Analisis de curvas de reaccion como parte del proceso de validacion de resuultados de pruebas bioquimicas

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Análisis e Interpretación de Curvas de
Reacción de las pruebas Bioquímicas
Lic TM Javier Quiroz
Product Manager WP BIOMED EIRL
jqcastello@hotmail.com

2. Importancia
Permite la evaluación del resultado, en conjunto con la valoración del
control de calidad interno, externo y el histórico del paciente (Delta
check) permite la VALIDACIÓN del mismo.
Recordar que el CCI por si solo no nos asegura la validez de los
resultados debido a que cada reacción es individual, cada una debería
ser evaluada antes de la emisión del mismo.

3. VALIDACIÓN
 ¿Basado en que criterios puedo validar el resultado de una
prueba bioquímica?
 Glucosa: 88 mg/dl, Amilasa: 550 U/L, DHL: 112 U/L, Creat:
0.7 mg/dl
 ¿De cuál de los resultados anteriores dudaría?
 ¿Repetiría alguno de ellos?
 Rpta: De todos los anteriores…

4. VALIDACIÓN
 Existe la costumbre arraigada de solo dudar de los
resultados que excedan los valores de normalidad, solo
estos despiertan nuestras sospechas, es esto correcto?
 La aleatoriedad inducida por factores presentes en las
muestras no puede ser predicha, el CCI no predice errores
en los resultados.

5. Curvas de reacción de Pruebas Bioquímicas
Gráfico que describe el cambio en la intensidad de color
producto de una reacción durante una prueba bioquímica
en función del tiempo.
Psss… Que miden los equipos bioquímicos (semi o automatizados) absorbancia o transmitancia?

6. Prueba Bioquímica
Test diseñado para la demostración de una especie
en estudio (analito) a través de su reacción con un
sistema detector (reactivo), dicho analito esta
presente en la muestra (suero, orina, LCR, etc.), el
objetivo es determinar no solo la presencia del analito
sino también su concentración.

7. Reactivo – Sistema detector
Solución preparada para evidenciar al analito, al ponerse en
contacto con el, producirá un cambio de color, dicho cambio es
medido y transformado a una concentración mediante su
extrapolación en una curva de calibración, no confundir curva de
calibración con curva de reacción.
Los reactivos pueden presentarse como mono reactivos (R1) o bi
reactivos (R1 y R2).
Cada reactivo esta diseñado para ser medido a un tiempo
determinado, existen básicamente solo dos tipos de reacciones.

8. Tipos de Reacción

9. Tipos de reacción
Punto Final. Si la lectura debe tomarse cuando la reacción llega
a su final, se consume el total del analito, y a pesar de que pase
más tiempo ya no se producirá más color. ESTABLE.
Cinéticas. Por las características de la reacción las lecturas
deben ser tomadas durante la reacción, más de una lectura.
Cinéticas a dos puntos (Tiempo fijo) solo dos lecturas, la
diferencia se toma como el valor para el cálculo.
Cinéticas verdaderas, varios puntos, el promedio de las
diferencias se toma como el valor para el cálculo. CONSTANTE.

10. Punto final, mono react, bi crom

11. Cinéticas, dos y varios puntos
Mono react, mono crom

12. Tipos de reacción
Las reacciones son positivas o de incremento si es que producen color.
Son negativas o de depleción si pierden color.
Monocromáticas, si solo se leen a una determinada longitud de onda
Bicromáticas, si usan un filtro de referencia.
Colorimétricas, si lo que se mide es el cambio de color.
Turbidimétricas, si lo que se mide es la turbidez.

13. Análisis de una curva de reacción
En el eje Y se representa el valor de la absorbancia, común mente
multiplicado por 10,000.
En el eje X se representa el tiempo, comúnmente en ciclos (un ciclo es
el tiempo que hay entre el pipeteo de un reactivo y el siguiente,
depende de cada modelo de analizador y es constante, es el valor que
le da la performance al equipo).
El orden de una reacción mono reactiva es R1, Muestra.
El orden de una reacción bi reactiva es R1, Muestra, R2.
Los reactivos se almacenan refrigerados, deben precalentarse antes
de la reacción.

14. Análisis de una curva de reacción
El tiempo transcurrido entre la adición de R1 y la muestra se conoce
como PRECALENTAMIENTO.
El tiempo entre la adición de la muestra y el final de la prueba se
conoce como REACCIÓN.
Para las pruebas bireactivas.
El tiempo transcurrido entre la adición de R1 y la muestra se conoce
como PRECALENTAMIENTO.
El tiempo entre la adición de la muestra y la adición de R2 se conoce
como INCUBACIÓN.
El tiempo transcurrido entre la adición de R2 y el final de la reacción se
conoce como REACCIÓN.

