Segundo seminario de la segunda clase.

1. XIII Curso de Actualización en Bioquímica Clínica
¨Prácticas Innovadoras en Bioquímica Clínica¨
Hospital Carlos G. Durand
DIVISIÓNLABORATORIO
28 abril de 2016

3. La espectrometría de masas
en la identificación
bacteriana y su impacto clínico
Marisa Almuzara
Departamento de Bioquímica Clínica.
Laboratorio de Bacteriología.
Hospital de Clínicas.
Facultad de Farmacia y Bioquímica.
Universidad de Buenos Aires

4. Identificación microbiana en el siglo XXI
1882 2015

5.  Streptococcus pneumoniae
Aislado de Hemocultivos en un paciente con
Diagnóstico clínico de NAC:
Agente etiológico de la Enfermedad Infecciosa.
Devela el agente etiológico
La importancia de la Identificación bacteriana

6. Streptococcus pyogenes
Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente con
celulitis de sus extremidades inferiores:
Bacteriemia con foco en piel y TCS
 Achromobacter xylosoxidans
Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente
pediátrico, con pielonefritis por E. coli:
Pseudobacteriemia por contaminación
Determina la importancia clínica

7.  Con Enfermedad de Base:
Streptococcus agalactiae- Diabetes
Streptococcus gallolyticus ss gallolyticus-Neoplasia
colónica.
 Con Enfermedad Infecciosa:
Streptococcus pneumoniae
Neumonía-OMA-Meningitis-PBE
Streptococcus gallolyticus ss gallolyticus
Endocarditis
RELACIONA GENERO-ESPECIE CON ENFERMEDAD

8.  Bacteriemia Primaria por Enterococcus
faecalis en paciente con neutropenia:
Traslocación colónica.
 Bacteriemia secundaria por Enterococcus
faecalis: Focos IU alta, infección intra-
abdominal
PERMITE RECONOCER LA PUERTA DE ENTRADA

9.  Permite sospechar la fuente de la infección.
 Despierta la sospecha de un brote.
1. Brote por S. equi ss zoopidemicus grupo C:
Consumo de lácteos no pasteurizados
2. Citrobacter freundii
Aislado de materiales quirúrgicos de 7 pacientes
con infecciones protésicas de mama
Los 3 pacientes fueron asistidos por el mismo Equipo de Cirugía
Brote? Fuente de Infección?

10. La identificación está estrechamente ligada a la
sensibilidad a los antibacterianos y define
muchas veces el tratamiento antimicrobiano
 Sensibilidad constante a ciertos antibacterianos:
Streptococcus pyogenes- Streptococcus
agalactiae a penicilina
 Resistencia en Enterococcus faecium

11. Métodos para la
identificación bacteriana
Convencionales
1-Pruebas bioquímicas
manuales
Esquema en tableros
Esquemas dicotómicos
(Algoritmos)
2- Identificación serológica
Comerciales
Manuales Automatizados
Fenotípicos
API
Rapi ID
Vitek
Phoenix
Microscan

12. Identificación fenotípica convencional
Características microscópicas: Coloraciones

13. Identificación fenotípica convencional
Características culturales
Tamaño de colonia
Hemólisis
Pigmento
Forma, Aspecto, Borde, Superficie

14. Identificación fenotípica convencional
Pruebas de identificación preliminar: (lectura inmediata): catalasa, oxidasa
Pruebas rápidas ( < 6h): hipurato, PYR, LAP, glicosidasas, ureasa,
indol, FAL, tributirina, tripsina, coagulasa
Pruebas lentas (24-h a 4-5 días): TSI (F/0), reducción de NO3, utilización de azúcares,
Esculina, DNAsa, gelatinasa, CAMP, almidón, RM, VP, decarboxilasas, citrato, otras
Pruebas basadas en caracteres de resistencia: O129, Vancomicina, SPS, fosfomicina,
desferrioxamina, colistina, bacitracina, optoquina
ID: 24 horas a 5-7 días

