Este documento describe la citogenética clásica y molecular. La citogenética estudia alteraciones en los cromosomas y puede identificar anomalías numéricas o estructurales. El cariotipo muestra los cromosomas de una célula. La citogenética molecular como FISH permite identificar alteraciones no detectables con técnicas clásicas y es más rápida. Ambas técnicas son útiles para el diagnóstico prenatal y preimplantacional y para estudiar problemas de fertilidad.

1. CITOGENÉTICA CLÁSICA Y CITOGENÉTICA MOLECULAR PROF. T.M. CIT. FAVIÁN TREULEN

2. ¿ QUE ES LA CITOGENÉTICA? Disciplina que tiene por objeto estudiar alteraciones numéricas y estructurales que pueden producirse en los cromosomas. Estas alteraciones pueden ser congénitas o adquiridas. Pueden producirse en todas las células del organismo o solo en algunas.

3. La citogénetica se remonta al año 1956 cuando Tijo y Levan describen el número de 46 cromosomas. En 1959 Lejeune describe a la trisomía 21. En 1971 Caspersson describe el primer método de bandeo cromosómico, el bandeo Q. El bandeo Q y otras técnicas de bandeo (GTG, CBG) descritas posteriormente han facilitado la identificación de cada uno de los cromosomas.

4. Actualmente existe el ISCN 1995. Cromosomas 1 – 22 X e Y. Grupos A(1-3), B(4-5), C(6-12,X), D(13-15), E(16-18), F(19-20), G(21-22,Y) Brazos largos y cortos.

6. ¿ QUE ES UN CARIOTIPO? El conjunto de cromosomas de una célula se denomina cariotipo. Se mantiene inalterable en todas las células de un individuo asi como en los individuos de una misma especie. A veces se producen alteraciones que son estudiadas con técnicas de citogenética clásica.

12. ¿CÓMO OBTENEMOS UN CARIOTIPO? CICLO CELULAR La transición desde interfase a división celular (mitosis) y volver a interfase. Se reconocen 4 fases en el ciclo celular: G1 (gap one); S(síntesis); G2(gap two); M(mitosis).

13. MITOSIS En la fase S cada cromosoma se replica y la célula llega ser 4n. Durante la mitosis cada una de las dos copias se deriva a cada una de las células hijas. La mitosis puede dividirse en cuatro etapas: profase, metafase, anafase, telofase. En metafase los cromosomas se encuentran en su máxima compactación.

15. CULTIVO CELULAR -El análisis citogenético se puede realizar en células de diferentes tejidos como, linfocitos de sangre periférica, fibroblastos, amniocitos, trofoblastos, células tumorales y germinales. -Por la facilidad de la obtención de la muestra, los exámenes de rutina se realizan en linfocitos de sangre periférica. -Dependiendo del diagnóstico existen variaciones a la técnica standard.

17. Incubar la muestra en un medio de cultivo líquido adecuado (RPMI 1640). Una vez alcanzado el crecimiento adecuado se detiene el ciclo celular en metafase (colcemid). Se realiza la cosecha de las mitosis. Se gotea la solución en un portaobjeto limpio y los cromosomas fijados al vidrio se someten luego a técnicas de tinción y bandeo.

18. BANDEO CROMOSÓMICO - Se someten los cromosomas a diferentes agentes denaturantes del DNA (calor, tripsina, soluciones alcalinas). -El bandeo GTG (tripsina) se usa de rutina y se complementa con otros bandeos (CBG o RBG)

23. ANÁLISIS MICROSCÓPICO -Se realiza en un mínimo de 35 mitosis bandeadas, más una fotografía y el montaje del cariotipo completo de cada una de ellas. - Este recuento debe ser aumentado a 50 o 100 mitosis en presencia de dos o más lineas celulares y en X frágil.

24. DESCRIPCIÓN DEL CARIOTIPO La descripción del cariotipo normal o con alteraciones como traslocaciones, deleciones, inversiones, rearreglos estructurales complejos, fragilidades, duplicaciones, se realiza con la nomenclatura indicada por el ISCN (1995)

30. CITOGENETICA MOLECULAR Las limitaciones de la citogenética clásica y de la genética molecular por si solas, han sido superadas por la implementación de la citogenética molecular que utiliza las ventajas de ambas A esta metodología se le denomina FISH. Se basa en la hibridación in situ, detección y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos en estructuras biológicas morfológicamente conservadas. Utiliza sondas complementarias a un segmento de DNA. Estas sondas son biotiniladas no radioactivas.

32. TECNICA DE FISH PREPARACION PREVIA DE LA MUESTRA PREPARACION DE LAS PLACAS PREPARACION DE LAS SONDAS HIBRIDACION LAVADOS POST-HIBRIDACION DETECCION TINCION DE CONTRASTE (yoduro de propidium o DAPI) VISUALIZACION (microscopio de epifluorescencia)

34. TIPOS DE SONDAS PAINTING o COATING SONDAS REPETITIVAS DE DNA ALFA SATELITE SONDAS DE DNA DE SECUENCIA UNICA

47. GEN SRY EN CROMOSOMA X

48. CROMOSOMA X: SONDA ROJA CROMOSOMA Y: SONDA VERDE CROMOSOMA 18: SONDA CELESTE

50. SONDA DELECION CROMOSOMA 15

51. DELECION EN EL CROMOSOMA 15

52. DELECION DEL LOCUS KAL EN EL CROM. X

54. EL FISH NOS PERMITE RESPONDER PREGUNTAS IMPOSIBLES DE RESOLVER CON TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA CLÁSICA, ES MENOS LABORIOSO Y MAS RÁPIDO QUE LOS BANDEOS DE ALTA RESOLUCIÓN, ES UNA TÉCNICA FACTIBLE Y PODEROSA EN RESOLUCIÓN.

55. CITOGENETICA CLASICA Y MOLECULAR EN REPRODUCCION APLICACIONES: Determinar la prevalencia de anomalias y de variantes cromosómicas en parejas con esterilidad e infertilidad. Determinar presencia de alteraciones numéricas( aneuploidias). Determinar presencia de alteraciones estructurales (translocaciones deleciones, microdeleciones, inversiones, duplicaciones,etc.) -Determinar presencia de variantes cromosómicas (sitios fragiles, variaciones satelitales, heterocromatina centromérica aumentada, etc.)

56. Diagnóstico prenatal: (anomalias genéticas y defectos del tubo neural. FISH permite la evaluación de aberraciones numéricas en células de líquido amniótico directamente sin cultivar.(trisomía 21, trisomía 13, trisomía 18, S. de Turner o S. De Klinefelter.) Diagnóstico genético preimplantatorio: Posibilidad de analizar la presencia de alteraciones cromosómicas (FISH) y genéticas (P.C.R.)en embriones antes de ser transferidos al útero. (biopsia embrionaria). Translocaciones, determinar el sexo de embriones en enfermedades ligadas al sexo (hemofilia, distrofia muscular de Duchenne). Determinar enfermedades genéticas (Fibrosis quística, Enf. De Tay-Sachs, Sindrome de Marfan, Beta-talasemia, Anemia falciforme, etc.

57. LOS PROBLEMAS DE ESTERILIDAD O INFERTILIDAD SIN CAUSA DEFINIDA, PUEDEN TENER UN ORIGEN CROMOSÓMICO Y REFUERZAN LA NECESIDAD DE ESTUDIAR A UN MAYOR NÚMERO DE PAREJAS CON PROBLEMAS DE REPRODUCCIÓN PARA UNA EVALUACIÓN CITOGENÉTICA, UNA VEZ EXCLUIDAS OTRAS CAUSAS.