Trabajo de la asignatura Métodos Instrumentales y experimentales en Química y Biotecnología del Máster en Química y Biotecnología

1. MIEQB
Sandra Marín San Román
Mónica Martínez Junquera
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Aplicación RMN
Estudio metabolómico con HRMAS-RMN de H1
para evaluar la calidad y trazabilidad de queso
mozzarella de leche de búfala.
Introducción
La producción de mozzarella en la región de Campania (Italia) es relevante para mantener la
economía agroalimentaria de la región, así como la denominación de origen. La alta demanda
del consumidor de este queso, la cantidad limitada de leche búfala disponible y el alto precio de
mercado, convierten a este producto en uno de los más afectados por los fraudes y las
adulteraciones.
Con el fin de evaluar la autenticidad, trazabilidad y calidad de este producto, se ha empleado la
RMN-HRMAS (High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance) en
combinación con análisis de componentes principales (PCA).
Esta técnica RMN consiste en hacer girar a la muestra a una velocidad superior que la habitual
consiguiendo unos espectros mono y bidimensionales de gran calidad, se utiliza para materiales
semisólidos permitiendo examinar directamente los metabolitos del producto alimentario sin
pretratamiento de muestra.
Preparación muestra
Para ello se analizaron 37 muestras de queso, todas ellas obtenidas a partir de leche de búfala
producida por animales criados en la fábrica “La perla del mediterráneo” y 12 muestras con
denominación de origen de un mercado local.
Las 37 muestras provenientes de la fábrica se trataron y se guardaron por individual dentro de
un paquete sumergido en suero de mozzarella y almacenado a 25 °C hasta su análisis por RMN-
HRMAS, después se devolvió a su envase original almacenándolo durante dos días en las mismas
condiciones tras los que se realizó un análisis RMN-HRMAS de la muestra envejecida.
Experimentos RMN
Todos los experimentos se llevaron a cabo a una temperatura de 25 ± 1°C en un espectrómetro
Bruker Avance de 400MHz equipado con una sonda 1
H-13
C HRMAS Bruker que hace girar al rotor
a 5KHz utilizando como disolvente D2O.

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Sandra Marín San Román
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La identificación estructural de los metabolitos de las muestras se consiguió a partir de espectros
de RMN bidimensionales:
1. Homonuclear 1
H-1
H COSY (COrrelation SpectroscopY) y TOCSY (Total COrrelation
SpectroscopY).
2. Heteronuclear 1
H-13
C HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation)
Resultados RMN
El espectro 1
H HRMAS convencional no discernía entre las muestras de queso por ello se
aplicaron dos secuencias de pulso eDiff (Diffusion measurement) y eCPMG (Carr-Purcell-
Meiboom-Gill) que eliminaron los metabolitos específicos y por lo tanto las señales de las
moléculas de movimiento lento (compuestos lipídicos). Esta simplificación permitió una
observación más clara de picos y multipletes de moléculas relativamente más rápidas
(aminoácidos, ácidos orgánicos, carbohidratos…), a pesar de la reducción parcial de la intensidad
de la señal, y en ocasiones la resolución de la constante de acoplamiento (J).
Figura 1. Espectros 1
H HRMAS de muestras de mozzarella a) espectro de 1
H convencional; b) eDiff; c)
eCPMG

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Figura 2. Espectros de 1
H eCPMG a) Muestras de la fabrica; b) Muestras del mercado local; c) Muestras
de la frabrica envejecidas de dos días.
Tabla 1. Desplazamientos químicos especficos de cada metabolito.

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Conclusiones
En este trabajo se demostró que la técnica RMN-HRMAS es una herramienta eficiente, poderosa
y rápida para caracterizar la composición molecular de quesos.
Las condiciones adoptadas para los espectros eCPMG y eDiff modificados proporcionan
espectros simplificados pero significativos que revelaron las señales necesarias para un estudio
metabolomico.
Las muestras de fábrica (a) tienen más cantidad de β-galactosa y β-lactosa, mientras que las del
mercado local (b) tienen un mayor contenido de ácido acético, esto se debe al proceso de
transformación.
Entre a) y c) se puede observar como aparece un pico correspondiente al alcohol isobutílico, y
crecen los picos correspondientes a ácido acético y ácido láctico de las muestras envejecidas.
La base de datos obtenida en este experimento sirve como una herramienta para probar y
evaluar la calidad molecular de este tipo de queso, rastrear su origen geográfico, evitar posibles
fraudes y adulteraciones y estudiar su envejecimiento.