Este documento describe diferentes métodos para realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana in vitro, incluyendo el método de dilución en caldo, el método de difusión en agar (antibiograma), y el método de dilución en agar. Explica los pasos, ventajas e inconvenientes de cada método, y proporciona pautas para su correcta realización y interpretación de resultados.

1. Facultad de Odontología
Postgrado en periodoncia
Tema:
Pruebas de sensibilidad in vitro a los agentes antimicrobianos
Año lectivo:
2015-2016

2. Pruebas de sensibilidad in vitro a los agentes antimicrobianos
Estas pruebas deben ser realizadas para todo patógeno cuya sensibilidad sea desconocida pese a
su identificación, o bien, en los casos en que pertenezca a cepas de conocida resistencia a los
antimicrobianos, por • ejemplo Staphylococcus spp, Pseudomonas spp o enterobacterias.
La meta de estos exámenes consiste en lograr, a través de la evaluación in vitro, la probabilidad
de tratar con éxito las infecciones mediante el empleo de un agente antimicrobiano en particular
y prevenir posibles resistencias.
Antibiogramas
Los antibiogramas son estudios que se realizan in vitro y nos permiten determinar la resistencia o
el grado de sensibilidad de los microorganismos frente a los diferentes antimicrobianos.
El antibiograma es necesario en las siguientes situaciones:
1) Cuando no se puede proveer o se desconoce la sensibilidad a los antimicrobianos de
uso frecuente de un microorganismo aislado como, por ejemplo: gramnegativos
fermentativos y no fermentativos, Staphylococcus aureus, algunos anaerobios,
patógenos oportunistas inusuales, algunos neumococos, etcétera.
2) Como vigilancia epidemiológica, para detectar la emergencia de patógenos resistentes
e informar sobre la evolución de las resistencias conocidas.
3) En infecciones microbianas graves que comprometen seriamente la vida del paciente,
como por ejemplo endocarditis, absceso cerebral, septicemia, meningitis, entre otras.
4) Cuando el cuadro clínico no responde al tratamiento antimicrobiano clásico para esa
enfermedad. En este caso, es conveniente suspender el tratamiento al menos 72 horas
antes de tomar la muestra y siempre que el cuadro clínico lo permita.
En cambio, el antibiograma no es necesario cuando:
1. Se trata de microorganismos en los que no se han informado resistencias microbianas.
2. Se trata de gérmenes que han conservado su susceptibilidad a un antimicrobiano
selectivo, tales como gonococos, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae o
especies de Actinomyces.
3. El cultivo del microorganismo presenta demasiadas dificultades técnicas, como es el caso
del Treponema pallidum.

3. Los métodos más conocidos de antibiogramas para bacterias, en general, son:
1) dilución en caldo- es el más exacto y el que posee mayor valor clínico, pero también es
complicado, costoso y prolongado; por estos motivos sólo se lo usa para casos especiales.
2) difusión en agar- no es tan exacto como el anterior, pero resulta menos costoso, más
práctico, sencillo y satisfactorio para la práctica clínica.
3) dilución en agar- se utiliza poco, porque es lento y costoso; además, no permite el
desarrollo de todos los microorganismos para poder estudiarlos.
Método de dilución en caldo
Esta prueba de sensibilidad en caldo puede realizarse en tubo (macrométodo) o en microplaca
(micrométodo). Se trata de un método cuantitativo, considerado dé referencia, que permite
determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración bactericida mínima.
Puede utilizárselo cuando:
 No se observa una adecuada evolución clínica, pese haber indicado el antimicrobiano
de acuerdo con los resultados del antibiograma por difusión.
 Debe realizarse el tratamiento con antimicrobianos selectivos potencialmente tóxicos,
por lo que debe conocerse bien la dosis a utilizar.
Desventaja
Para cada sistema bacteria-antimicrobiano debe prepararse una serie completa de tubos, lo que
toma laborioso probar varios antimicrobianos frente a cada cepa aislada de pacientes.
Método de difusión en agar
Fue estandarizado por Kirby-Bauer en los Estados Unidos en 1966, Es la más ampliamente
utilizada en bacteriología clínica, porque permite obtener resultados bastante exactos mediante
un método estandarizado, sencillo, de ejecución rápida, económico y fácil de reproducir. Puede
realizarse como método cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo.

