Este documento resume varias técnicas microbiológicas clásicas para detectar patógenos alimentarios como Salmonella, E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, enterococos, aerobios mesófilos totales, Clostridium sulfito-reductores y flora micótica total. Describe los medios de cultivo, condiciones de incubación y apariencia de las colonias para cada microorganismo. El autor también proporciona detalles sobre las fotografías utilizadas y agradece al lector por completar el cuart

1. La microbiología de los
alimentos – Parte 4
Dr Santiago Pablo Baggini

2. MARCHAS MICROBIOLÓGICAS CLÁSICAS EN
PATÓGENOS ALIMENTARIOS
Los alimentos, para que se
consideren de buena
calidad higiénica, deben
estar exentos de
microorganismos
peligrosos, pero en general
no es posible examinar los
productos o alimentos para
investigar la presencia de
todos y cada uno de tales
organismos.

3. ACLARACIÓN
Las fotografías de la presentación, son propiedad del autor y
publicadas oportunamente con sus fuentes en su Blog científico:
SEGURIDAD ALIMENTARIA, BROMATOLOGÍA y MICROBIOLOGÍA
de los ALIMENTOS (www.bagginis.blogspot.com)

4. ENTEROBACTERIAS (ISO 21528-1:2017)
• Sembrar en una placa de Petri estéril, 1 ml de la solución
homogeneizada madre (siembra en profundidad), y luego se coloca
una capa de Agar VRBG o VRBL a 45° C.
• Cuando solidifica se le coloca una segunda capa del mismo agar sobre
la anterior (siembra en doble capa).
• Incubar por 24 hs a 37° C y se cuentan las colonias de coliformes
totales que serán rosadas por ser éste un medio específico para
contaje de las mismas.
• Para determinar la presencia de Escherichia coli, se sembrarán 10 ml
del homogeneizado primario en 10 ml de Caldo BRILA, incubándose
48 hs a 44° C.
• Si hay formación de gas y viraje del color verde del medio al amarillo,
se presume la presencia de E. coli, la cual debe confirmarse repicando
en siembra por estrías y en superficie sobre una placa de Agar EMB
de Levine.

5. ENTEROBACTERIAS

6. AEROBIOS MESÓFILOS TOTALES (ISO 4833-1:2013)

7. AEROBIOS MESÓFILOS TOTALES (ISO 4833-1:2013)
• Usar agar PCA y llevar a cabo con una dilución del orden de 10-5.. En primer lugar, se
toman 10 g de una muestra representativa del producto total, se añaden 90 ml de
agua peptonada en una bolsa estéril de Stomacher, y tras someterlo a
homogenización, ya tenemos lista la dilución 10-1 de la muestra.
• A continuación, se realiza tantas diluciones como sean necesarias tomando 1 ml. de
la dilución anterior y añadiéndola a un tubo de ensayo que contenga 9 ml. de
solución fisiológica y así sucesivamente.
• Se toman tantas pipetas estériles como diluciones sea preciso realizar. En el caso de
la siembra en masa, se vierte 1 ml de muestra en la placa de Petri y a continuación
se vierten unos 15 ml de PCA.
• Finalmente, se invierte la placa para que no se produzca condensación y se
introduce en una estufa a 30ºC que es la temperatura óptima de crecimiento para
lo que pretendemos determinar durante 24, 48 y 72 horas. Pasado este tiempo, se
saca la placa de la estufa y se hace un recuento de las colonias.

8. ENTEROCOCOS (ISO 7899-2:2000 )
• Se investigan en agua por filtración de
membrana y los filtros se colocan en la
superficie de placas de Petri con Agar
bilis esculina azida de sodio o Agar KF
Streptococcus.
• Incubar a 35 ± 2 °C por 24 h y luego
transferir al mismo agar e incubar a 44°C
por 2 h.
• Determinar el color de las colonias
típicas que crecen sobre cada medio de
cultivo y se realizar su recuento. Los
resultados se expresaron como UFC/100
mI.
• Considerar colonias típicas aquellas con
coloración marrón o negro en el medio
de referencia y se reportar como
enterococos.

9. SALMONELLA (ISO 6579-1:2017 )
 Enriquecimiento en medio líquido
no selectivo: 25 g de la muestra con
120 ml de agua de peptona estéril,
incubar a 37ºC durante 12-24 horas.
 Enriquecimiento en medio líquido
selectivo: 10 ml del homogeneizado
anterior a 100 ml de caldo
tetrationato o caldo selenito cistina.
Incubar a 37ºC y a 43° C durante 24
horas.
 Pasar un asa de siembra del caldo de
enriquecimiento a placas con Agar
SS Salmonella-Shigella y Agar XLD.
Incubar a 37ºC durante 24 horas.
 En agar SS, colonias típicas incoloras
y el medio vira a amarillo, en agar
XLD son rojas y transparentes.
 Colonias sospechosas se siembran en
agar Kliger incubándose a 37ºC
durante 24 horas. Coloración
amarilla en el fondo indica la
utilización de glucosa, mientras que
la de la superficie indica lactosa.
Fondo negro refleja presencia de
H2S.
 Colonias sospechosas van a agar
Manitol incubándose a 37ºC durante
24 horas. Coloración amarilla indica
(+).
 Colonias sospechosas van a agar
Urea incubándose a 37ºC durante 24
horas. Color rosa indica (+).

10. SALMONELLA Y SHIGELLA EN AGAR HEKTOEN

11. SALMONELLA EN AGAR SS

12. STAPHILOCOCCUS AUREUS ISO 6888:2000
• El inóculo se lleva a un medio preselectivo como lo es el Caldo Giollitti – Cantoni adicionado con
telurito de potasio como inhibidor, incubándose 24 hs a 37° C.
• Se repica en Agar Baird Parker y después de 24 – 48 horas de incubación a 37º C, S. aureus
produce en el medio colonias negras rodeadas de una zona clara (de 2 – 5 mm de anchura); en el
interior de esta zona hay otra opaca más pequeña que sólo se desarrolla en la última fase de la
incubación. Estas reacciones son muy específicas de S. aureus, pero debe hacerse una prueba
confirmativa (reacción de la coagulasa).

13. BACILLUS CEREUS ISO 7932-1:2015
• Los medios selectivos como el agar
PEMBA, llevan polimixina, ya que
Bacillus sp., no es afectado por este
antibiótico y un indicador a base de
yema de huevo y manitol, junto con
un indicador de pH.
• B. cereus se identifica por la zona
opaca que rodea las colonias después
de 24 horas de incubación a 37º C.
• B. cereus no fermenta el manitol por lo
que sus colonias son pálidas, con una
coloración púrpura del agar que las
rodea, mientras que las bacterias
fermentadoras del manitol dan unas
colonias amarillas.

14. FLORA MICÓTICA TOTAL ISO 21527-2:2008
• La siembra de las placas de recuento se
lleva a cabo en masa. A partir de la serie
de diluciones decimales se añade 1 ml de
la dilución 1/10 y 1/100 en sendas placas
de Petri vacías en las que se añade agar
YGC con cloranfenicol (20 ml/placa
aproximadamente) atemperado a 45 -
47ºC.
• Las placas se incuban, SIN INVERTIRLAS, a
24ºC durante 4 - 5 días. El recuento se
realiza en la placa que presente un
crecimiento entre 0 - 50 colonias.
• El crecimiento de mohos y levaduras se
caracteriza por el aspecto algodonoso y
cremoso de sus colonias,
respectivamente.

15. • La detección de Clostridium sulfito – reductores se logra utilizando
medios de cultivo en cuya fórmula interviene el sulfito de sodio,
como el medio SPS, en los que, por la capacidad de estos
microorganismos de reducir tal sustancia, se produce sulfuro de
hierro al actuar sobre el compuesto de hierro.
• La presencia de sulfuro de hierro se pone de manifiesto por la
aparición del color negro de las colonias.
• El cultivo de Clostridium exige una atmósfera exenta de oxígeno, lo
que se consigue mediante el cultivo en anaerobiosis.
• La siembra se hace introduciendo la pipeta con el inóculo hasta el
fondo del tubo y soltándolo lentamente de abajo a arriba. Una vez
hecha la siembra en cada tubo y con cada dilución, y habiéndose
solidificado el medio, se obturan con una capa de agar nutritivo
estéril. Los tubos se incuban a 46º C durante 24 – 48 horas. Se
cuenta el número de colonias negras crecidas y se multiplica por el
factor de dilución del tubo.
SULFITO REDUCTORES ISO 7937:2005

16. SULFITO REDUCTORES EN AGAR SPS

17. Este es el
final del
4to módulo,
nos vemos en
el 5to,
muchas
gracias