Este documento presenta una guía de laboratorio para la identificación de cocos Gram positivos a través de pruebas morfológicas y bioquímicas. Describe los objetivos, materiales, procedimientos y resultados esperados para pruebas como la tinción de Gram, catalasa, coagulasa, hemólisis, sensibilidad a antibióticos y prueba de PYR para diferenciar especies de Staphylococcus y Streptococcus.

1. Guía de laboratorio
Dra. Katherine Rodríguez Ortiz
Microbiología II
PRÁCTICA Nº 1: IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM (+)
1. Objetivos
- Identificar el género y la especie de las cepas problema.
- Aprender a realizar las pruebas bioquímicas para diferenciar especies
importantes de Staphylococcus y Streptococcus.
- Describir las reacciones que se presentan en las distintas pruebas
2. Materiales y equipos
- Cepas bacterianas
- Agua oxigenada
- Agar sangre
- Discos de bacitracina y optoquina
- Plasma citratado
- Escala de MacFarland Tubo 0.5
- Solución fisiológica
- Asas microbiológicas
- Tubos de hemólisis
- Hisopos estériles
- Portaobjetos
- Gradillas
- Mecheros
- Microscopios con objetivo de inmersión
3. Procedimientos
3.1 Identificación morfológica con tinción Gram
• Preparar el frotis bacteriano
• Teñir con cristal violeta (1minuto)
• Aplicar mordiente: lugol (1 minuto)
• Decoloración con alcohol-acetona
• Teñir con safranina (30 seg)
Entre cada paso proceder a lavar los colorantes con agua destilada. Realizar la
observación microscópica con el objetivo de inmersión.
3.2 Pruebas de identificación bioquímica
Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas que ponen en evidencia la
existencia de una enzima o pasos metabólicos determinados.
3.2.1 Prueba de la catalasa
• Objetivo: Permite identificar la presencia de la catalasa en ciertas
cepas bacterianas. En el caso de los cocos Gram (+) distingue el
género Staphylococcus (catalasa +) del género Streptococcus
(catalasa -)

2. Guía de laboratorio
Dra. Katherine Rodríguez Ortiz
Microbiología II
• Fundamento químico: La enzima catalasa descompone el peróxido de
hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O +
O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2,
que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares
para la obtención de energía.
• Procedimiento: Con un asa se transfiere una porción de la
colonia en estudio sobre un portaobjetos, inmediatamente después
se coloca encima una gota de H2O2 al 3%. Si la colonia proviene de
un medio con sangre, tomar en cuenta que los eritrocitos tienen
catalasa y podrían provocar falsos resultados.
Esta prueba también puede realizarse a partir de un aislamiento en
tubo, colocándose directamente unas gotas de H2O2 dentro del mismo.
• Interpretación de resultados: El desprendimiento de burbujas se
considera una prueba positiva.
3.2.2. Prueba de la coagulasa
• Objetivo: Permite separar S.aureus, que posee coagulasa, de las otras
especies de Staphylococcus que en conjunto se denominan
coagulasa negativos.
• Fundamento: S.aureus posee dos tipos de coagulasa: una
endocoagulasa o coagulasa ligada (factor de agregación “clumping
factor") que está unida a la pared celular. Esta actúa sobre el
fibrinógeno provocando que los Staphylococcus se agreguen o
formen grumos (test en portaobjetos).
Una exocoagulasa o coagulasa libre que reacciona con el fibrinógeno
produciendo la formación de un coágulo de fibrina (test en tubo).
Test en lámina
• Procedimiento: Se emulsionan una o más colonias en una gota de
suero fisiológico hasta formar una suspensión lechosa sobre un
portaobjetos. Luego se agrega una gota de plasma citratado de conejo
y se mezclan.
• Interpretación de resultados: Debe realizarse dentro de los primeros
diez segundos. Una prueba positiva se evidencia por la formación de
grumos. Las pruebas negativas deben ser confirmados por test en
tubo.
Test en tubo
• Procedimiento: Se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5ml de
plasma citratado de conejo. Se incuba a 37ºC y se chequea la
formación del coágulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la
noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4
horas, es importante porque en alguna oportunidad puede suceder que
las fibrinolisinas de S.aureus lisen el coágulo luego de 18 horas de
incubación y de esta manera se produzcan un resultado falso negativo.

3. Guía de laboratorio
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• Interpretación de resultados: Se observa la formación de un coágulo
total o parcial si el test es positivo.
3.2.3 Observación de la hemólisis
• ß hemólisis: aquélla donde se produce una hemólisis total de los
glóbulos rojos, observándose un halo transparente alrededor de las
colonias.
• α hemólisis: aquélla donde se produce hemólisis parcial de los
glóbulos rojos , la cual se observa como un halo con tonalidad
verdosa alrededor de las colonias.
• γ hemólisis: aquélla donde no se produce hemólisis en el agar
sangre.
3.2.4 Sensibilidad a la bacitracina
• Objetivo: Separar el Streptococcus pyogenes de los demás
Streptococcus beta hemolíticos
• Fundamento: Streptococcus pyogenes es sensible a bajas
concentraciones de Bacitracina (discos conteniendo 0,04U).
Aunque existe un 5% de cepas de S. agalactiae que también son
sensibles.
• Procedimiento: Se realiza sembrando un gran inóculo, tomado con
asa bacteriológica de un cultivo puro, que se estría sobre una placa
de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un
crecimiento confluente. Luego se coloca el disco de Bacitracina y se
incuba 18-24 horas a 37ºC.
• Interpretación de resultados: La aparición de cualquier diámetro
de halo de inhibición de crecimiento alrededor del disco se
considera prueba positiva.
3.2.5. Prueba de CAMP
• Fundamento: Se basa en que los Streptococcus del grupo B
producen un factor llamado CAMP (factor de monofosfato adenina
cíclica) que potencia la zona de hemólisis producida por un
Staphylococcus productor de ß hemólisis.
• Procedimiento: Inicialmente, se realiza una estría horizontal de
un Staphylococcus productor de ß hemólisis en la parte central
de un agar sangre, luego se realizan una o más estrías
perpendiculares a la anterior de la(s) cepa(s) problema. Incubar
18-24 horas a 37ºC.
•

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Microbiología II
• Interpretación de los resultados: La prueba positiva se evidencia
por la presencia de una zona de potenciación de la hemólisis
en forma de punta de flecha en el lugar
donde se conectan las dos estrías.
3.2.6 Sensibilidad a la optoquina
• Objetivo: Diferenciar S.pneumoniae de otros Streptococcus alfa
hemolíticos.
• Fundamento: Se basa en la sensibilidad de la cepa a una
concentración menor o igual a 5 ug/ml de hidroxicupreína
(optoquina).
• Procedimiento: Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre
en varias direcciones con una suspensión igual al tubo Mc
Farland 0,5. Colocar luego un disco de optoquina en el centro del
área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC.
• Interpretación de resultados: Halos de inhibición mayores de
15mm indican sensibilidad a la optoquina.
3.2.7 Prueba de PYR
• Objetivo: Permite la identificación de Streptococcus pyogenes y
Enterococcus spp.
• Fundamento: Permite la identificación presuntiva de ciertas
bacterias en base a la actividad enzimática de
pirrolidonilarilamidasa (PYRasa). Los microorganismos que
contienen esta enzima hidrolizan en forma rápida el sustrato
presente en los discos y liberan un grupo pirrólico que reacciona con
el reactivo cinamaldehído originándose un compuesto de color
rosado-rojizo.
• Procedimiento
A partir de un cultivo puro en agar sangre del microorganismo en
estudio del cual se ha identificado que son cocos Gram positivos
catalasa negativa, hacer una suspensión densa en 0.5 ml de
solución fisiológica estéril y agregar un disco de PYR.
Incubar en aerobiosis a 35 – 37ºC durante 30 minutos.

5. Guía de laboratorio
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• Interpretación de resultados
Agregar dos gotas de reactivo cinamaldehído y dejar a temperatura ambiente
durante 5 minutos. Observar el color desarrollado.
Positivo: presencia de actividad enzimática pirrolidonilarilamidasa: disco color
rosado a rojo
Negativo: ausencia de actividad enzimática pirrolidonilarilamidasa: disco y/o
solución color amarillo o incoloro
BIBLIOGRAFIA
Koneman, Allen, Janda. Diagnostico microbiológico. 6º ed. Edit. Panamericana.
2009.