4. El Comité de Expertos de la OMS tiene en cuenta las siguientes normas:
Condiciones de la cepa
 Debe aislarse del material en estudio.
 Debe obtenerse en forma de cultivo puro.
 Debe ser el agente etiológico del proceso infeccioso.
 Podrán utilizarse cepas de referencia cuando existan dudas en el material que se usa.
Cualidades de los discos de papel
 Deben tener un tamaño de 5 a 7 mm y un espesor de 0,02 mm.
 Deben cargarse con una concentración de antimicrobiano selectivo de manera que se
obtenga una zona de inhibición no mayor de 40 mm.
 La cantidad de antimicrobiano selectivo que contiene cada disco debe ser justa, porque
una sobrecarga falsearía los resultados.
 Deben mantenerse almacenados a temperaturas de 4 °C o, según las instrucciones del
fabricante, para que no haya deterioro en la potencia de la droga.
 Tienen que estar en un ambiente con sustancias desecadoras para evitar los vapores de
condensación al almacenarlos en el refrigerador.
Requisitos del medio de cultivo
Se propone el empleo del agar de Muller-Hinton porque:
 Da resultados satisfactorios con las cepas de referencia.
 Permite el desarrollo de la mayoría de los microorganismos patógenos.
 No antagoniza con ninguno de los antimicrobianos selectivos con los que se realiza la
prueba.
 Posee un pH de 7,2 a 7,4.
Indicaciones para la preparación de las placas
 El medio deberá distribuirse uniformemente en la caja.
 La altura del medio debe ser de 4 mm para que pueda estandarizarse la difusión de la
droga, porque si se disminuyera el espesor de la capa de agar se obtendrían halos de
inhibición más amplios.

5. Control de calidad
Cada vez que se utiliza un nuevo lote de discos o agar deben probarse con las siguientes cepas de
referencia: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.
Técnica
1) A partir de un cultivo puro del microorganismo que se va a estudiar, con un desarrollo de
18 horas en placa de agar, se toman cuatro a cinco colonias y se las suspende en caldo
Müller-Hinton o en un hidrolizado de soja y caseína.
2) Se incuba entre 2 y 5 horas, de manera de obtener una turbidez final equivalente al 0,5 de
la escala de Mc Farland, que corresponde a 10 8
UFC/mL.
3) Inmediatamente se sembrará una placa con agar de Müller-Hinton según la siguiente
técnica:
4) se embebe un hisopo de algodón estéril en el inóculo, se elimina el exceso de líquido
contra las paredes del tubo y se aplica sobre la superficie del agar estriándolo tres veces
(debe asegurarse de cubrir perfectamente toda el área).
5) Se deja secar entre 3 y 5 minutos.
6) Con una pinza estéril de puntas finas se colocan, sobre la superficie del agar sembrado
con discos individuales; éstos llevan impresa la abreviatura del antimicrobiano selectivo
en el cual se encuentran embebidos y la serie a la cual pertenecen
7) Se deja la placa no menos de media hora a temperatura ambiente para que el disco
absorba agua del medio de cultivo y así permita la difusión radial del antimicrobiano
selectivo, lo que produce un gradiente de concentración; es decir, que cuanto más nos
alejemos del discó, menor será la concentración del antimicrobiano. Esta predifusión es
necesaria para disminuir una posible causa de error.
8) Luego se incuba durante 12 a 18 horas a 37 °C; para esto se coloca la caja en posición
invertida en un ambiente con oxígeno.
9) En lo posible debe evitarse la incubación en presencia de anhídrido carbónico, ya que
éste modificaría el pH del medio, lo que afectaría la actividad de algunos
antimicrobianos.
10) Una vez transcurrido dicho lapso, se procede a la medición y la interpretación de la zona
que circunda el disco, llamada halo de inhibición. Este informa si el microorganismo es
sensible, resistente o intermedio.
11) La falta de desarrollo alrededor del disco indica que la bacteria es "S, sensible" al
antimicrobiano selectivo, lo que significa que el antimicrobiano puede utilizarse en dosis
terapéuticas.
12) El crecimiento del microorganismo alrededor del disco indica que es "R, resistente" al
antimicrobiano, por lo cual no debe emplearse.
13) Existe un tercer tipo "I, intermedia", cuando los diámetros de los halos son inferiores a
"S" y superiores a "R" que es la que exige la administración de dosis de antimicrobianos
superiores a las habituales para obtener una respuesta terapéutica favorable, siempre y
cuando no produzca efectos secundarios.

6. Limitaciones
 Sólo puede usarse para microorganismos aerobios de crecimiento rápido.
 No pueden probarse antimicrobianos para los que no se haya establecido el tamaño de la
zona de inhibición.
 Determina sólo si un antimicrobiano es bacteriostático, es decir que proporciona
únicamente la CIM y no la CBM.
 No puede modificarse la combinación de antimicrobianos selectivos. Esto significa que
debe disponerse de una variedad de series de discos y que a veces se prueban
antimicrobianos selectivos innecesarios; por eso se prefieren los discos aislados.
 No pueden apreciarse los diferentes grados de resistencia.
Fallas del laboratorio:
1. El germen investigado no es el patógeno.
2. El antibiograma no fue realizado con cultivos puros del agente etiológico (germen único).
3. La cantidad de inóculo por unidad de volumen no es la correcta (lo más común es que sea
excesiva).
4. Se utilizó un medio de cultivo no apropiado, sin ajuste de pH o con un volumen
inadecuado.
5. El almacenamiento de los discos se realizó a una temperatura incorrecta.
6. La cantidad de antimicrobiano selectivo que contiene cada disco no es la conveniente.
7. El tiempo de incubación se extendió innecesariamente, lo que puede determinar la
destrucción del antimicrobiano selectivo y el posterior crecimiento de los
microorganismos sobre los que se había ejercido un efecto bacteriostático.
8. El antibiograma se contaminó con otros microorganismos por técnicas defectuosas.
Fallas del profesional:
1. Obtención del material en pacientes bajo tratamiento antimicrobiano.
2. Muestra no adecuada, por ejemplo, envío de saliva. Los materiales deben ser obtenidos
indefectiblemente del sitio donde se encuentra el proceso infeccioso propiamente dicho.

7. 3. Pasos inadecuados en la técnica de recolección del material a analizar.
4. Demora en el envío de la muestra desde el momento de la toma hasta su remisión, lo que
ocasiona modificaciones en la vitalidad del germen o permite la proliferación de otro
microorganismo.
5. Remisión en condiciones no adecuadas
6. No tener en cuenta la farmacodinámica y la farmacocinética de la droga utilizada.
7. Empleo de una dosis inadecuada de antimicrobiano selectivo.
8. Administración por tiempo insuficiente o por una vía incorrecta.
9. Foco infeccioso inaccesible al antimicrobiano porque se han formado defensas naturales
(abscesos) o porque se halla ubicado en un lugar donde no penetra la droga.
Conducta a seguir en casos de infecciones severas
1. Se procede a tomar la muestra del sitio adecuado y en el mismo momento se realizan dos
extendidos.
2. Cumpliendo las normas de bioseguridad, se remite la muestra al laboratorio acompañado
del protocolo solicitando coloración de Gram, cultivo y antibiograma. Estos dos últimos
requerimientos se cumplimentarán de acuerdo con los resultados del examen
microscópico directo y un diagnóstico de sospecha.
3. Indicar al paciente la toma de un antimicrobiano selectivo en forma empírica, de acuerdo
con el diagnóstico presuntivo, espectros antimicrobianos conocidos y estadísticas
bacteriológicas.
4. Según el informe del antibiograma remitido por el laboratorio, se continua o no con el
tratamiento elegido.
Método de dilución en agar
Se aplica, fundamentalmente, en el tratamiento de patologías graves causadas por
microorganismos con comportamiento variable ante los antimicrobianos disponibles, como por
ejemplo en el caso de septicemia por especies de Pseudomonas, sepsis, endocarditis o meningitis
por bacilos gramnegativos y en el control de cepas hospitalarias.
Este método es igual al de dilución en caldo, con la diferencia de que se trabaja en cajas con
medios sólidos que contienen concentraciones decrecientes del antimicrobiano selectivo. Los
microorganismos se desarrollarán en aquellas placas que no contengan una cantidad de
antimicrobiano suficiente como para inhibirlos; con este método es posible determinar la DM
pero no la CBM.

8. Ventajas
 Puede realizarse con varias cepas simultáneamente.
 Puede reproducirse mejor que el método de dilución en medio líquido.
 Pueden evaluarse asociaciones de antimicrobianos.
 Puede realizarse con microorganismos anaerobios.
Desventajas
 El costo es elevado.
 La técnica es complicada e insume mucho tiempo y material, ya que requiere la
preparación de distintas placas para cada antimicrobiano a evaluar.
 La mayoría de los laboratorios no pueden realizar este método en forma habitual.