Este documento presenta los procedimientos para identificar bacterias a través de su morfología y tinción Gram. Se prepararon medios de cultivo en agar y se sembraron muestras de bacterias de frutas y verduras. Luego se realizó la tinción Gram siguiendo los pasos establecidos y se observó el resultado bajo el microscopio. La hipótesis planteada resultó falsa, ya que las bacterias presentaban una tinción morado-rosa o no se teñían, clasificándolas en los grupos de Mendosicutes o

1. Introducción general
Equipo:
 Argueta Ayala Zaira
 Guillen Palma Irais
 Lozano Salazar Yannin Arizbeth
 Muñoz Aquiáhuatl Susan Elena
Profesora: Martha Corona Tinoco
Grupo: 612 Sección A
Escuela Nacional Preparatoria
Plantel 5: “José Vasconcelos”

2. La microbiología, es la ciencia que estudia los microorganismos en su
naturaleza, vida y acción. El término, etimológicamente, es de amplio
significado, pero suele utilizarse en sentido limitado para comprender
determinadas formas microscópicas de vida.
Su campo incluye las bacterias, las rickettsias, los virus, las levaduras, los
mohos y los protozoos en relación con el hombre y sus actividades, los
animales, las plantas y entre ellos mismos.
Los microorganismos pueden estar constituidos por una sola célula
(unicelulares), así como pequeños agregados celulares formados por células
equivalentes ; estos pueden ser eucariotas (células con núcleo) tales como
hongos y protistas o procariotas (células sin núcleo definido) como las
bacterias.
La existencia de este mundo microbiano se desconocía hasta la invención del
microscopio (principios del siglo XVII), instrumentos ópticos que sirven para
ampliar objetos que son tan pequeños que no se puede ver claramente por el
ojo humano sin ayuda, abriendo el reino biológico de lo muy pequeño a la
exploración científica sistemática. La mayoría de los microorganismos son de
vida libre.
La microbiología permite conocer los microorganismos con sus
características morfológicas, biológicas y antigénicas; su relación con la
infección y con la enfermedad en el hombre; las vías de penetración del
hospedero, las acciones y los cambios quimiofisiológicos y celulares que
ocasionan; la resistencia natural adquirida que ofrece el organismo, así
como otros estados inmunitarios a que dan lugar.
Ésta práctica está dividida en tres partes correspondientes a: bacterias,
hongos y protistas, pues resulta más fácil explicar y entender el
desarrollo de cada uno.

3. Objetivo:
 Preparar adecuadamente los medios de cultivo para
bacterias.
 Observar e identificar la morfología de bacterias que se
desarrollan en alimentos como frutas y verduras
jugosas.
 Distinguir su composición de pared celular, mediante
tinción Gram y así dar clasificación taxonómica.
Planteamiento del problema:
La diferencia de composición bioquímica de las paredes de
las bacterias es responsable de su diferente
comportamiento frente a un colorante, con base a ello dar
clasificación a las bacterias encontradas dentro de los 4
grupos donde están agrupadas: firmicutes, gracilicutes,
mendosicutes y tenericutes.
Hipótesis:
Si la preparación de los medios de cultivo se tiñe de morado
entonces serán bacterias Gram positivas y pertenecerán al
grupo firmicutes.

4. Marco Teórico: 2
Las bacterias (del griego bakterion, pequeño bastón)
constituyen uno de los grupos de seres unicelulares más
pequeños (siendo entonces células procariotas) y
abundantes de la naturaleza debido a la gran variedad de
metabolismos que pueden presentar.
Su tamaño va desde 0.1 µm a 1 µm de ancho y de espesor,
con una longitud de 0.5 µm a 10 µm.
Pueden vivir aisladas o en colonias. Tienen como único
medio de locomoción flagelos cuyo número es variable.
Normalmente se reproducen asexualmente por bipartición.
Para la nutrición la mayoría de las bacterias utilizan
sustancias químicas orgánicas, que en la naturaleza pueden
provenir de organismos vivos ó muertos. Algunas bacterias
pueden producir sus propios alimentos mediante la
fotosíntesis y algunas pueden nutrirse a partir de sustancias
inorgánicas.

5. Clasificaciones
Forma y agrupación:
Se clasifican en tres grupos: bacilos, cocos y espirilos.
Pueden presentarse aisladas, en grupos de dos o formando
cadenas largas, así como constituyendo racimos,
dependiendo esto de la especie y condiciones del medio
ambiente.
 Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero
en algunas ocasiones pueden encontrarse células
unidas por los extremos o por los lados debido a la
etapa del desarrollo en que se encuentren o a las
condiciones del cultivo.
 Las bacterias en espiral generalmente no se
agrupan, crecen individuales y aisladas.