15. BNF
Algoritmos
GRUPO FLN-
GLUCOSA -
UREA + UREA-
NITRATO
+
ADH
-
Cupriavidus pauculus
PYR +
+
Laribacter
-
Etilenglicol/
Etanol
+/+
Oligella
ureolytica
FALA+/GAS
NO2+-/ DEF S
-/-
Bordetella
bronchiseptica
FALA-+/GAS NO2 -/
DEF R
ACIDO DE XILOSA
+
Achromobacter xylosoxidans
(FRU -)
-
ACIDO DE FRUCTOSA
+
Pseudomonas pseudoalcaligenes
Xilosa -/+
-
ESCULINA
-
TRIPSINA
+
NITRATO
-
MALTOSA/PYR
+
Cupriavidus
taiwanensis
(CITRATO +)
+/-
Brevundimonas
vesicularis
-/+
Inquilinus
limosus
Fenotipo
Mucoso
-
PYR
+
DEF/COL
S/R
Brevundimonas
diminuta
R/S
Pseudomonas alcaligenes
FAL- PYR -
R/R
Inquilinus limosus
PYR +
Pigmento
marrón
difusible.
FAL+++
PYR
V(20%+)
+
CITRATO
-
COLISTINA
S
NITRATO
R
Pandoraea
DEF R
+
Comamonas
SPP
-
CITRATO
CITRATO
C. aquatica/ C kerstersii
-
Cupriavidus
gilardi
DEF R
+
Advenella
incenata
DEF V
+
NITRATO
N
NITRATO
-
DEF
DEF
R
Cupriavidus
respiraculii
S
Comamonas
terrigena
+
FENILACETATO/
ClNa
-
Bordetella
hinzii
Figura 3, Grupo A: Llave para la identificación presuntiva de los bacilos gram-negativos no fermentadores FLN -, glucosa -
Pig.
rosa
Ox -
-
+
Chryseobacterium
anthropi
+
Indol
-
Roseomonas / Asaia
Urea
+
Roseomonas
-
Asaia
-
Pig. Marrón
difusible
Colonia
pequeña-
Kerstersia
-
B. holmesii
+
B. parapertussis
+
Sphingomonas spp
(Esc + ONPG +
Mani - Lac +)
EO-5 (Esc -
Pig. Amarillo)
Granullibacter
bethesdensis
(Lactosa -)
Urea
+
Bordetella holmesii
B. parapertussis
Kerstersia
-
Mov -
Pig. amarillo
+
Nitrato
V
B. mallei
Mac Conkey +
Lactosa V
+
rápida
Brucella canis
Mac Conkey V
Lactosa -
Urea
+
+
C. anthropi
-
Acinetobacter spp
Indol
-
-
NO-1
(Fastidioso)
Pig.
rosa
Ox -
-
+
Chryseobacterium
anthropi
+
Indol
-
Roseomonas / Asaia
Urea
+
Roseomonas
-
Asaia
-
Pig. Marrón
difusible
Colonia
pequeña-
Kerstersia
-
B. holmesii
+
B. parapertussis
+
Sphingomonas spp
(Esc + ONPG +
Mani - Lac +)
EO-5 (Esc -
Pig. Amarillo)
Granullibacter
bethesdensis
(Lactosa -)
Urea
+
Bordetella holmesii
B. parapertussis
Kerstersia
-
Mov -
Pig. amarillo
+
Nitrato
V
B. mallei
Mac Conkey +
Lactosa V
+
rápida
Brucella canis
Mac Conkey V
Lactosa -
Urea
+
+
C. anthropi
-
Acinetobacter spp
Indol
-
-
NO-1
(Fastidioso)
BNF

16. Acinetobacter spp.
ID Presuntiva: 24 horas
4 pruebas

17. Cardiobacterium hominisID presuntiva: 4-5 díasID : 4-5 dias

18. Métodos fenotípicos de
identificación
Comerciales
Automatizados
VITEK
PHOENIX
Microscan
Manuales
API
Rapid ID Remel
ID: 24-48 HS; Rapid: 4 hs ID: 2 a 10 hs

19. Paneles de identificación

20. Identificación fenotípica por galerias comerciales
N 188
93,10 % ID correcta (n 175)
32.45 % (n 61): requirió de pruebas adicionales
(Vay y col, 2004. RAM)
Tiempo de ID: 48 Horas
Si pruebas adicionales: 3 -4 días

21. Identificación fenotípica por galerías comerciales
N 178
91 % ID correcta (n 162)
24.7 % requirió de pruebas adicionales ( n 44)
API Coryne Versión (2.0)
Lectura: 24 horas
48-72 hs si pruebas adicionales

22. Identificación por sistemas comerciales automatizados
ID : menos de 10 hsBase de datos: aprox 659 taxas BGN, 114
CGP; 26 NH; 16 BGP; 47 Anaerobios N: 445 (87 % ID correcta)
64 pocillos de ID

23. Métodos Genotípicos para la identificación
bacteriana
Biología Molecular
PCR convencional: Seq r RNA ribosomal 16 s, otros genes
(rpo B, gyr B, rec A)
MLSA (Análisis multilocus de secuencias)
Hibridación DNA-DNA

24. Otros métodos de identificación:
Proteómica
Perfiles de componentes bacterianos Espectrométricos
Espectrometría de
masaPerfil electroforético de Proteínas totales
(SDS-PAGE)
MALDI TOF

25. CID, 2013
1996

27. Haemo-
philus sp.
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Number of papers
Mycobacteria
Entero-
bacter-
iaceae
Identificación microbiana
Espectrometría de masa
Based on Seng et al. CID 2009;49:543
Listeria sp
Erwinia sp..
Salmonella sp
Clostridium sp.
S. pneumoniae
Vagococcus sp.
Enterococcus sp.
B. cepacia complex
Oral anaerobes
Gram-negative bacilli
Gram-negative bacilli
Pioneering
B. subtilis, E. coli
Bacillus spores
H. pylori
Enterobacteriaceae
S. aureus
Viridans
streptococci
F. tularensis
B. cereus
S. aureus
Multiple
Gram-positive
S. aureus
S. aureus
S. aureus
Arthrobacter sp.
S. aureus
Mycobacteria
Mycobacteria
H. pylori
Salmonella
Blood culture bottles
Gram-negative bacilli
R. erythropolis
Bartonella sp.
Neisseria sp.
S. agalactiae
Vibrio sp.
Multiple
Multiple
Yeast
Staphylococci
Viridans
streptococci
E. coli
2009

28. MALDI TOF en Argentina

29. MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-
Time Of Flight
(Vaporización/ionización por láser asistida por matriz a través
de la detección de masas acorde al tiempo de vuelo)
5495.0
5417.9
4470.0
6264.1
10835.4
7274.5
7122.5
4736.2
9589.7
7828.2
8021.2
8847.6
8369.5
10259.6
10051.3
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
4x10
5000
6000 7000 8000 9000 10000 m/z
MALDI-TOF es una tecnología que ofrece un patrón de proteínas de un organismo
desconocido y compara este patrón con una librería para finalmente presentar un score de
esa comparación.
Bruker Daltonics Inc, USA (Base de datos
propia)
Shimadzu Corporation, Japón (Base de datos
SARAMIS)
Otra Base de datos: Andromas

30. MALDI-TOF
Hospital de Clínicas José de San Martín. UBA

31. 1) Aislamiento de
cultivo primario
(6)
Interpretación
de resultados
(6) Interpretación de datos
por MALDI Biotyper
(2) Seleccionar 1 colonia (3) Realizar
extendido (capa
fina) en un pocillo de
la placa metálica:
96 a 384 pocillos
(5) Generar perfil de
espectro por MALDI-
TOF
(4) Agregar Matriz
(sc de ác α ciano 4
hidroxi cinámico,
acetonitrilo y ácido
trifluoroacético)
Flujo de trabajo
Tiempo de resultado por muestra: 3-5 minutos

32. Preparación de la muestra
a. Extendido directo o extracción directa con fórmico
b. Extracción con etanol-ácido fórmico-acetonitrilo
10 min
H2Od Etanol
Etanol
FA,
Acetonitrile

33. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
+ +
+
+
Medición en MALDI TOF

34. Tabla de resultados

35. Qué tipo de score aceptamos?
• Fabricante
• > 2 nivel de especie
• > 1,7 - < 2 nivel de género
• < 1,7 Identificación no confiable: No se
acepta
Se puede modificar este score:
Mediante la validación de grupos
De Bel et al, propone criterio LAC > 1,8 (25% más de iD correcta) JMM, 2011

38. MALDI TOF
Semejante al método molecular
(Gold standard)

39. Identificación fenotípica
ClNa 6,5%+
PYR+
Bilis esculina +
ADH + Piruvato -
Estreptococos no β hemolíticos
vancomicina S

40. +
E. casseliflavus
-
E. mundtii
+
MOVILIDAD
+
E. haemoperoxidus
-
TELURITO
-
a Me GLUCÓSIDO
+
E. gallinarum
a Me glu +
Xil +
-
E. faecium
a Me glu -
Xil -
+
MOVILIDAD
ARABINOSA
-
+
PIGMENTO
+
E. faecium
+/+
E. hirae (ONPG+)
S. urinalis (ONPG-)
-/-
TREHALOSA /
XILOSA
-
RAFINOSA/ SACAROSA
-
ARABINOSA
MANITOL
+ w
E. sanguinicola
-
Lactococcus spp
CLINDA S
L. lactis
CLINDA R
L. garvieae
-/+
E. canintestini
+/+
E. villorum -/-
E. ratti
+/-
E. durans
• Maldi-tof:
• 2,328 Lactococcus lactis
Seq 16 s
Lactococcus lactis 99%

41. Evaluación de la espectrometría de masa
(MALDI-TOF) en la identificación de
bacterias de impacto clínico.

42. MALDI TOF Y BNF

43. 39
25
13
2
3 P. fluorescens/P. putida
P. aeruginosa
P. stutzeri group
P. fulva
P. oryzihabitans
n 82
46
4
8
2 9
n 69 Achromobacter spp
A. faecalis
Bordetella spp.
Kerstersia gyorium
Oligella urethralis
Incluye: B. bronchiseptica 3; B. hinzii 2; B. trematum 2; B.
parapertussis 1
34
6
2
4 1 1
Complejo B.
cepacia
Burkholderia
gladioli
Ralstonia picketti
Pandoraea spp.
Cupriavidus
pauculus
Inquilinus limosus
n 48
34 15
25
77
52
n 201 Flia Flavobacteriaceae
Flia Comamonadaceae
S. maltophilia
Acinetobacter spp.
Otros BNF
 Otros BNF: Rhizobium radiobacter (4), Pannonibacter phragmitetus (14), Shewanella spp. (13), Ochrobactrum (8), Brevundimonas
spp. (9), , Wohlfahrtiimonas chitiniclastica(1); Sphingomonas paucimobilis (2)
Aislados: n: 396. Período: 2009-2013

44. MALDI-TOF en la identificación de BNF
256
112
24 4
Identificación
ID especie
ID genero/grupo
ID erronea
ID no confiable
n 396
Tiempo ID: 3 a 5 min
93 % ID género + especie
6 % ID errónea
1 % no ID

45. Identificación de BNF por MALDI TOF
Limitaciones
• Achromobacter spp no identifica a nivel de especie (idem id
16S rRNA)
• Identifica Pseudomonas grupo putida y P. grupo fluorescens
• Identifica especies del complejo BC. En ocasiones no
identifica B.cepacia, B. contaminans, B. lata
• Identifica a nivel especie los géneros de flia Flavobacteriaceae
excepto Elizabethkingiae (meningoseptica/miricola)
• Dificultad en la identificación de Ochrobactrum spp.
• Identifica especies de Pandorae, Shewanella (-S. algae),
Ralstonia (-R. mannitinolytica)
• Identifica especies poco frecuentes: Wautersiella falsenii, W.
chitiniclastica, C. kerstersii, K. gyorium, Bordetella spp, P.
phragmitetus

46. • TSI Sin cambio
• Oxidasa +
• Inmóvil
• Glucosa +
• Indol +
• Gelatina +
• Almidon +
• Esculina +
• Manitol -
• ONPG +
• Colistina R
• Vancomicina Halo
• Pigmento Amarillo intenso
Chryseobacterium gleum indologenes
12 Pruebas
Tiempo de ID: 4-5 días

47. Enterobacterias y Malditof

48. 57
1
30
16
4
2
Escherichia coli
Escherichia
vulneris
Complejo
Citrobacter
freundii
Citrobacter koseri
Citrobacter
amalonaticus
Citrobacter farmeri
80
1690
39
2 1 2
Klebsiella
pneumoniae
Klebsiella
oxytoca
E. cloacae
complex
Serratia
marcescens
Serratia
liquefaciens
E. gergoviae
E. agglomerans
31
18
5
26
15
10
2
Proetus mirabilis
Proteus vulgaris
Proteus penneri
Morganella morganii
Providencia stuartii
Providencia retgeri
Providencia
alcalifaciens
1
7
8
8
4
1
Edwarsiella tarda
Yersinia enterocolytica
Salmonella enterica
L. adecarboxylata
Hafnia alvei
Ewingella americana
N: 476
Enterobacteriaceae

49. MALDI-TOF en la identificación de
Enterobacteriaceae
15
399
60
1
Identificación ID genero
ID especie
Baja
discriminacion
ID incorrecta
No ID
n 476
Tiempo ID: 3 a 5 min
83.8 % ID especie
99.79 % ID género
12.60 % BD
0.21 % ID Incorrecta
0.21 % No ID

50. Identificación de
Enterobacteriaceae por Malditof
Excelente performance para la ID de Enterobacteriaceae excepto:
 Enterobacter cloacae complex
 Proteus vulgaris/Proteus penneri
 Serratia marcescens-Serratia ureolytica
 Complejo K. pneumoniae/Complejo K. oxytoca
 Citrobacter amalonaticus/Citrobacter farmeri
 Complejo Citrobacter freundii
 Shigella-E. coli

51. Enterobacterias y MalditofCGP Catalasa negativa y MALDI TOF

52. 20
20
11
11
9
7
7
2
1
5
1
E. faecalis
E. faecium
E. raffinosus
E. casselifalvus
E. avium
E. gallinarum
E. hirae
E. mundtii
E. devresei
E. durans
E. malodoratus
ID Especie : 95,6 % (Score > 2.00)
ID Especie 100 % (Score > 1.7)
N 96
Enterococcus spp.

53. 8
3
4
9
1
5
10
2
5
1 1 6
N 55
L. mesenteroides
L. pseudomesenteroides
L. lactis
Lactococcus lactis
Lactococcus garvieae
Abiotrophia defectiva
Granulicatella adiacens
Granulicatella elegans
Globicatella sanguinis
Facklamia hominis
Weissella viridescens
Vagococcus spp.
11
5
7
3
5
2
1 4
1
n 39
Aerococcus viridans
Aerococcus urinae
Helcococcus kunzii
Gemella morbillorum
Gemella haemolysans
Gemella sanguinis
Pediococcus
acidilactici
Pediococcus
pentosaceus
Facklamia languida
ID especie: 64.89 (score > .2.0)
88,29(score > 1.7)
ID No confiable: 4.25 %
N total: 94

54. Conclusiones
Los puntos de corte más bajo permiten aumentar el porcentaje de
ID correcta a nivel de especie, particularmente en los cocos cat neg
infrecuentes a expensas de Aerococcus viridans.
La extracción etanólica no muestra diferencias significativas con el
método directo de extracción con ácido fórmico.

55. Bacilos gram-positivos y MALDI TOF

56. Corynebacterium spp.
Otros: C. afermentans ss lipophilum 4; C. grupo F; C. mucifaciens; C. diphtheriae; C. simulans; C.
afermentans ss liphophilum; C. coyleae; C. imitans; C. kroppenstedtii; C. bovis; C.durum, C.
macginlenyi; C. minutissimum; C. pseudotuberculosis; C. riegelii; C. ulcerans, C . xerosis

57. Identificación por MALDI-TOF
4 Género: C. aurimucosum/ C. minutissimum
5NID: C. urealyticum, C. afermentans, Cafermentans ss lipophilum, C. tuberculostearicum
5 ID incorrecta: C. amycolatum/ aurimucosum, C pseduodiphteriticum/ propinquum, C.
afermentans ss lipophilum/ C. jeikeium, C. minutissimum/ C. amycolatum, C. coylae/ C
afermentans
Nivel género 97,7% género y Nivel especie 93,5 %

