metodo de pH diferencial para la cuantificacion de antocianinas

2. CUANTIFICACIÓN DEL TOTAL DE ANTOCIANINAS MEDIANTE EL
MÉTODO DEL PH DIFERENCIAL
Los colorantes naturales para alimentos son necesarios en la industria; sin embargo,
colorantes naturales rojos son escasos ya que pocos extractos naturales tienen un color rojo
brillante no mezclado con otros tonos (Francis, 1989). Las antocianinas han ganado gran
importancia como colorantes naturales para alimentos; este tipo de pigmentos de las plantas
son metabolitos de tipo fenólico, pertenecen a la familia de los flavonoides y son responsables
de la mayoría de colores rojos y azules de las frutas y hortalizas
Los colorantes naturales tales como las antocianinas pueden impartir varios tonos
rojos al color del alimento; pero hay limitaciones en su aplicación debido a su solubilidad, su
dificultad para igualar el matiz deseado, incompatibilidad con la matriz del alimento y la
estabilidad del color con respecto al pH, luz y oxígeno (Markakis et al., 1992).
Se sabe muy bien que las propiedades de las antocianinas, incluyendo la expresión
del color, están altamente influenciadas por la estructura de la antocianina y por el pH
(Cabrita et al., 2000). Se ha demostrado que en la región de pH entre 5-7 las antocianinas
más simples son inestables y rápidamente pierden color debido a la hidratación de la
posición- 2 del esqueleto de la antocianina, generalmente se acepta que las antocianinas
muestran su color más intenso cuando están en la forma de ion flavilio (Francis, 1989); su
color rojo es el resultado neto de todas las antocianinas monoméricas, oligoméricas y
poliméricas junto con sus formas copigmentadas.
Cuantificación de antocianinas
 Extracción de antocianinas
Las antocianinas son moléculas polares y consecuentemente son más solubles en
solventes polares que en no polares. A valores de pH donde las moléculas de antocianinas
están no ionizadas, pueden ser solubles en éter y no son estables en soluciones neutras y
alcalinas; por tanto los métodos convencionales empleados para la extracción de antocianinas
implica el uso de solventes ácidos (TABLA 1).

3. Como se observa en la tabla 1 los métodos de extracción han ido en busca de mejores
rendimientos pero se han comprometido en cuestiones de seguridad (Delgado-Vargas et al.,
2000).
 Cuantificación de antocianinas monoméricas y color polimérico
Considerando al pH como uno de los principales factores del medio que afecta la
estabilidad del color de las antocianinas, los espectros de UV-Vis a diferentes valores de pH
también varían y nos ayudan a determinar si las antocianinas están o no polimerizadas (Giusti
y Wrolstad, 2001). La concentración de antocianinas entonces se determina con la
absorbancia a un pH diferencial. Estas moléculas dan dos bandas de absorción en la región
UV (260-280 nm) y la región visible (490-550 nm). Los resultados se expresan como
pigmentos de antocianinas monomericas, generalmente expresados como cianidina-3-
glucosido.
El método de pH diferencial permite la estimación alternativa del contenido de
antocianinas totales, incluso en la presencia de pigmentos polimerizados y otras
interferencias mediante el uso de sistemas tampón, el empleo de un agente blanqueador,
TABLA 1. Métodosde extracciónde antocianinas

4. bisulfito, y la medición por espectrometría de UV-Visible. Este último consiste en el uso de
un agente blanqueador que decolorara’ a las antocianinas sin afectar a los compuestos
interferentes (figura 1). Se obtiene una medida de la absorbancia máxima en la región visible,
seguida por la decoloración. Los agentes blanqueadores más empleados son bisulfito de sodio
y peróxido de hidrogeno. (Leyva, 2009)
Las antocianinas desarrollan transformaciones estructurales reversibles con el cambio
del pH manifestado por el espectro a diferentes absorbancias. La forma del oxonio coloreado
predomina a pH 1.0 y la forma hemicetal incolora a pH 4.5. El método del pH diferencial se
basa en esta reacción y permite segura y rápidamente medir el total de antocianinas
monoméricas (Leyva, 2009).
Las antocianinas desarrollan transformaciones estructurales reversibles con el cambio
del pH manifestado por el espectro a diferentes absorbancias. La forma del oxonio coloreado
predomina a pH 1,0 y la forma hemicetal incolora a pH 4,5. El método del pH diferencial se
basa en esta reacción y permite segura y rápidamente medir el total de antocianinas
monoméricas (Leyva, 2009).
La diferencia en la absorbancia de estas dos alícuotas leídas a su longitud de onda de
máxima absorción será proporcional al contenido de antocianinas. La concentración en mg/lt
puede ser determinada si multiplicamos por el peso molecular del pigmento (MW)
FIGURA 1. Reacciónde lasantocianinasconbisulfitopara formar antocianinas-
sinfónicasincoloras.

5. C (mg/lt) = A ( E ) L x MW x 103
Para la mayoría de las antocianinas es posible encontrar en la literatura su peso
molecular (MW) y su absorbancia molar ( E ). Estos valores varían un poco dependiendo del
autor, para esto se recomienda utilizar el valor donde se utilizó el mismo solvente que en el
análisis
Según Leyva en el 2009, para calcular la concentración de pigmentos monómericos s
empleo la siguiente ecuación, la cual se expresó como cianidina-3-glucosido.
Antocianinas monomericas (mg/100 g)= AxPMxFDx100/ (Ex1)
Dónde: A=absorbancia, PM=peso molecular de la antocianina, FD= factor de dilución,
E=Absortividad molar
Para calcular el color polimérico de la muestra blanqueada con bisulfito se emplea la
siguiente formula:
Color polimérico = [(A420nm-A700nm) + (Aλvis-max – A700nm)] x FD
BIBLIOGRAFIA
 Leyva Diana E. Determinación de antocianinas, fenoles y actividad antioxidante en
licores y jugo de uva. Oaxaca, 2009
 Francis, F.J, Food colorants: anthocyanins, Critical Reviews Food Science and
Nutrition, 1989.
 Giusti, M.M y R.E. Wrolstad, Acylated anthocyanins from edible sources and their
applications in food systems,Biochemical Engineering Journal, 2003.

6.  Markakis, P. Stability of anthocyanins in food. In Anthocyanins as food colors by P.
Markakis, New York, USA, 1992.
 Delgado-Vargas, F. y Paredes-Lopez. Natural pigments: Carotenoids, anthocyanins
and betalains- characteristics, processing and stability, 2000.