El documento describe diferentes técnicas de citogenética clásica y molecular utilizadas para caracterizar cromosomas y detectar cromosomopatías. Explica el cariotipo con bandeo G, que permite visualizar anomalías estructurales grandes y numéricas con una resolución de 5-10 Mb. También describe técnicas moleculares como FISH, microarrays y MLPA que ofrecen mayor resolución para detectar deleciones, duplicaciones y otros desequilibrios cromosómicos.

1. CROMOSOMOPATÍAS I:
TÉCNICAS DE
CITOGENETICA CLÁSICA Y
MOLECULAR

2. OBJETIVOS
► Repaso del concepto de cromosomas eucariotas y sus secuencias
estructurales
► Técnicas utilizadas para caracterizar a los cromosomas y su
aplicación en las salud
► Técnica de citogenética clásica 🡪 cariotipo con bandeo G
► Técnicas de citogenética molecular 🡪FISH; ARRAY-CGH; MLPA

3. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE
LOS CROMOSOMAS

4. Clasificación según la posición del
centrómero

5. ► Metacéntricos grandes: 1 a 3
► Submetacéntricos grandes: 4 y 5
► Submetacéntricos medianos: 6 a 12 y X
► Acrocéntricos medianos: 13 a 15
► Submetacéntricos pequeños: 16 a 18
► Metacéntricos pequeños: 19 y 20
► Acrocéntricos pequeños: 21, 22 e Y

6. PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DE
LAS CORMOSOMOPATÍAS
► NUMÉRICAS
► Euploidía: células que contienen un múltiplo de 23 cromosomas en su
núcleo. Normalmente, 46, xx o 46, xy
► Poliploidía: presencia de un conjunto o más completos adicionales en una
célula. EJEMPLOS: Triploidia (69, xxx o 69, xxy); tetraploidía (92, xxxx o 92,
xxxxy)
► Aneuploidias: células que contienen cromosomas individuales ausentes o
adicionales (no son múltiplo de 23)
► Monosonias: presencia de una sola copia de un cromosoma en una célula que
debería ser diploide.
► Trisomias: tres copias de un cromosoma en una célula que debería ser diploide.
Consecuencias menos graves que una monosomia ya que “el cuerpo puede
tolerar un exceso de material genético con mayor facilidad que su falta”

7. ► ESTRUCTURALES
► Deleción

8. ► ESTRUCTURALES
► Duplicación

9. ► ESTRUCTURALES
► inversión

10. ► ESTRUCTURALES
► translocación

11. ¿Cómo debería ser o qué debería
mostrar una técnica para poder
visualizar estas anomalías?

12. TÉCNICA FUNDAMENTO APLICACIÓN CLÍNICA RESOLUCIÓN
CARIOTIPO CON
BANDEO G
FISH
MICROARRAY
MLPA
PARA EL FINAL DE LA CLASE DEBERIAMOS PODER COMPLETAR ESTE
CUADRO

13. CITOGENÉTICA CLÁSICA
CARIOTPO CON BANDEO G

14. CARIOTIPO CON BANDEO
• Método que se utiliza para visualizar directamente los
cromosomas
• Técnicas de tinción para producir las bandas
cromosómicas características de los cariotipos
• Gran utilidad en la detección de deleciones,
duplicaciones y otras anomalías cromosómicas (tanto
estructurales grandes como numéricas).

15. CARIOTIPO INDIVDUOS CON
SEXO CROMOSÓMICO XX
46,XX
CARIOTIPO DE SEXO
CROMOSÓMICO XY
46,XY

16. Técnica de cultivo de linfocitos
► Obtención de muestra (sangre), cultivar aprox por 72Hs, luego se
añade colchicina (inhibe la división celular deteniendo el ciclo en
metafase o anafase al inhibir la polimerización de los huso mióticos)
► Luego se pueden hacer barios tipos de tinción
► Bandeo G🡪 giemsa
► Bandeo Q
► Bandeo R
► Bandeo de alta resolución

17. Cromosomas metafásico con patrón de
bandas G (bandeo G):
• Bandas oscuras o G+: son ricas en A-T,
se replican tardíamente y son pobres en
genes constitutivos
• Bandas claras o G-: son ricas en C-G, se
replican tempranamente y son ricas en
genes constitutivos
• Resolución: 5-10 Mb

18. Niveles de resolución y porciones de los cromosmas
CROMOSOMA 1
Tamaño 263 Mb
El distinto grado de
condensación de la
cromatina se logra tratando
a las células con tripsina.
Esta enzima interviene
degradando proteínas de la
cromatina (histonas)