6. Pared Celular
Están recubiertas por paredes celulares que en gran parte
están constituidas por un complejo de hidrato de carbono y
proteína denominado peptidoglucano.
 Da forma a la bacteria y sobre todo soporta fuertes
presiones osmóticas de su interior.
Según la composición de ésta y la tinción que adquieren se
dividen en:
Gram Negativas (G-)
Su pared es estrecha y compleja.
Tienen sobre los peptidoglucanos una capa externa de
lipopolisacáridos y proteínas, muchas de ellas enzimas.
Gram Positivas (G+)
Su pared es ancha, carecen de capa externa, poseen
numerosas capas de peptidoglucano y sobre ellos tienen una
capa con ácidos teicoicos (compuesto complejo que incluye
azúcares, fosfato y aminoácidos) como componente más
típico.
 Un método muy utilizado en microbiología para la tinción
de bacterias es la tinción de Gram.
En esta tinción se forma un complejo violeta-yodo, insoluble
dentro de la célula, que sólo es extraído por el alcohol en las
bacterias Gram negativas, su apariencia es rosácea. Las Gram
positivas tienen unas paredes celulares muy gruesas que se
deshidratan por el alcohol, lo que cierra sus poros evitando
que los complejos violeta- yodo salgan de las células y por ello
se ven moradas.

7. Taxonomía:
La clasificación taxonómica más utilizada divide a las
bacterias en cuatro grandes grupos según las características
de la pared celular.
 Gracilicutes: Son bacterias con pared celular delgada
(Gram negativas); por lo que se tiñen de rosa.
 Firmicutes: Sus paredes celulares son gruesas, son Gram
positivas y se tiñen de morado.
 Tenericutes: Sin pared celular, por tanto no se tiñen.
 Mendosicutes: Bacterias con ausencia de ácido murámico
(azúcar del peptidoglucano) en su pared celular y se tiñen de
morado-rosa.
El ser humano se encuentra en todo momento expuesto al medio
ambiente, de donde adquiere microorganismos. Por lo general,
mantiene un equilibrio conviviendo con ellos e incluso obtiene
algunos beneficios; sin embargo algunos organismos como las
bacterias pueden proliferar y causarle entonces una enfermedad,
utilizando los productos de su metabolismo, por lo cual es
importante conocer e identificar a las bacterias y las estructuras
que las componen, ya que tales conocimientos son de gran utilidad
para tratar de forma preventiva o curativa las enfermedades. Si
bien no está de más recordar que las bacterias no sólo causan daño
sino que también son de gran utilidad en la industria de fármacos,
en la elaboración de algunos alimentos, en general en la
investigación, todo en función de sus componentes y cualidades.

8. Diseño Experimental:
Material:
Uso de bata en todo el procedimiento del diseño
experimental.
Cabello recogido.
Esterilizar área de trabajo al inicio y final de la práctica.
Para medio de
cultivo:
Siembra: Tinción Gram:
Agar Mac Conkey
Agar
Bacteriológico
Pesa de
monoplano
Vidrio de reloj
Guantes
Agua destilada
Algodón
Matraz
Erlenmeyer
Mechero de
Bunsen
Hisopo
Tubos de ensayo
Marcador
indeleble
Encendedor
Medios de
cultivo natural
(frutas ó/y
verduras
jugosas)
Caja de petri
Tubos de
ensayo
Asa
Algodón
Lámpara de
alcohol
Cristal violeta
Azul de metilo
Portaobjetos
Agua
Alcohol
Safranina
Lugol
Guantes
Cubre boca
Microscopio
óptico

9. Procedimientos:
Para medio de cultivo:
Para ello se requerirá ocupar Agar bacteriológico y Agar Mac
Conkey de a cuerdo al modo de preparación de cada uno.
Agar Bacteriológico Agar Mac Conkey
Procesado especialmente para
ser utilizado como agente
solidificante en
medios de cultivo
microbiológicos.
Ajustar y/o suplementar como
se requiera para cumplir los
criterios de funcionalidad.
 Sobre la pesa de monoplano
colocar el vidrio de reloj y medir
50g de Agar Mc Conkey.
 Vaciar al matraz erlenmeyer
y suspender los 50g del medio
en 1L de agua purificada.
 Calentar con agitación suave
hasta su completa
disolución y hervir durante un
minuto.
 Retirar del fuego y con
algodón se tapará la boca del
matraz.
Esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 minutos.
 Enfriar a una temperatura
entre 45-50°C.
 Vaciar en placas de Petri y
tubos de ensayo estériles.

10. Tanto para los tubos de ensayo como cajas petri, se verterá Agar
Mac Conkey de la siguiente manera:
 Encender la lámpara de alcohol.
 Se retira el algodón que tiene el matraz erlenmeyer para poder
esterilizar la boca de este.
Se esteriliza también la boca del tubo de ensayo y las cajas petri
y se vacía el Agar.

11.  A los tubos de ensayo se les pone como tapón un poco de
algodón y se colocan en horizontal, recargándolos con su boca
sobre el recipiente.
 Se concluye la preparación para los medio de cultivo cuando los
tubos de ensayo que se inclinaron estén fríos y el medio de cultivo
se haya solidificado, se procede a sembrarlos.