58. Algoritmo de identificación de BGP
LLAVE 6b
CAMP
I
Indol
-
I
Nitrato / Urea
+
P. acnes
+ / +
I
FAL
-/ +
I
a glucosidasa
+ / -
I
FAL
-/ -
I
FAL
-
C. durum
(manitol +)
+
C. amycolatum
(manitol -)
+
C.
sundsvallense
-
I
b NAG
-
C. durum
(adherente)
+
I
Tirosina
+
I
Tirosina
-
I
Maltosa
+
C. thomsenii
(Dnasa + 48 h)
-
I
PYR
+
I
Etilenglicol
-
I
Maltosa
+
I
Maltosa
-
Sacarosa
+
C. singulare
-
I
Pigmento
amarillo
+
C. falsenii
(Nitrato -,
PYZ + d ébil)
-
C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / +
C. striatum
- / -
C. simulans
-
C. confusum
+
I
Col punti (<0.5)
No lipofílico
+
C. freneyi
-
I
H+ glu 42º
+ / +
C. amycolatum
-/ +
C. xerosis
+
C.
argentoratense
-
C.
hansenii
+
I
DNasa
-
+
C. amycolatum
(col. seca)
-
I
a quimiotripsina
-
C. tuscani
C. amycolatum
+
C. argentoratense
+
C. minutissimum
(col. lisa)
-
C. aurumucosum
(col. mucosa)
LLAVE 6b
CAMP
I
Indol
-
I
Nitrato / Urea
+
P. acnes
+ / +
I
FAL
- / +
I
a glucosidasa
+ / -
I
FAL
- / -
I
FAL
-
C. durum
(manitol +)
+
C. amycolatum
(manitol -)
+
C.
sundsvallense
-
I
b NAG
-
C. durum
(adherente)
+
I
Tirosina
+
I
Tirosina
-
I
Maltosa
+
C. thomsenii
(Dnasa + 48 h)
-
I
PYR
+
I
Etilenglicol
-
I
Maltosa
+
I
Maltosa
-
Sacarosa
+
C. singulare
-
I
Pigmento
amarillo
+
C. falsenii
(Nitrato -,
PYZ + d ébil)
-
C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / +
C. striatum
- / -
C. simulans
-
C. confusum
+
I
Col punti (<0.5)
No lipofílico
+
C. freneyi
-
I
H+ glu 42º
+ / +
C. amycolatum
- / +
C. xerosis
+
C.
argentoratense
-
C.
hansenii
+
I
DNasa
-
+
C. amycolatum
(col. seca)
-
I
a quimiotripsina
-
C. tuscani
C. amycolatum
+
C. argentoratense
+
C. minutissimum
(col. lisa)
-
C. aurumucosum
(col. mucosa)
CAMP
I
Indol
-
I
Nitrato / Urea
+
P. acnes
+ / +
I
FAL
- / +
I
a glucosidasa
+ / -
I
FAL
- / -
I
FAL
-
C. durum
(manitol +)
+
C. amycolatum
(manitol -)
+
C.
sundsvallense
-
I
b NAG
-
C. durum
(adherente)
+
I
Tirosina
+
I
Tirosina
-
I
Maltosa
+
C. thomsenii
(Dnasa + 48 h)
-
I
PYR
+
I
Etilenglicol
-
I
Maltosa
+
I
Maltosa
-
Sacarosa
+
C. singulare
-
I
Pigmento
amarillo
+
C. falsenii
(Nitrato -,
PYZ + d ébil)
-
C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / +
C. striatum
- / -
C. simulans
-
C. confusum
+
I
Col punti (<0.5)
No lipofílico
+
C. freneyi
-
I
H+ glu 42º
+ / +
C. amycolatum
- / +
C. xerosis
+
C.
argentoratense
-
C.
hansenii
+
I
DNasa
-
+
C. amycolatum
(col. seca)
-
I
a quimiotripsina
-
C. tuscani
C. amycolatum
+
C. argentoratense
+
C. minutissimum
(col. lisa)
-
C. aurumucosum
(col. mucosa)
CAMP
I
Indol
-
I
Nitrato / Urea
+
P. acnes
+ / +
I
FAL
- / +
I
a glucosidasa
+ / -
I
FAL
- / -
I
FAL
-
C. durum
(manitol +)
+
C. amycolatum
(manitol -)
+
C.
sundsvallense
-
I
b NAG
-
C. durum
(adherente)
+
I
Tirosina
+
I
Tirosina
-
I
Maltosa
+
C. thomsenii
(Dnasa + 48 h)
-
I
PYR
+
I
Etilenglicol
-
I
Maltosa
+
I
Maltosa
-
Sacarosa
+
C. singulare
-
I
Pigmento
amarillo
+
C. falsenii
(Nitrato -,
PYZ + d ébil)
-
C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / +
C.C. striatum
- / -
C. simulans
-
C. confusum
+
I
Col punti (<0.5)
No lipofílico
+
C. freneyi
-
I
H+ glu 42º
+ / +
C. amycolatum
- / +
C. xerosis
+
C.
argentoratense
-
C.
hansenii
+
I
DNasa
-
+
C. amycolatum
(col. seca)
-
I
a quimiotripsina
-
C. tuscani
C. amycolatum
+
C. argentoratense
+
C. minutissimum
(col. lisa)
-
C. aurumucosum
(col. mucosa)
ID C. striatum
ID algoritmo: 16 pruebas
bioquímicas (viene de 2
llaves previas)
Tiempo ID: 4- 5 días

