Este documento describe varios métodos para la extracción y cuantificación de ADN, incluyendo extracción orgánica, por Chelex, y usando papel FTA. También cubre temas como la cuantificación de ADN mediante espectrofotometría y fluorometría, y el uso de PCR en tiempo real (qPCR).

1. Extracción y Cuantificación
de ADN

2. Tecnología Básica
Extracción y Cuantificación
Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction)
Separación: Electroforesis
Detección
Análisis

3. Extracción de ADN: Múltiples maneras!!

4. EXTRACCION DE ADN
 ORGANICA
 CHELEX
 PAPEL FTA
 OTRAS
 Extracciones basadas en estuches
 QIAamp, GeneClean, etc.
 Pueden depender en
 Protocolos de LAB
 Tipo de muestra

5. Preparación de Muestra
 Extracción de ADN Orgánica
 Extracción por Chelex
 Extracción de ADN utilizando papel
FTA
 Estuches QIAamp para separar ADN
 Equipo basados en robótica pueden
requerir otros métodos

6. EXTRACCION ORGANICA DE ADN
 PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL
ALCOHOL (PCI)
 PRODUCE ADN DE ALTO PESO
MOLECULAR
 CONSUME MUCHO TIEMPO
 QUIMICOS PELIGROSOS
 MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles
errores)

7. EXTRACCION ORGANICA DE
ADN
 COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO
 AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K
 ROMPE LAS CELULAS (SDS)
 ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
 AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y
lípidos
 Particiona macromoléculas basedo en propiedades
hidrofóbicas e hidrofílicas
 Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol
 Alcohol Isoamyl disminuye la espuma
 ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
 RECUPERACION DE ADN
 Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto

8. EXTRACCION POR CHELEX
 1991 Laboratorios Bio-Rad
 RESINA QUELANTE
 REMUEVE MAGNESIO
 (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
 ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA
CELULA
 UTILIZE SOLO CON PCR (cadena
sencilla)

9. EXTRACCION POR CHELEX
 AÑADA MUESTRA AL TUBO
 AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE
CHELEX
 100°C PARA ROMPER CELULAS
 DESTRUIR PROTEINAS
 ADN ES DENATURADO A CADENAS
SENCILLAS
 UTILIZE SOBRENADANTE
DIRECTAMENTE EN PCR

10. EXTRACCION CON PAPEL
FTA™
 PAPEL ALMACENAJE A BASE DE
CELULOSA
 CONTIENE QUIMICOS
 PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E
INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
 ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS
 UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O
SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS

11. Tecnología FTA®
 Rompe cé lulas y membranas
de organelos
-Físicamente Atrapa Acidos
Nucleicos (ADN & ARN)
 Preserva y Proteje Acidos
Nucleicos
-Previene Daño por radicales libres/UV
-Previene Daño Enzimático
-Inhibe crecimiento de hongos y
bacterias
 Provee Seguridad al Usuario
-Inactiva Potenciales Viruses
Peligrosos

12. Preparación de ADN Rápida y Eficiente

13. FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva
10 Platos = 240 muestras
Temp de almacenaje = -200
C
240 Tarjetas = 240 muestras
Temp de almacenaje = Temp
ambiente
Costo
$2,000/congelador/año
Costo
$75/gabinete de
archivo
240 Tubos = 240 muestras*
Temp de almacenaje= -200
C
Convencional versus FTA

14. Archivado a Temperatura
Ambiente
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
6 Blue Blood-B-Pro
1000
2000
3000
4000
6 Green Blood-B-Pro
500
1000
1500
6 Yellow Blood-B-Pro
500
1000
1500
2000
6 Red Blood-B-Pro
200
400
600
Perfil de STR de
sangre archivada en
1989 y analizada en
2003
• Muestras archivadas en
ambientes diferentes,
selladas en sobre de
aluminio
• Proceso normal de
colección de muestra
• 10 µL de reacciones de
Profiler™ añadido a
muestras, 24 ciclos

15. EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
 Sangre o saliva seca en papel FTA
 Células se ROMPEN al contacto
 UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA
al TUBO
 LAVE para remover HEME y otros
inhibidores de PCR
 Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción
de PCR

16. EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
 CUANTIFICACIÓN NO es necesaria
 Cantidad de muestra consistente
 Resultados consistentes
 Posible AUTOMATIZACIÓN

17. ORGÁNICA Papel FTACHELEX
Mancha
de
sangre
ROTO
LAVAR Múltiples veces
con buffer de extracción
PREPARAR PCR
Reactivos
de PCR
SDS, DTT, EDTA
y
proteinase K
ENCUBAR (56 o
C)
Phenol,
chloroform,
isoamyl alcohol
CUANTIFICAR
ADN
Aplicar sangre al
papel y dejar que
se sequeMancha
de
sangre
VORTEX
(NO CUANTIFICACIÓN)
Agua
ENCUBAR (ambiente)
5%
Chelex
ENCUBAR (100 o
C)
REMOVER sobrenadante
ENCUBAR (56 o
C)
CUANTIFICAR
ADN
PREPARAR PCR
PREPARAR PCR
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
REMOVER sobrenadanteTRANSFER aqueous (upper) phase
to new tube
CONCENTRAR muestra
(Centricon/Microcon-100 or ethanol
precipitation)
Centrifugar
TE buffer
Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd
Edition © 2005 Elsevier Academic Press

18. CUANTIFICACIÓN DE ADN
 ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR
 MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE
ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS
 DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA
 MÉTODOS INICIALES NO MUY
SENSITIVOS O ESPECÍFICOS
 ABSORBENCIA A 260 nm
 TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
 Cuantificación comparada a marcador estándar

19. Cuantificación por "Slot Blot"
 Procedimiento Común
 Específico para primates
 Ha sido modificado para utilizar
quimioluminiscencia en vez de radioactivida
 Puede detectar cantidades menores que
nanogramos
 Puede detectar ADN de cadena doble y
cadena sencilla

20. CUANTIFICACIÓN DE ADN
 CUANTIFICACIÓN POR "SLOT
BLOT"
 ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE
PRIMATE
 D17Z1
 RADIOACTIVO
 COLORIMÉTRICO
 QUIMIOLUMINISCENTE

21. CUANTIFICACIÓN DE ADN
 CAPTURAR ADN GENÓMICO EN
MEMBRANA DE NILÓN
 AÑADIR PRUEBA D17Z1
 INTENSIDAD DE LA MUESTRA
COMPARADA A ESTÁNDARES
 SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50
copias de ADN genómico

22. Slot Blot
Ventajas Desventajas
 Puede ser sensitivo
 Reemplaza
radioactividad
 Puede detectar
cadenas sencillas y
ADN parcialmente
degradado.
 Cantidad dada es
sólo de ADN
humano
 Consume tiempo
 Labor intensiva

23. 20 ng
10 ng
5 ng
2.5 ng
1.25 ng
0.63 ng20 ng
10 ng
5 ng
2.5 ng
1.25 ng
0.63 ng
Estándares de
Calibración
Estándares de
Calibración
Muestras
Desconocidas
~2.5 ng
Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd
Edition © 2005 Elsevier Academic Press

24. Fluorometría vs
Espectrofotometría

25. Fluorometría
*Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o
PicoGreen
-- aumento en emisión a 458 nm cuando
enlazado a ADN de doble cadena
*Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla
o ARN
--se enlaza al surco menor, rico en A-T
*Muestra es comparada a curva estándar de ADN
cuya concentración es conocida
--utilize estándar con composición similar
para lecturas más precisas

26. Cuantificación de ADN por
espectrofotometría
 Concentración de ADN puede ser determinada
midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un
espectrofotómetro utilizando una cubeta de
cuarzo
 Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.
Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a
50 µg de ADN por ml
A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml

27. Pureza de ADN: Proporción A260/A280
*Proporción indica pureza/presencia de
contaminantes que pueden absorber luz UV
(proteínas, etc.)
*ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0
--en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5
*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN)
--imita alta pureza y producción
--aumenta el valor A260

28. PCR utilizando 'Real
time'
(qPCR)
Continuará!!