente tóxicos Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.
  • 28. CHELEX Técnica inorgánica Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al 5%. Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato. los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS : El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.
  • 29. SALTING-OUT Técnica de tipo inorgánica Utiliza reactivos bajos en toxicidad Permite visualizar la malla del ADN. Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra.
  • 30. 1. Lisis Celular 2. Extracción 3. Precipitación 4. Resuspensión SALTING OUT
  • 31. LISIS CELULAR Buffer de lisis I: ( lisis glóbulos rojos ). - Sucrosa - MgCl2 1M - Triton x 100 Buffer de lisis II: ( lisis glóbulos blancos) EDTA de Na NaCL.
  • 32. EXTRACCION Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas Perclorato de sodio 5M NaCl 6M
  • 33. PRECIPITACION Isopropanol Etanol al 70% lava el exceso de sales.
  • 34. RESUSPENSION Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede realizar en agua.
  • 36. CONCLUSIONES El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información contenida en los genes de generación en generación. El ADN esta presente en los indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. El Salting-out es uno de los métodos de extracción de ADN mas utilizados por su fácil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.
  • 37. BIBLIOGRAFIA MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999. Grupo Español y portugués de la ISFG. Recomendaciones para la recogida y envío de la muestras con fines de identificación genética. Madeira, 2 de Junio 2000. MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988.