59. Actinomyces y géneros relacionados
7
11
6
5
510
10
6
11
n 71
A. turicensis
A. radingae
A. urogenitalis
A. odontolyticus
A. naeslundii/A.
viscosus
A. neuii
A. schalii
A. haemolyticum
Otros
Otros: A. graevenitzii; Varibaculum cambriense; T. bernardiae; Propionibacterium
spp.; Bifidobacterium scardovii

60. Identificación por MALDI-TOF
65
2 3 1
Actinomyces y géneros relacionados (n: 71)
ID correcta
ID incorrecta
No ID
ID género
Nivel Género: 95,8% Nivel Especie: 91,5 %
Tiempo ID: 3-5 min

61. Presentan exigencia nutricional
Escasa reactividad en las pruebas bioquímicas

Géneros Actinomyces, Arcanobacterium y
Actinobaculum spp.
Tiempo de Identificación: aprox 7 días
Actinomyces europaeus
Actinobaculum schaalii

62. Algoritmo de identificación fenotípico para
Actinomyces y relacionados
Llave 2
b hemólisis marcada
-
I
Esculina / Urea
+
Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes
(PYR - , b gur +)
+ / +
Actinomyces naeslundii
incluye A. naeslundii,
A. oris, A. johnsonii
- / +
I
b gur
+ / -
I
Nitrato
- / -
Llave 2a
+
Actinobaculum
urinale
(hipurato +)
-
Actinomyces
naeslundii
+
I
bNAG
-
I
Glucosa
-
I
b gal
+
Actinomyces
urogenitalis
(colonia semejante
a estafilococo)
-
Actinomyces
nasicola
+
I
Xilosa
-
Rothia aeria /dentocariosa
+
I
Pigmento rojo
-
I
Rafinosa
+
I
b gal
+
Actinomyces
Odontolyticus
-
- Actinomyces israelli
- Actinomyces naeslundi
/ viscosus
+
I
Melibiosa
-
Actinomyces
europaeus
-
Actinomyces bovis
+
I
b NAG
+
Actinomyces
dentalis
-
Actinomyces
oricola
-
I
Rafinosa
+
Actinomyces
radingae
-
Actinomyces georgiae
+
Actinomyces gerencseriae
Llave 2
b hemólisis marcada
-
I
Esculina / Urea
+
Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes
(PYR - , b gur +)
+ / +
Actinomyces naeslundii
incluye A. naeslundii,
A. oris, A. johnsonii
- / +
I
b gur
+ / -
I
Nitrato
- / -
Llave 2a
+
Actinobaculum
urinale
(hipurato +)
-
Actinomyces
naeslundii
+
I
bNAG
-
I
Glucosa
-
I
b gal
+
Actinomyces
urogenitalis
(colonia semejante
a estafilococo)
-
Actinomyces
nasicola
+
I
Xilosa
-
Rothia aeria /dentocariosa
+
I
Pigmento rojo
-
I
Rafinosa
+
I
b gal
+
Actinomyces
Odontolyticus
-
- Actinomyces israelli
- Actinomyces naeslundi
/ viscosus
+
I
Melibiosa
-
Actinomyces
europaeus
-
Actinomyces bovis
+
I
b NAG
+
Actinomyces
dentalis
-
Actinomyces
oricola
-
I
Rafinosa
+
Actinomyces
radingae
-
Actinomyces georgiae
+
Actinomyces gerencseriae
b hemólisis marcada
-
I
Esculina / Urea
+
Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes
(PYR - , b gur +)
+ / +
Actinomyces naeslundii
incluye A. naeslundii,
A. oris, A. johnsonii
- / +
I
b gur
+ / -
I
Nitrato
- / -
Llave 2a
+
Actinobaculum
urinale
(hipurato +)
-
Actinomyces
naeslundii
+
I
bNAG
-
I
Glucosa
-
I
b gal
+
Actinomyces
urogenitalis
(colonia semejante
a estafilococo)
-
Actinomyces
nasicola
+
I
Xilosa
-
Rothia aeria /dentocariosa
+
I
Pigmento rojo
-
I
Rafinosa
+
I
b gal
+
Actinomyces
Odontolyticus
-
- Actinomyces israelli
- Actinomyces naeslundi
/ viscosus
+
I
Melibiosa
-
Actinomyces
europaeus
-
Actinomyces bovis
+
I
b NAG
+
Actinomyces
dentalis
-
Actinomyces
oricola
-
I
Rafinosa
+
Actinomyces
radingae
-
Actinomyces georgiae
+
Actinomyces gerencseriae
ID: 16 Pruebas bioquímicas Tiempo ID: 5 a 7 días
Actinomyces radingae

63. Microorganismo
Leifsonia spp (n:1)
Exiguobacterium spp (n:3)
Brevibacterium spp (n:3)
Microbacterium spp (n:6)
Arthrobacter spp (n: 1)
Cellulosimicrobium spp (n:2)
Turicella spp (n: 2)
Rothia spp (n:2)
Dermabacter spp (n:10)
Clostridium tertium (n:1)
Listeria monocytogenes (n:4)
Lactobacillus spp (n:3)
Rhodococcus equi (n:2)
Gordonia spp (n:3)
Dietzia spp (n: 3)
Identificación por MALDI-TOF
Bacilos Gram-positivos aerobios n= 46
Nivel Género: 93,5%
Nivel Especie: 86,9%
No ID: Leifsonia (1), Exiguobacterium (1),
Dietzia (1)
Género: Microbacterium (2), Gordonia (1)
Rothia aeria R. equi Microbacterium

64. ID 322
96,9% (IC95% 94,5-98,6)
ID 307
ID incorrecta 7
92,2% (IC95% 88,8-94,8)
n: 333 BGP
Tiempo ID: 3 a 5 min

65. Conclusiones
 Se obtuvo aproximadamente más del 20% de aislados identificados
con MALDI-TOF a nivel de especie utilizando score >1,7
(Corynebacterium spp: 22,7%; Actinomyces spp: 33,8%; Otros BGP:
17,4%) por lo tanto se puede disminuir el score recomendado por el
fabricante para aumentar el % de ID
 La ID por MALDI-TOF permitió reconocer especies atípicas: C.
amycolatum y C. simulans lipofílicos y C. urealyticum urea negativa,
que no pueden ID por métodos convencionales
 Los errores en la ID a nivel de especie ocurrieron principalmente
entre especies relacionadas filogenéticamente

66. HACEK y MALDI TOF

67. MALDITOF y HACEK
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
A.ureae
A.…
A.aphrophilus
A.segnis
Capnocytophagaspp
Cardiobacterium…
Dysgonomonas…
Dysgonomonasgadei
Eikenellacorrodens
Haemophilusinfluenzae
Haemophilus…
Haemophilus…
Kingellaspp.
Leptotrichiatravisani
ID Erronea
No ID
Especie
Genero

68. 0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Incorrecto
No id
Especie
Genero
MALDITOF y HACEK

69. MALDI TOF y HACEK
152144
2
HACEK
Genero
Especie
ID no
confiable
ID incorrecta
N 155
98.% genero
92.9 % especie
1.3 % no confiable
0.6 % ID incorrecta
Scores: > 1.5 (Género)
> 1.7 (Especie)
< 1.5 (No ID confiable)3 a 5 minutos!!

70. Eikenella corrodens
LDC ODC
T
T
e
s
t
i
g
o
G
l
u
c
o
s
a
b-
Tpo ID: 3 a 4 días

71. A. aphrophilus
ONPG
Lactosa
cb-
Tiempo de ID: 3 a 5 días

72. MALDI TOF y HACEK. Conclusiones
 MALDI-TOF MS es una herramienta poderosa
para la identificación de los miembros del grupo
HACEK y otros bacilos fastidiosos.
 La tasa de identificación no se mejora con
procedimiento de extracción etanol-ácido
fórmico (FA)- Acetonitrilo.
 La disminución de los scores de identificación
puede mejorar el rendimiento de MALDI-TOF.

74. Identificación directa a partir de
hemocultivos
• Separación de células (leucocitos,
eritrocitos) por centrifugación
• Lisis de las células (Agua destilada,
saponina, cloruro de amonio, SDS)
• Centrifugación y lavado
• Precipitación de las proteínas con
etanol
• Extracción proteica con AN y AF

75. MALDI TOF DIRECTO SOBRE BOTELLAS
POSITIVAS DE HEMOCULTIVO
• Identificación directa sobre botellas de hemocultivos positivas
• 1 mL de hemocultivo
• 300 mL de buffer de lisis.
• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante
• 900 mL de buffer de lavado.
• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante
• 300 mL etanol
• 900 mL agua pura
• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante
• Extracción con ácido fórmico
Tiempo de
procesamiento
20 minutos
kit comercial MALDI Sepsityper(Bruker
Daltonic)

76. SDS/Ac Fórmico
Agua/Etanol/Formico/Acetonitrilo

77. Identificación por MALDITOF.
Impacto clínico
• Paciente con linfoma, febril, sin
tratamiento antibiótico
• Gram de 1 de 2 frascos de hemocultivos:
BGP corineformes
• ID por Malditof a partir del frasco:
• Tiempo de informe: 30 minutos
• El paciente recibe tratamiento con
Ampicilina + gentamicina
No Contaminante. Cambio de conducta
terapéutica
Listeria monocytogenes

78. Identificación por MALDITOF.
Impacto clínico
Paciente con linfoma, febril, sin
tratamiento antibiótico
Gram a partir de 1 de 2 frascos de
hemocultivos: BGP corineformes
ID por Malditof a partir del frasco:

Punta de cateter: Negativa
Corynebacterium striatum
Interpretación: probable contaminante. No
cambio de conducta terapéutica

79. Identificación por MALDITOF.
Impacto clínico
• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de
bacteriemia asociada a catéter
• Tratamiento empirico: vanco + imipenem
• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram:
CGP en racimos
• ID por Malditof a partir del frasco:
Frasco 1: S. epidermidis
Frasco 2: S. simulans
Retrocultivo: negativo
• Tiempo de informe: 30 minutos
hay modificación de la conducta terapéutica

