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Fundamentos de Nutrición
- 1. 397 3 Nutrigenética yepigenética: técnicas de SNP y MSP PRÁCTICA 46 P. Cordero Sánchez, F. I. Milagro Yoldi y J. Campión Zabalza INTRODUCCIÓN Entre el 40 y el70 % del peso corporal se ha atribuido a la herencia genética, con más de 600 regiones cromosómicas potencialmente implica- das. La nutrigenética estudia la relación entre las diferencias interindividuales en la secuencia del ADN y la distinta respuesta a la ingesta de los nu- trientes. A otro nivel, la epigenética se centra en el estudio de modificaciones covalentes sobre el ADN que, sin variar su secuencia de nucleótidos, puede regular su expresión. Los polimorfismos son variaciones en un punto determinado de la secuencia nucleotídica del ADN presentes en más del 1% de la población y que pueden estar asociados a patologías como la obesidad y otras enfermedades metabólicas. Los más estudiados son aquéllos en los que un nucle- ótido es sustituido por otro. Su diagnóstico puede llevarse a cabo mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de discriminación alélica y ayu- dar al establecimiento de un tratamiento nutricio- nal basado en el genotipo individual. El principal mecanismo de regulación epigené- tica resulta de la adición de un grupo metilo en ci- tosinas seguidas de guanina (sitios CpG). Estos dí- meros abundan en regiones promotoras de muchos genes y un aumento en su metilación está con fre- cuencia asociado a una represión en la expresión del gen. Este patrón de metilación es potencialmente he- redable por la descendencia y modificable por los hábitos dietéticos y estilos de vida (Fig. P46-1). OBJETIVO Los objetivos de esta sesión práctica son deter- minar la presencia de un polimorfismo en la secuen- cia de ADN (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) y analizar los niveles de metilación del ADN en una zona concreta de la región promotora de un gen (MSP, Methylation Specific PCR). PROCEDIMIENTO Fundamento PCR (reacción en cadena de la polimerasa) Esta técnica de biología molecular tiene como objetivo la amplificación de un fragmento defi- Figura P46-1. Regulación del patrón de metilación del ADN. Hábitos de vida Enfermedades Dieta Cambios en patrón de metilación Citosina metilada Citosina no metilada 10 Práctica 46-50:ok 15/12/10 8:57 Página 397
- 2. Parte II. Metodologíay aplicaciones398 nido de ADN presente en una muestra. El proceso se basa en la repetición de una serie de ciclos, nor- malmente entre 25 y 40, con las siguientes fases: 1. Desnaturalización, en la que se produce la se- paración de las hebras de ADN a alta tempe- ratura. 2. Unión de los cebadores a su secuencia comple- mentaria de ADN a partir de la cual se iniciará la replicación. La temperatura de este proceso varía entre 50 y 65 grados dependiendo del nú- mero de nucleótidos de los cebadores y de su proporción de bases púricas y pirimidínicas. 3. Elongación: la enzima ADN polimerasa sinte- tiza una nueva hebra complementaria a la molde en sentido 5´ → 3´, siendo la más em- pleada la Taq polimerasa, de actividad óptima a 72 ºC (Fig. P46-2). El aparato empleado para llevar a cabo la re- acción es un termociclador. Cuando se requiere monitorizar a tiempo real la reacción de PCR (rtPCR) se le acopla un medidor de fluorescencia y los cebadores se diseñarán para que durante el proceso de elongación desprendan moléculas emi- soras de fluorescencia. SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Su determinación está basada en una PCR a tiempo real. Las sondas Taqman diseñadas son complementarias a cada uno de los alelos de los SNP y están marcadas con distintos fluorocromos (normalmente VIC y FAM). Mediante la detec- ción de la fluorescencia emitida por cada una de las sondas durante la PCR se puede conocer el ge- notipo del polimorfismo (Fig. P46-3). MSP (Methylation Specific PCR) La realización de esta técnica requiere un tra- tamiento previo del ADN con bisulfito sódico para transformar las citosinas no metiladas en uracilos, mientras que las metiladas permanecerán inalteradas (Fig. P46-4). Se diseñan los cebadores para analizar la me- tilación de una zona CpG específica, normalmente la región promotora de un gen. Los cebadores am- plifican una secuencia de 300 pares de bases de tamaño máximo y son diseñados en parejas tanto para el ADN metilado como para no metilado. Figura P46-3. Detección de un SNP mediante discrimi- nación alélica de fluorescen- cia. Figura P46-2. Amplificación del ADN durante la PCR. 1 2 ciclo 1 4 ciclo 2 8 2n ciclo 3 ciclo n ciclos ciclos A/A A/G G/G Fluorescencia (fluorocromoA) Fluoresencia (fluorocromoA) 10 Práctica 46-50:ok 15/12/10 8:57 Página 398