12. Para siembra:
Se empleará siembra en estría simple y siembra cuadrante
cruzada.
Siembra cuadrante cruzada
 Se enciende la lámpara de alcohol y se coloca cerca la caja de
petri para la siembra (siembra en cuadrante cruzada) y los tubos de
ensayo (siembra en estría simple).
 El asa para sembrar debe tener el extremo del alambre
formando un círculo (pequeño).
 Se toma el asa por la extremidad del mango con los dedos
pulgar, índice y medio de la mano derecha. En seguida se flamea al
rojo vivo del alambre del asa, se deja enfriar sobre un poco de Agar
solidificado.
 Se coloca la punta del asa sobre la colonia de bacterias que se
elija, pare que tocando la superficie se adhieran gran número de
bacterias.
 Se destapa la boca del tubo de ensayo y se esteriliza (se flamea
un poco con la lámpara de alcohol) para luego introducir el asa,
haciéndola pasar suavemente por la superficie del medio

13. solidificado, haciendo una estría simple, que se inicia en la parte
más interna del tubo, teniendo cuidado de no romper el Agar al
hacer la siembra.
 Se saca el asa del tubo, se tapa el tubo y el asa se flamea al rojo
vivo, quedando lista para otra siembra; en este caso la siembra en
cuadrante cruzada que tendrá el mismo procedimiento.
 Finalmente se marcarán las cajas de petri con el grupo que las
sembró.

14. Para tinción:
 Con un asa previamente esterilizada se coloca en un
portaobjetos una pequeña cantidad algún cultivo bacteriano,
anteriormente hecho.
 Se hace fijación de las bacterias al portaobjetos (Frotis): Se
coloca una pequeña gota de agua al portaobjetos inmediatamente
pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos
segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.
 Una vez seco, se agrega cristal violeta reposar 1min.
 Luego se sustituye cristal violeta por azul de metilo 1 min.
 Se elimina el exceso: lavado.
 Se cubre la preparación con una solución yodo-yodurada: Lugol
1min.
 Se elimina exceso: lavado
 Se agrega alcohol para decolorar (5-10 gotas), con esto las
células Gram positivas retienen el compuesto de cristal-violeta-
yodo y conservan su color azul, mientras que las Gram negativas se
decoloran completamente por la acción del alcohol.

15.  Se elimina exceso: Lavado
 Se aplica un colorante contraste, el rojo de safranina 1min, con
el cual las células Gram negativas que antes se habían decolorado
se tiñen después.
 Eliminar exceso: Lavado
 Finalmente dejar secar y luego se podrá observar al
microscopio.

16. Análisis de resultados:
MEDIO DE
CULTIVO: Agar
Mc Conkey
SIEMBRAS:
Estría simple y
en cuadrante
cruzada.
TINCIÓN
GRAM:
Paso 1: Poner en
portaobjetos un poco de
cultivo bacteriano.
Paso 2: Fijar
muestra (Frotis).
Paso 3:
Cristal violeta
(1min).
Paso 4: Azul de
metilo (1 min)
Paso 5:
Eliminar
exceso
Paso 6:
Lugol (1min)
Paso 7:
Eliminar exceso
Paso 8: Alcohol
(5-10 gotas)
Paso 9: Eliminar
exceso
Paso 10:
Safranina
Paso 11:
Eliminar
exceso
Paso 13:
Observar en
microscopio
Paso 12:
Secar al aire
Paso 13:
Resultados

17. Conclusión:
De acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica podemos concluir que la
hipótesis planteada resultó falsa pues los resultados de la tinción de los
medios de cultivo utilizados fue: bacilos, morado-rosas por lo tanto nos
referimos al grupo mendosicutes (con ausencia del azúcar del
peptidoglucano en pared celular) y otro al no tener pared celular no se tiñó
por lo tanto fue tenericute (bacilos). Entonces no pudimos obtener bacterias
Gram positivas pertenecientes al grupo firmicutes. Por último podemos
afirmar que se lograron los tres objetivos planteados, pues se prepararon
adecuadamente los medios de cultivo para el desarrollo de bacterias en
frutas y verduras; se observó la morfología de algunas bacterias desarrolladas
en frutas y se les pudo dar clasificación de acuerdo a la tinción Gram.
Bibliografía:
 Velasco M., López R., Romero M., Salamanca C. Biología 2º
Bachillerato: Editex, España 2006.
 Piña López C.: Diversidad microbiana, tipos de microbios.
http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/ba
ct_clasif.htm
 Franco Martínez F.: UNAM Facultad de Odontología, Microbiología, guía
de estudio 2002.
http://132.248.225.10/licenciatura/guiasyprogramas/guias/2_microbiologia.
pdf
 Microbiología clínica:
http://danival.org/600%20microbio/6200microclin/bhim/bhim_2-3.html
 http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20MAC%20CONKEY.pdf
 http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_bacteriologico.pdf
http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm