Alejandro Cardona Echandía Samuel Builes Baena

1. Presentado por:
Samuel Builes Baena – Alejandro Cardona Echandía.
Estudiantes de medicina.
Biología Molecular– Tercer semestre.
Agosto 2015.
Facultad de Ciencias de la Salud.

2. Tabla de Contenidos
1.Introducción.
2.Objetivo general.
3.Materiales y Métodos.
4.Resultados.
5.Discusión.
6.Conclusiones.
7.Mapas Conceptuales.

3. Introduction
Dengue
“DENVs”
4 serotypes
genomic RNA 11Kb
3 structural proteins at
the N terminus.
Core ( C) ; membrane (M) ;
envelope (E)
7 non estructural proteins
NS1,NS2A,NS2B,
NS3,
NS4A,NS4B,NS5
Composed of
Main
protagonist
at this
research

4. Introduction: Dengue
disease
Dengue It is a disease that is limited primarily to the tropics
because it is transmitted by a tropical mosquito “Aedes aegypti”. It
belongs to the family of “Flaviviridae” and the flavivirus genere.
The most common
syntoms/signs: headache,
fever, rash, plausible
circulatory problems that
could lead towards
complicated hemorrhaging
and maybe even death.
There is no
available vaccine
or specific
antiviral
treatment yet.
Virulency factors: associated with the 4
types of serotypes(DEN1,DEN2,DEN3,DEN4),
being the DEN4 the most common cause
of the disease.

5. Introduction
Dengue diagnosis includes:
1. Detection by cell culture,
2. ELISA
3. Hemmaglutination inhibition test
4. Complement fixation test,
5. Neutralization test,
6. RT-PCR (Reverse transcription PCR)
RDT
“Rapid Diagnostic Test” it is an assay
designed for use at POC ( point of care) in
order to have a certain early diagnosis and
posible treatment when the disease has just
started or it is previous to starting.
Advantages: low cost, easy readability,
temperature stability, fast result delivery. and
simple operations.

6. DENV
NS1
Introduction
≈48-kDa glycoprotein essential for
RNA replication.
↑[ ] can be detected in patients with
primary and secundary DENV infections
up to 5 days after the onset of illness.
Most attempts at purifying a
highly antigenic NS1 protein in
order to create useful
antibodies failed in the past
As researchers
ended up
creating insoluble
proteins

7. In this
study
Introduction
• DENV2 NS1 protein was expressed
properly with high purity in the
bacterial expression system ( E.Coli
) in a soluble form.
• The antigenic protein was used to
create specific monoclonal
antibodies (mAbs) and by that, an
RDT was created using isolated
DENV NS1-specific mAbs.

8. Main objective:
The main purpose of this research was to create a viable and
easy way to use RDT linked towards being able to diagnose
dengue disease by using the recognition of a non estructural
protein of the dengue virus which is the NS1 kind. If the
experiment succeded, it could mean the existence of a reliable
test that can be used in remote areas to determine the disease
and being able to attack rapidly the causes that brought it to
the patient, saving his or her life.

9. Materiales y métodos

10. Materiales y métodos
Muestras clínicas:
El suero de 100 donadores
sanos fueron entregados
por el hospital universitario
nacional de Chugbuk
(Korea)
42 muestras de suero positivas
para el antígeno NS1 para el
dengue se obtuvieron de 3
hospitales
17 del hospital
Rio de Janeiro
(Brazil)
15 del hospital Kuala
Lumpur (Malasia)
10 del hospital
Bombay (India)
Todas las muestras se pasaron por RT-PCR
para confirmar infección por DENV y
determinar el serotipo presente

11. Materiales y métodos
Clonación de DNA complementario de DENV2 NS1
“Es la amplificación de RNA desde la síntesis de su DNA
complementario utilizando una transcriptasa inversa, seguido
de varios ciclos de PCR convencional se realiza
para determinar la expresión de genes para incrementar la
fiabilidad del análisis de la expresión del gen”
RNA DENV
extraido del
plasma de
una paciente
cDna se le
realiza
transcriptasa
inversa
Gen NS1 se
amplifica con
PCR usando
un cebador
directo( 5’-3’)
y uno reverso
( 5’-3’)
Se inserta el
dna
amplificado
en Pgem-t y
en pET32a

12. Materiales y métodos
Expresión y purificación del recombinante de la proteína NS1
Recombinante se
transforma en una
E.coliBL21
químicamente
competente y se cultiva
en medio LB
Celulas se cosecharon por
centrifugación fría, lisaron
por sonicación y la fracción
solulbe se separó por
centrifugación fría
El sobrenadante
recolectado se introdujo en
una columna precalibrada
de celulosa DEAE.

13. Materiales y métodos
Producción y determinación del isotipo de los mAbs
“Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno
inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a
una enzima capaz de generar un producto detectable,
como cambio de color o algún otro tipo”
Raton
inmunizado
con
recombinante
NS1 y un
adjuvante en
procesos
repetidos de
3 inyecciónes
Ultimas 2
inyecciones
con el
adjuvante
incompleto
en intervalos
de 3 semanas
Fusión de un
hybridoma se
hizo 3 días
después ultima
inmunización,
los que
producían
anticuerpos se
veían en ELISA
indirecta
ELISA indirecta se
usa para medir la
afinidad de los
mAbs y la mezcla
antígeno-
anticuerpo se pasa
a unos pozos donde
recombinantes NS1
se presentan

14. Materiales y métodos
Preparación tiras de RDT + interpretación resultados
Los 2 anticuerpos fueron inmovilizados en posiciones
apropiadas en unas membranas de nitrocelulosa
Linea de control: 1mg/ml de “goat anti-mouse IgG”
Linea del test: 1mg/ml de anti-NS1 mAb
1. Se usó 142 sueros humanos para ensayar los RDT
2. 100 microlitros suero se monta en los pozos de muestras
3. Se interpreta a los 15 y 30 minutos en espera de observar
un falso positivo
4. Sí aparece una banda roja en la línea del test, significa
que el espécimen tiene presentes antígenos NS1

15. 4. RESULTADOS

16. 4.1) Clonación del gen NS1.
• La amplificación del Gen NSI 1056 bp.
• El gen NS1 clonado fue de aproximadamente 96%
idéntico al gen NS1 de DENV2, pero 70% idéntico a
los de otros serotipos, lo que sugiere que se originó
a partir de DENV 2.

18. 4.2) Expresión y purificación de la proteína recombinante DENV 2 NS1.

19. • Toda la proteína DENV2 NS1 fue exitosamente expresada como una proteína
recombinante soluble y purificada bajo condiciones nativas.
• El segundo paso de purificación elevó extremadamente el grado de pureza
de la proteína NS1.
Después del
segundo paso de
purificación
1 mg/L de proteína
pura
1 L de cultivo de
la bacteria
40 mg de proteína
55
kDa

20. 4.3) Antigenicidad de las proteínas NS1 DENV 2 purificadas.

21. • Utilización de SD BioLine Y PanBio Dengue NS1 Ag Kit. RDT
10 ng
PanBio
SD BioLine
Resultado
positivo
Resultado
positivo
Tinción en las
bandas

22. 4.4)Generación de mAbs contra la proteína NS1 recombinante.

25. 3E12E6
4A6A10
8H4B10
10G3H5
Captura de
Anticuerpos
Conjugación de
anticuerpos

26. 4.4)Generación de mAbs contra la proteína NS1 recombinante.

29. 5. DISCUSSION

30. RESEARCHERS HYPOTHESIS PROOF
Bessoff (2008).
Blacksell (2008).
Dussart (2008).
Hsieh and Chen (2009).
Kumarasamy
A DENV NS1 protein is known as a
prospective antigen to diagnose early
dengue infection.
Hang et al., 2009
The sensitivity of test kits is still
unsatisfactory.
Amorim (2010).
Das (2009).
Huang (2001).
Lazaro-Olan (2008).
Since the study aims to generate mAbs
highly specific for the DENV NS-1
protein, The priority considered in
protein expression and purification was
to obtain a natively antigenic protein at
high purity rather.
Osorio (2010).
Tricou (2010).
The specificity of those NS1-based
dengue tests is reported to be variable
ranging from 86.1% to 100%.
The sensitivity is even more variable
between 37 % and 98.9%.

31. 6. CONCLUSIONS

32. • The introduction of RDT markedly improved early detection of dengue
disease, preventing the worsening of symptoms and reducing the period of
illness.
• The stimulation of the antigenicity improves the creation of antibodies. That
item becomes very important because it could be the target of the creation
of medicaments and drugs aimed at improvement in treatments.
• With a clear knowledge of pathophysiological of Dengue mechanisms, we
could generate better and more efficient treatments to this pathology, that
can generate a stop in the disease progression reducing consequences, such
as the hemorrhagic or severe dengue.
• Based on the same foundation of the previous one, we conclude that its
important to investigate and treatments to prevent and avoid the disease.

33. 7. MAPAS
CONCEPTUALES

36. GRACIAS
“Entonces profe, como vamos
con ese 5.”
Messi