Comparación de MALDI-TOF MS, secuenciación genética y.pptx

1. Comparación de MALDI-TOF MS,
secuenciación genética y el Vitek 2 para la
identificación de setenta y tres aislamientos
clínicos de enteropatógenos
Jiankai Deng, Liang Fu, Ruilian Wang, Nan Yu, Xixia Ding, Lingxiao
Jiang, Yanping Fang, Changhong Jiang, Lijuan Lin, Ying Wang, Xiaoyan
Che
Laboratory of Emerging Infectious Diseases and Division of Laboratory
Medicine, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou
510280, China

2. Introducción
• La diarrea bacteriana es causada por varios patógenos
diferentes, incluyendo especies de Salmonella, Escherichia coli,
Shigella, Campylobacter, Aeromonas, Plesiomonas
shigelloides, Yersinia enterocolitica, y Vibrio patógeno, entre
otros.
• La identificación rápida y sensible de los enteropatógenos en el
laboratorio clínico es esencial para un diagnóstico temprano y
preciso, así como para la terapia oportuna

3. • Durante décadas, los enteropatógenos se han identificado
rutinariamente en los laboratorios de microbiología clínica mediante
métodos bioquímicos y pruebas serológicas, que suelen ser lentos y
requieren grandes cantidades de material biológico.
• Además, la identificación de especies basada en resultados de
pruebas bioquímicas a veces es poco confiable y arroja resultados
controvertidos.
• Los métodos moleculares han demostrado tener un valor
complementario; sin embargo, el alto costo y la experiencia técnica
requerida han dificultado su uso rutinario en los laboratorios clínicos

4. • La espectrometría de masas por desorción/ionización asistida por
matriz acoplada a un detector de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS)
se ha desarrollado para la identificación de microorganismos basada
en la comparación de las huellas espectrales de masas del perfil
proteico de la muestra, que son firmas únicas de proteínas para
cada microorganismo, con huellas espectrales de masas de
referencia.
• Se informó que el MALDI-TOF MS proporciona identificaciones
rápidas y fiables de bacterias y hongos médicos aislados de
pacientes. Sin embargo, la precisión analítica varía según la especie
del aislado y los diferentes sistemas de espectrometría de masas, y
se sugirió que las identificaciones insatisfactorias de algunas cepas
estaban relacionadas principalmente con las bases de datos o las
limitaciones conocidas de la técnica de MALDI-TOF MS

5. Métodos
• Aislamientos
• Controles
• ATCC: Salmonella
enterica (ATCC14028),
• Shigelle sonnei (GIM1.239),
• S. flexneri (GIM1.238),
• S. dysenteriae (GIM1.236),
• Campylobacter jejuni (ATCC33291),
• Aeromonas hydrophila (GIM1.172),
• Yersinia enterocolitica (GIM1.265),
• Vibrio parahaemolyticus (AT
CC17802),
• V. fluvialis (GIM1.488) y
• V. cholera attenuated strain was
provided by Guangzhou CDC.
• Quality control strain of Escherichia
coli (ATCC8739) for the Vitek MS
system

6. • Setenta y tres aislamientos clínicos de enteropatógenos, que
abarcan siete géneros diferentes, se obtuvieron de pacientes
con enfermedad diarreica entre octubre de 2012 y septiembre
de 2013 y se recuperaron a partir de muestras almacenadas a -
80 °C.
• Cada aislamiento fue sembrado en agar sangre columbia en
diferentes condiciones ( temperatura, tiempo de incubación y
condiciones de oxígeno ) que propiciaran el crecimiento de
cada bacteria.

7. • MALDI TOF MS
• Una porción de una colonia de la bacteria se extendió en la placa de
muestras y luego se cubrió inmediatamente con 1 µL de una
solución de matriz. Tras secarse, la placa se cargó en el sistema
MALDI TOF Vitek MS. La huella espectral de masas se generó y se
comparó automáticamente con la base de datos Vitek MS versión 2

8. Gene sequence analysis
• Los resultados de identificación de los 73
aislamientos clínicos de enteropatógenos
obtenidos a través de Vitek MS se
confirmaron mediante secuenciación de
genes. Se extrajo el ácido nucleico de las
bacterias utilizando el kit QIAamp MinElute
Virus Spin siguiendo las instrucciones del
fabricante.
• Se llevaron a cabo PCR y retrotranscripción-
PCR (RT-PCR) para obtener secuencias de
genes específicos. Los cebadores
específicos para regiones conservadas de
enteropatógenos se sintetizaron a través de
Sangon Biotech (China) siguiendo la
literatura y se usaron para la amplificación y
secuenciación. La secuenciación se realizó a
través de un servicio comercial (BGI tech,
China)