- 3. Posteriormente a lareacción de PCR se realiza una electroforesis en gel de agarosa cuantificando mediante un transiluminador la intensidad de cada una de las dos bandas amplificadas para cada muestra; para el ADN metilado y para el no metilado (Fig. P46-5). Material y equipos Extracción de ADN • Kit para la extracción de DNA, disponible en distintas casas comerciales. • Microcentrífuga. • Espectrofotómetro. SNP • Termociclador con medidor de fluorescencia. • Sondas Taqman marcadas con distintos fluoro- cromos (VIC y FAM). • Reactivos para la PCR a tiempo real. MSP • Termociclador. • Equipo de electroforesis. • Transiluminador. • Kit para tratamiento con bisulfito sódico. • Reactivos para la PCR (ADN polimerasa, Buf- fer 10 X, MgCl2 , nucleótidos y agua de biología molecular). • Cebadores para ADN metilado y no metilado. • Agarosa. • Tinción SYBR de ADN para geles. • Tampón TBE. Protocolo Extracción de ADN La obtención del ADN genómico de partida para los posteriores análisis se realiza mediante el protocolo de extracción del kit específico para ex- tracción de DNA. La calidad y cantidad del ADN final se analiza por espectrofotometría. SNP Para el análisis de la presencia de un polimor- fismo en una población hay que tener en cuenta Práctica 46. Nutrigenética y epigenética: técnicas de SNP y MSP 399 Figura P46-4. Tratamiento con bisulfito de citosinas metiladas y no metiladas, donde se puede apreciar que la citosina no metilada tras la reacción de PCR pasa a ti- mina y la metilada se man- tiene. Figura P46-5. Gel de agarosa para el análisis de la me- tilación de dos muestras. C G U G T G C met met met G C G C G bisulfito PCR Marcador de peso molecular no met no met met met muestra 1 muestra 2 10 Práctica 46-50:ok 15/12/10 8:57 Página 399
- 4. Parte II. Metodologíay aplicaciones400 tanto su prevalencia en la muestra como su posi- ble repercusión en el ámbito de investigación que se quiera realizar, en nuestro caso con la salud. Para ello, existen distintas bases de datos como la del proyecto HapMap (www.hapmap.org), un proyecto de desarrollo de un mapa de haplotipos del genoma humano. Tras la elección del polimorfismo de interés se seleccionan sus cebadores comerciales correspon- dientes marcados con los fluorocromos VIC y FAM según el haplotipo. Para la PCR se añaden 5 µL de muestra de ADN genómico a una concentración de 10 ng/µL, 4,5 µL de MASTER MIX comercial preparada y 0,25 µL de la sonda marcada con fluorocromo es- pecífico en cada pocillo de la muestra. Se realizan duplicados de cada muestra para cada una de las dos sondas marcadas. La programación de la re- acción de PCR en el termociclador con medidor de fluorescencia integrado será de 40 ciclos de copia con una temperatura durante la fase de unión de los cebadores de 72 o C. Para el análisis de los resultados, comparar los obtenidos con la figura P46-3. MSP Tratar 1 µg de ADN genómico con el kit de bisulfito sódico siguiendo el protocolo. El diseño de los cebadores se realiza me- diante el programa informático METHPRIMER (www.urogene.org/methprimer/index1.html). Pri- mero se selecciona la zona a estudio: el promotor (o, en ocasiones, inicio de la transcripción) de un gen, de aproximadamente 1.000 pares de bases previos al inicio de la transcripción, con alta den- sidad de sitios CpG, denominada isla CpG. Los cebadores resultantes deben ser optimizados para conocer su temperatura óptima para la unión al ADN (se recomienda realizar una PCR en un ter- mociclador con gradiente de temperatura), así como el número de ciclos de amplificación para poder apreciar con nitidez las bandas de la PCR en un gel de agarosa, pero sin llegar a una satura- ción en su exposición. Tras la optimización de los cebadores se rea- liza una PCR a número de ciclos óptimo aña- diendo 1 µL del ADN tratado con bisulfito, 2,5 µL de Buffer 10X, 1,5 µL de MgCl2 , 0,2 µL de la en- zima ADN polimerasa, 1 µL de un mix de los 4 nucleótidos a 20 mM, 1 µL del mix de cebadores a 20 mM y c.s.p. 25 µL de agua de biología mo- lecular. Tras la reacción de amplificación se realiza un gel con TBE 1X y 1,5% de agarosa con tinción SYBR de ADN. A los productos de la amplifica- ción se le añaden 5 µL de tampón de carga y se cargan en el gel, dejándolo correr en la cubeta de electroforesis con TBE 1X durante 1 hora a 100 voltios. El gel resultante se analiza con un transilumi- nador, con el que se cuantifica la intensidad de cada una de las bandas, la referente al ADN me- tilado y la de ADN no metilado. intensidad banda metilada % metilación = ––––––––––––––––––––––––––– × 100 intensidad banda metilada + intensidad banda no metilada BIBLIOGRAFÍA Campión J, Milagro FI, Martínez JA (2009). Individua- lity and epigenetics in obesity. Obes Rev 10: 83-392. Cordero P, Milagro FI, Campión J, Martínez JA (2010). Epigenética nutricional: una pieza clave en el rom- pecabezas de la obesidad. Rev Esp Obes 8:10-20. Livak KJ (1999). Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5´ nuclease assay. Genet Anal 14:143-149. Ordovas JM, Mooser V (2004). Nutrigenomics and nu- trigenetics. Curr Opin Lipidol 15:101-108. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS SNP Tipo de polimorfismo. MSP Porcentaje de metilación. 10 Práctica 46-50:ok 15/12/10 8:57 Página 400
- 5. Práctica 46. Nutrigenéticay epigenética: técnicas de SNP y MSP 401 COMENTARIOS 10 Práctica 46-50:ok 15/12/10 8:57 Página 401