19. CITOGENÉTICA MOLECULAR
• HIBRIDACIÓN IN SITU Y FLUORESCENCIA (FISH)
• MICORMATICES DE ADN-HIBRIDACIÓN
GENÓMICA COMPARADA (CGH- ARRAY)
• MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE
AMPLIFICATION (MLPA)

20. HIBRIDACIÓN IN SITU Y
FLUOESCENCIA (FISH)
► Utilización de una sonda marcada (fluorescencia) complementaria
a una secuencia de interés de los cromosomas
► La sonda se expone a cromosomas desnaturalizados en metafase,
profase o interfase
► la sonda marcada con fluorescencia hibrida con la o las
secuencias complementarias
► Resolución: 1Mb

21. En los organismos diploides una sonda para los
cromosomas autosómicos debería hibridar dos
veces ( y en caso de los individuos con sexo
cromosómico XX, también debería hibridar dos
veces para el par sexual)

22. FISH
► Hay sondas centroméricas
► Sondas subteloméricas
► Hay sondas locus específicas (por ej. 4p16)
► Hay sondas de pintado cromosomico
Cariotipado
espectral
Sondas centroméricas
Núcleo en interfase de
una célula de liquido
amniótico
Sonda roja: cr Y;
Sonda verde: cr X;
Sondas azules claras: cr 18

23. Sondas centroméricas para el
cromosoma 21

24. MICROARRAY – CGH ARRAY
(COMPARATIVE GENOME
HIBRIDIZATION)
Microarray: fijación de sondas
sobre un sustrato sólido
Detecta desbalances pero no
cambios de posición de
segmentos cromosómicos
Resolución:
depende de la
plataforma; en
promedio es de
0.25Mb pero
algunas están
por debajo de un
1Kb

25. Otra aplicación de microarray:

26. MULTIPLEX LIGATION-DEPENDANT
PROBE AMPLIFICATION (MLPA)
• Se utilizan 2 sondas que hibridan en la misma cadena en
forma adyacente entre ellas.
• cuando encuentran la secuencia blanco hay ligamiento de
ambas sondas, utiliza una ligasa (ligasa 65) muy específica, si
hay algún mismatch en la hibridación, no se ligará
• Se amplifica las sondas por PCR
• Detecta duplicaciones, deleciones
• Resolucion: 50 – 70pb (lo que mide una sonda)

27. ► Los productos de la
amplificación pueden
separarse y cuantificarse
por electroforesis capilar.
Con la electroforesis
obtenemos un patrón de
picos (la deleción se ve
como un descenso y la
duplicación como un
incremento en el área
relativa del pico)

28. Caso de una paciente con 4 copias del exón 20 del gen BRCA1

29. Comparación de la resolución de las distintas técnicas

30. TÉCNICA FUNDAMENTO APLICACIÓN CLÍNICA RESOLUCIÓN
CARIOTIPO CON
BANDEO
VISUALIZACIÓN DIRECTA DE
LOS CROMOSOMAS
• ANEUPLOIDÍAS
• DESBALNCES GRANDES DE CROMOSOMAS
• TRANSLOCACIONES BALANCEADAS Y
DESBALANCEADAS
5-10Mb
FISH SONDAS FLUORESCENTES
COMPLEMENTARIAS A
REGIONES DE INTERÉS DE LOS
CROMOSOMAS
• DETECTA COPIAS ADICIONALES DE UNA REGIÓN O
DELECIONES DE UNA REGIÓN
• REORDENAMIENTOS CROMOSÓMICOS COMO
TRANSLOCACIONES
• USO DE MÚLTIPLES SONDAS , CADA UNA MARCADA
CON UN COLOR DIFERENTE, PERMITE DETECTAR VARIAS
DE LAS ANOMALIAS MAS FRECUENTES AL MISMO TIEMPO
1Mb
MICROARRAY COMPARACIÓN DE ADN DE
UN PACIENTE CON UN ADN
CONTROL PARA IDENTIFICAR
CROMOSOMAS
DESBALANCEADOS
• ANEUPLOIDIAS
• DESBALANCES CROMOSÓMICOS LARGOS Y CORTOS
• SOLO TRANSLOCACIONES DESBALANCEADAS
DEPENDE DE LA
PLATAFORMA; EN
PROMEDIO 0.25Mb PERO
ALGUNAS ESTAN POR
DEBAJO DE 1Kb
MLPA HIBRIDACION DE SONDAS A
TARGETS ADYACENTES,
LIIGACIÓN Y LUEGO
AMPLIFICACIÓN POR PCR DE
LAS
• DELECIONES
• DUPLICACIONES
• MUACIONES PUNTUALES
• INSERCIONES
50-70 NUECLEÓTIDOS