80. Identificación por MALDITOF.
Impacto clínico
• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de
bacteriemia asociada a catéter
• Tratamiento empírico: vanco + imipenem
• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram:
CGP en racimos
• ID por Malditof a partir del frasco:
Frasco 1: S. epidermidis
Frasco 2: S. epidemidis
Retrocultivo: S. epidermidis
• Tiempo de informe: 30 minutos
Hay modificación de la conducta terapéutica

81.  Tres Hemocultivos positivos por bacilos
gram-positivos pleomórficos en paciente
pediátrico con sospecha de EI de válvula nativa.
 MALDITOF: Granulicatella adiacens
Impacto clínico: se instauró : penicilina +
gentamicina a dosis de EI 4 semanas (las 2 drogas)
Impacto clínico de la identificación rápida a
partir de hemocultivos

82. MALDITOF en la emergencia
de nuevos patógenos

83. Cultivo: 72 horas de incubación
Coloración de Gram del urocultivoImportancia de la identificación
rápida en la jerarquización clínica
Paciente masculino. 22 años.
Sindrome nefrotico. HTA por
glomerulonefritis. Reagudización de
su IRC. Dialisis trisemanal. TTO
empírico. TMS

84. 99 % identidad con Actinobaculum schaalii
Identificación molecular:
Secuenciación del 16S rRNA
Identificación por Espectrometría de masa:
MALDITOF

85. Algoritmo de identificación fenotípico
Llave 1

86. CAMP –
MRS /Vanco
Algoritmo de identificación
Esc -/urea- /NO3-

- Pyz /PYR / Hip /Trib
+ / V /-/nd

A. bernardiae
- / - /+/-

A. turicensis
v / v /+/+

Actinobaculum schaalii
+++/ R
Lactobacillus (II III)
(+) / S
Lactobacillus (I)
Bifidobacterium
Alloscardovia
- /S
No β
hemólisis
Gram
4 -5 días
15 pruebas

87. Actinobaculum schaalii: identificación
Vancomicina
MRS
Nitrato urea Esculina
Pyr
Hipurato Tributirina
SPS

88. Identificación por MALDITOF.
Impacto clínico
• Permitió modificar la conducta terapéutica:
• Se suspendió el tratamiento con TMS y el
paciente recibio penicilina 1.500.000 UI
c/12h por 14 días
• Permite atribuir el verdadero significado
clínico a estos microorganismos en casos de
piuria crónica inexplicable

89. 1997: Descripción de una nueva especie: paciente sexo masculino, 64
años, pielonefritis crónica
2003: Pielonefritis en niño con obstrucción pieloureteral
(Eur J Clin Microbiol Inf Dis. 22, 438-40)
2005: ✓A. schaalii y A. urinale en paciente con falla renal crónica
✓10 casos de IU en pacientes con factores predisponentes
2010: Un patógeno común en Dinamarca
1era publicación en Estados Unidos
(Diagnostic Microbiology & Infectious Disease 67, 282-285)
2011: Observación de 20 casos (Suiza)
2012: Primer reporte de IU, paciente 75 años, masculino, en Canadá
IU en niño de 8 meses (Suiza)
2013: Actinobaculum schaalii: an emergent uropathogen in Argentina

90. Métodos de Identificación
 Identificación convencional: 24 horas a 5-
7 días.
 Identificación por galerías comerciales:
 Lectura rápida: 4 horas
 Lectura habitual: 24 a 48 horas
 Identificación por sistemas automatizados:
2 a 10 Horas
Maldi tof: 3 a 5 min!!! (96 muestras/hora)
B
a
s
e
d
e
d
a
t
o
s
L
i
m
i
t
a
d
a

91. MALDI TOF: Otras Aplicaciones
en Microbiología
• Aplicación directa sobre muestras
clínicas (urocultivo, hemocultivos)
• Detección de factores de virulencia
(Toxinas)
• Detección de mecanismos de resistencia
• Tipificación molecular

92. MALDI TOF: Elección de un equipo

94. Conclusiones
MALDI TOF
 Identificación rápida y precisa
 Base de datos para un amplio espectro de bacterias
 Herramienta útil para identificar especies “raras” o
infrecuentes en infecciones humanas
 La aplicación de MALDI TOF sobre muestra directa en
particular los HC es una de las aplicaciones más
prometedoras

95. Conclusiones
MALDI TOF supera por la exactitud y
rapidez a la identificación fenotípica y
molecular hasta ahora conocida

96. Conclusiones
MALDI TOF
 Por la rapidez y fiabilidad EM está destinada a
convertirse en un técnica básica de identificación de
bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología
Clínica, desplazando en una parte muy importante a las
técnicas de rutina actuales.
 Aunque las técnicas genéticas probablemente sigan
siendo las de referencia, su uso se verá reducido a
aquellos microorganismos cuya identificación no se
consiga con EM.
5495.0
5417.9
4470.0
6264.1
10835.4
7274.5
7122.5
4736.2
9589.7
7828.2
8021.2
8847.6
8369.5
10259.6
10051.3
4
5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/
z

98. MUCHAS GRACIAS