10. Vitek 2 analysis
• Se identificaron diez aislamientos de Aeromonas y seis
aislamientos de Salmonella a través del sistema Vitek 2
(bioMérieux, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante

11. Resultados
• Todos los aislamientos
mostraron resultados de
secuenciación de genes con
una similitud ≥99% a
especies publicadas.
• Todos los aislamientos de
Shigella fueron identificados
como E. coli por el sistema
Vitek MS, acompañado por
una explicación de la
incapacidad de discriminar
entre estos dos géneros, y el
resultado de identificación de
la cepa tipo de A. hydrophila
fue reportado como A.
hydrophila/caviae

13. • La identificación de los aislamientos de Aeromonas y Salmonella por el sistema
Vitek MS se comparó posteriormente con los del sistema Vitek 2. la identificación
de especies de diez aislamientos de Aeromonas por los sistemas Vitek MS y
Vitek 2. Los resultados de identificación obtenidos del sistema Vitek MS fueron
esencialmente consistentes con los del sistema Vitek 2. Además, los resultados
de identificación de seis aislamientos de Salmonella obtenidos del sistema Vitek
MS fueron exactamente iguales a los del sistema Vitek 2 (datos no mostrados)

14. • El costo de los consumibles y el tiempo necesario para la identificación de diez
aislamientos de Aeromonas y seis aislamientos de Salmonella por los sistemas Vitek MS
y Vitek 2.
• Los consumibles del sistema Vitek MS incluyen solución de matriz, placas de objetivo,
asas de inoculación y puntas. Para el sistema Vitek 2, los consumibles incluyen tarjetas
de identificación de gramnegativos, tubos de suspensión bacteriana, hisopos de algodón
y solución salina. Los consumibles del sistema Vitek MS fueron considerablemente más
económicos que los del sistema Vitek 2, y el Vitek MS generó resultados diez veces más
rápido que el sistema Vitek 2 en la identificación de 16 aislamientos

15. Discusión
• El desarrollo de la tecnología MALDI-TOF MS ha revolucionado
potencialmente la identificación de rutina de microorganismos
en laboratorios de microbiología clínica al introducir una técnica
de identificación simple, rápida, de alto rendimiento y bajo costo
(3). En este estudio, se demostró que el MALDI-TOF MS es
satisfactorio en cuanto a su desempeño analítico y práctico en
la identificación de enteropatógenos. Con la excepción de no
poder distinguir entre Shigella y E. coli, el MALDI-TOF MS
proporcionó identificaciones correctas para todas las cepas tipo
y aislamientos clínicos de enteropatógenos que representan 8
géneros a nivel de género

16. • El MALDI-TOF MS ofrece una clara ventaja sobre las herramientas
bioquímicas convencionales, como el Vitek 2, ya que logra un
rendimiento analítico similar, pero a un costo más bajo y en mucho
menos tiempo para la identificación. Sin embargo, surgieron algunos
problemas al usar el MALDI-TOF MS para la identificación de
enteropatógenos. En primer lugar, el MALDI-TOF MS no puede
discriminar entre E. coli y Shigella. El sistema informa que un
aislado de Shigella es E. coli. La incorrecta identificación se debe a
la resolución limitada del MALDI-TOF MS para distinguir entre E. coli
y Shigella, que están muy estrechamente relacionados y tienen un
espectro de masas casi idéntico. La discriminación entre E. coli y
Shigella requerirá pruebas adicionales según las características de
los aislados.

17. • El uso de MALDI-TOF MS para la tipificación de Salmonella, lo
cual es de gran importancia para fines clínicos y
epidemiológicos, representa un desafío para los laboratorios
clínicos. Todavía se necesitan pruebas serológicas para la
tipificación de Salmonella. A veces, el MALDI-TOF MS produce
resultados de identificación de especies inciertos dentro del
género Aeromonas. Actualizaciones en las bases de datos
pueden resolver el problema con esta especie

18. Conclusiones
• El análisis de secuencias de genes es el 'estándar de oro' para
la identificación y clasificación de bacterias, mientras que el
sistema Vitek 2 es un método comercial popular comúnmente
utilizado en los laboratorios de microbiología clínica para la
identificación bacteriana. En este estudio, evaluamos el
rendimiento analítico y práctico del MALDI-TOF MS para la
identificación de enteropatógenos en nuestro laboratorio de
microbiología clínica. El MALDI-TOF MS se ha demostrado
como una herramienta simple, rápida, precisa y de bajo costo
para la identificación de enteropatógenos