15. Interpretación de las curvas de reacción
La etapa de precalentamiento nos informa el estado del reactivo previo
a la reacción, se lectura equivale al BLANCO DE REACTIVO, es
diferente para cada reactivo, esta etapa debe ser estable (línea
horizontal).
El cambio en la presentación normal de las etapas de incubación y
reacción nos informa de una inversión en la posición de los reactivos.
Una inestabilidad en la reacción nos indica la presencia de una
interferencia espacial (burbujas, fibrina, insectos, papel, algodón,
cristales)
Una etapa de reacción plana puede deberse a una obstrucción en la
pipeta de muestra o una muestra coagulada.
Balance point no hallado (punto final).
Depleción de substrato (Cinéticas).

16. Curvas de reacción
Dependiendo de los modelos de analizadores pueden o no
observarse y graficarse todas las etapas de las curvas de
reacción
EJEMPLOS

17. Curvas de reacción - datos

18. Ejemplo

19. Punto final, mono react, mono crom

20. Punto final, Bi reac, Mon crom.

21. Reactivo incorrecto

22. Posición invertida de reactivos

23. Curva de calibración No lineal

24. Cinética negativa, mono react, mono crom

25. Cinética, positiva, mono react, mono
crom

26. Blanco de reactivo anormal

27. Burbujas en cubeta, volumen anormal

28. Depleción de substrato

29. Depleción de substrato (Rtvo
degradado)

30. Alteración en toda la curva

31. Alteración en toda la curva

32. Burbujas en frasco = burbujas en cubeta

33. EN RESUMEN
 Para validar un resultado en un analizador automatizado
bioquímico debemos tener en cuenta lo siguiente:
 La prueba es Cinética o Punto Final?
 Si es cinética debemos observar:
 Blanco de reactivo
 Forma característica de la curva
 Estabilidad de la reacción.
 Que no se produzca efecto por límite de agotamiento de
substrato.

34. EN RESUMEN
 Si es Punto Final debemos observar:
 Forma característica de la curva
 Blanco de reactivo adecuado
 Estabilidad de la reacción
 Observar final de la reacción, punto de equilibrio, meseta.
 Si es una prueba de dos reactivos observar que no estén
invertidos.

35. FINAL
 El querer validar el resultado de una prueba mediante su simple
observación es un error, ya que cada reacción es individual y esta
expuesta al error aleatorio.
 El control de calidad interno nos ayuda a asegurarnos el correcto
funcionamiento del binomio Analizador/Reactivo.
 La observación frecuente de las curvas de reacción
 Nos permite la validación de los resultados
 Permite evaluar el estado del reactivo
 Permite tomar decisión correcta al momento de recalibrar
 Disminuye costo y tiempo por repeticiones innecesarias.

36. EL RESULTADO INESPERADO
 Aquel que difiere mucho de lo que yo espero ???
 Para ello debería conocer con antelación el resultado
 CCI
 Asociar el error a una posible causa, responder a la siguiente
pregunta: “Todo estaba bien hasta que…”
CCI RESULTADO INESPERADO CALIBRAR?

37. EL RESULTADO INESPERADO
 ORIGEN DEL “ERROR”
 Equipo
 Reactivo
 Calibrador
 Control
 Operador

38. EL ORIGEN DEL ERROR
 Equipo
 Fallo general en todas las pruebas, en todas las muestras
 Aspiración anormal, fallo en la repetitividad
 Obstrucción, curva de reacción plana
 Lámpara, inestabilidad o resultado cero.
 Lavador, contaminación, curvas irregulares
 En más de na ocasión requerirá asistencia técnica, pero hay
muchos errores técnicos que podemos superar siendo operadores.

39. EL ORIGEN DEL ERROR
 Reactivo
 Todas pruebas salen bien menos una en particular
 Revisar curva de reacción en busca de
anormalidades
 Burbujas?
 Deterioro del reactivo? (blanco anormal)
 En caso de prueba bi reactiva mezcla R1/R2
 Estabilidad del reactivo, comportamiento del CCI

40. EL ORIGEN DEL ERROR
 Calibrador
 Todas pruebas salen bien menos una en particular
 Revisar el historial de calibraciones, fecha de calibración,
comparar el resultado del factor versus los anteriores.
 Rehacer con calibrador fresco o usar una calibración anterior.

41. EL ORIGEN DEL ERROR
 Control
 Resultados inesperados en todas las pruebas comunes al control
 Reconstitución adecuada. Volumen? Reconstituyente? Tiempo?
Almacenamiento?
 Rehacer con control fresco y evaluar.

42. EL ORIGEN DEL ERROR
 Control
 Tendencia, vigilar tendencia en el tiempo, observar valor ingresado
en el equipo

43. EL ORIGEN DEL ERROR
 Operador
 Cometer errores es de lo más habitual y normal, todos los
cometemos, pero dependiendo de cómo actuemos ante este error,
creceremos y aprenderemos o nos quedaremos estancados.
 Hay dos maneras de actuar ante un fallo cometido:
 Esconderlo
 Reconocerlo y crecer.

44. Muchas Gracias
Por escuchar a
mi papi!
Tavo Quiroz

45. … Y la muestra?
Te olvidaste de las interferencias.