Este estudio evaluó la aplicabilidad de la técnica MLST para distinguir cepas de Mycobacterium avium aisladas de niños y animales en Alemania. Se analizaron 101 cepas utilizando MLST en 5 genes y se identificaron 40 perfiles genéticos diferentes. La mayoría de las cepas de niños y cerdos pertenecían a la subespecie M. avium hominissuis y mostraron perfiles genéticos similares, lo que sugiere una posible transmisión entre estas poblaciones. MLST proporcionó una clasificación f

1. By:
Juan Pablo Ospina
Andrea Múnera López

2. The aim of this study was to asses the
feasibility of MLST and its applicability to
distinguish diferent M. Avium strains from
Germany. Thereby, the emphasis was on
strains isolated from children suffering from
Lymphadenitis

3. Mycobacterium is a genus within the order
Actinomycetales (Actinobacteria) that groups
a large number of species, that are associated
with human and animal diseases.

5. • Mycobacterium avium complex (MAC) is a type of
non-tuberculous mycobacterial (NTM) infection.
• Its entire genome consists of one DNA molecule (one
chromosome) of 5,475,491 nucleotides long, with a
GC (guanine cytosine) content of 68% and 32% for AT
(adenine thymine)

6. HIV INFECTION
PULMONARY DISEASE
INMUNOSUPRESSED
CERVICAL LINPHADENITIS
They are found in water,
soil, dust, and food.

7. M. Avium
Avium Silvaticum Paratuberculosis Hominissuis

8. Is a technique that identify isolates of
microbial species using DNA sequences from
housekeeping genes.
There are used 450 or 500 bp of each genes,
that are incorpored to the strands with a
automatic DNA sequencer.

9. • Each strand has a different allele sequence
and thats how it is recognized.

10. The relation of the MLST with the Mycobacterium
avium is that this technique is helpful to identify
the localization of the bacteria in different locus,
plus the results are not the same if the hosts are
changed.
Now a days, scientists can make the diference
between the M. Avium and other species of
mycobacterium but they can not easily
identificate the different subspecies of the M.
Avium

11. Niños: 43 cepas
36 gánglios linfáticos
2 pulmones
1 bazo
4 desconocidas
Cerdos: 21 Cepas
Gánglios Linfáticos
Ambiente: 6 cepas
Polvo
Tierra
Adultos: 6 Cepas
Esputo
Pájaros: 22 Cepas
*M.A. AVIUM 104 Referencia
*M.A. AVIUM ATCC 25291T y
M.A. Silvaticum ATCC 49884T
Control
La identificación de las cepas fue con el Genotype Mycobacterium CM Assay

12. Tras aislar el DNA de la célula, para estudiarlo
se necesitan miles o millones de copias, sea de
un fragmento de DNA o de un gen
determinado. Está técnica se puede hacer in
vitro utilizando la reacción en cadena
polimerasa.

13. • Desnaturalización del DNA
• Hibridación de una pareja de cebadores que
cortan por los extremos el fragmento de
interés
• Elongación de las cadenas
• El ciclo se puede repetir

14. • La identificación de las subespecies fue hecha
por la presencia de IS900 e IS901
• La secuenciación de ambas cadenas fue hecha
con los mismos primers que se usan en una
PCR

15. • M.A
Paratuberculosis
IS900
• M.A Avium
• M.A Silvaticum
IS901 • M.A Hominissuis
-

16. • Cada muestra se caracteriza por una secuencia única
de alelos.
• Se usan 450 a 500 pb de cada gen, los cuales se
incorporan a las cadenas con secuenciadores de DNA
automáticos.
• Para cada grupo los alelos de cada locis define un
perfil alélico o tipo de secuencia (ST).
• Cada cadena tiene una secuencia de alelos diferente
y así es como es reconocido.

17. Son los cambios en las bases nitrogenadas en
el sitio donde una enzima de restricción corta
un segmento de DNA, lo cual, afecta el
tamaño de los fragmentos que resultan del
corte.

18. Los fragmentos restantes de la PCR, son separados de
los cebadores con electroforesis en una solución de
agarosa, así, se posicionan en diferentes espacios
(Masa, carga eléctrica).
Se da un patrón diferente debido a las secuencias de
DNA de las muestras.
En este caso se uso un IS1245 RFLP

19. • NEGATIVO para IS900
• POSITIVO en 22 cepas de aves y una muestra humana para
IS901
• Ausencia de estos se presentaron en 5 adultos, 43 niños, 21
cerdos, 6 muestras ambientales, 2 pájaros y la muestra
referencia M.A. Avium 104.
M.A
Paratuberculosis
M.A. Avium
M.A Silvaticum
M.A.
Hominissuis

20. • Usa la diferencia de
las secuencias de
DNA que permiten
evidenciar
diferentes perfiles
de cada cepa.
Genes blanco:
RecF
lipT
pepB
Gnd1
est
450-500 pb

21. • Sólo los loci 4 y 5 mostraron variación.
• Loci recF, lipT, pepB y gnd1 fueron obtenidas
de todas las muestras de MA 101
• Todas las pruebas positivas para IS901 fueron
analizadas con est

22. • Secuencias diferentes basadas en polimorfismos de
un solo nucleótido (SNPs) fueron asignados para
cada secuencia de locis. La designación de alelos fue
hecha por Turenne.
• El número de secuencias diferentes para los alelos
encontrados en cada locus fue:
8: est
12:
gnd1
10: recF
y pepB
11: lipT

23. • Juntando las secuencias de todos los loci, un
perfil de MLST fue obtenido, el ST.
• Un total de 40 STs diferentes fue identificado
en las cepas analizadas de 101 M.A
• Se encontraron muchas diferencias entre el
M.A Silvaticum/M.A Avium y el M.A
Hominissuis

24. • 30 STs se identificaron como M.A Hominissuis
• 23 STs se identificaron como M.A Avium/M.A
Silvaticum
• Se encontraron grupos de cepas idénticos en
adultos, niños, cerdos y el ambiente
• Hubo grupos en los que se encontraron
diferentes STs en cerdos de la misma granja

25. • 48 Cepas aisladas de
diferentes
especímenes y
huéspedes.
• 10 grupos
mostraron
diferencia en las
cepas con el MLST.
• 5 grupos mostraron
alta relación con el
MLST.
A A C A A N C
Kb
21.2
5.1
5.0
4.3
3.5
2.0
1.9

26. • Para dos grupos de MSLT (ST46-ST53) los
grupos 3 y 2 mostraron grupos idénticos
• RFLP fueron identicos en niños y ambiente, los
cerdos mostraron resultados muy diferentes

27. Las muestras de niño
fueron idénticas en
ambas pruebas (MSLT
y RFLP)
Kb
21.2
5.1
5.0
4.3
3.5
2.0
1.9

28. Recently, MLST analysis has
been developed as a rapid,
easy, but highly reliable
molecular technique for typing
of M. avium strains (Turenne et
al., 2008).

29. The detection of ‘M. avium subsp. hominissuis’ in soil
and dust in our study might indicate a source of
infection for children. All of our analyzed slaughter
pigs were infected with strains of the subspecies ‘M.
avium hominissuis’ which is in contrast to Möbius et
al. (2006) who found M. avium subsp. avium/M.
avium subsp. silvaticum infections in pigs originating
from Germany.

30. Since both strains clustered together with
strains isolated from children and pigs this
finding could suggest the possibility that
‘M. avium subsp. hominissuis’ strains might
be transmitted from birds to children as it
has been hypothesized earlier
(Bruijnesteijn van Coppenraet et al., 2008).

31. One advantage of the MLST
method is its applicability to ‘M.
avium subsp. hominissuis’
strains without IS1245 elements
(Ritacco et al., 1998; Komijn et
al., 1999; Álvarez et al., 2008;
Ichikawa et al., 2009)

32. • Not only a technique can give a reliable result,
you need to perform multiple tests to start
talking about data significant
• Electrophoresis is a good method to separate
molecules by their physical compositions and
it´s used to identify genetic polymorphisms
among samples.

33. • PCR for detection of IS901 is not a definitive
proof of M. avium subsp. avium/M. avium subsp.
silvaticum. That´s why they use the MLST
method. But PCR is the first step for RFLP
technique, because is the one that amplifies the
DNA to make electrophoresis.
• Germany, tuberculous lesions in slaughtered pigs
due to infection with members of the
Mycobacterium avium complex are increasingly
reported.

34. Consultado en:
• http://www.mlst.net/
• http://www.jcvi.org/
• http://www.fao.org/
• http://www.javeriana.edu.co/Genetica/PDFD
OC/POLIMORFISMO%20GENETICO.pdf