Guia laboratorio de microbiologia dbio 1021 version 5.0 201720

DCBQ-DBIO1021 V5.0-2017 Página 1 de 114
Laboratorio de Microbiología
DBIO 1021
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
2 0 1 7

NORMATIVAS GENERALES EN EL TRABAJO
DE LABORATORIO
Es muy importante para su seguridad y la de sus compañeros observar siempre las siguientes medidas
mínimas de seguridad.
Es obligatorio concurrir al laboratorio con delantal blanco, lápiz dermográfico o plumón de tinta permanente
y fósforo.
El mesón debe estar libre de todo objeto no útil para desarrollar su trabajo; al finalizar, déjelo limpio y libre
de material o equipo ajeno a su implementación normal.
Todo el material que use en el laboratorio debe considerarse como “CONTAMINADO” y, por lo tanto, debe
manejarse con cuidado procurando no dejarlos en los mesones, elimínelos sólo en los recipientes dispuestos
para ello.
En la eventualidad de cualquier accidente, por pequeño que parezca, debe comunicarse inmediatamente al
profesor a cargo de la actividad.
Respete siempre las indicaciones que se darán durante las primeras actividades prácticas respecto al uso del
mechero, asas, tubos u otros materiales.
Está estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento o bebida en el laboratorio.
No haga bromas, ni permita que sus compañeros las hagan, con cultivos bacterianos o material contaminado.
Jamás debe sacar material contaminado o cultivos bacterianos fuera del laboratorio.
Antes de abandonar el laboratorio lave cuidadosamente sus manos.
¡¡Recuerde!!
El principal responsable de su seguridad es usted

PRINCIPIOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO
La protección del personal y ambiente del laboratorio se logra mediante la aplicación de técnicas y normativas de
seguridad ya establecidas.
REGLAS GENERALES PARA EVITAR RIESGOS
I. Riesgos Físicos.
1. Asegurarse de que todos los equipos tengan línea de conexión a tierra, realizada por personal idóneo.
2. No manipular equipos o realizar conexiones con las manos húmedas.
3. Mantener un elevado nivel de seguridad a irradiaciones por luz ultravioleta u otro tipo de radiaciones.
II. Riesgos Químicos.
1. Almacenar los materiales volátiles, inflamables y tóxicos en un gabinete metálico o en una habitación aislada
del edificio. El lugar debe ser frío y bien ventilado. Estos materiales deben mantenerse en sus envases originales.
2. No transferir grandes volúmenes de líquidos peligrosos.
3. Transferir los materiales volátiles o inflamables en habitaciones bien ventiladas, bajo campana.
4. Evitar almacenar juntos reactivos incompatibles o explosivos.
5. Etiquetar todos los reactivos adecuadamente según el riesgo, indicando con dibujo de una calavera en el caso
que sean productos tóxicos.
6. Tener disponible neutralizantes para cualquier emergencia.
7. Tener disponibles extintores de incendios.
III. Riesgos Microbianos.
1. Debe darse estricto cumplimiento a las normativas, con el fin de minimizar los riesgos de contaminación,
enfermedades y asegurar confiabilidad de los análisis efectuados.

UNIDAD DE APRENDIZAJE I
ESTRUCTURA Y CRECIMIENTO BACTERIANO
Resultados de aprendizaje
• Describe morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana en preparaciones microscópicas de
acuerdo a tinciones habituales de laboratorio.
• Relaciona la modificación de distintos factores abióticos con las características del crecimiento bacteriano
en relación a un medio de cultivo estándar.
Esta unidad se desarrollará en 6 sesiones que incluirá las siguientes actividades:
Sesión 1.
Indicaciones generales de la asignatura
Sesión 2.
Trabajo práctico 1. Bioseguridad en el laboratorio y materiales de trabajo
Sesión 3.
Trabajo práctico 2. Estructura bacteriana. Observación macroscópica de colonias bacterianas
Sesión 4.
Trabajo práctico 3. Estructura bacteriana. Observación microscópica de bacterias
Sesión 5.
Trabajo práctico 4. Crecimiento bacteriano.
Sesión 6.
Trabajo práctico 5. Crecimiento bacteriano. Discusión de resultados

LAS BACTERIAS:
NUESTRO OBJETO DE ESTUDIO
Las bacterias son organismos unicelulares, cuyo tamaño varía de acuerdo a la especie y a las condiciones de
cultivo. Las bacterias que se relacionan con el ser humano tienen un tamaño que se encuentra entre 0,5 y 5 μm.
El ojo humano tiene un poder de resolución de aproximadamente 100 μm, por lo que tamaños menores a este
resultan imperceptibles.
Dos ejemplos de tamaños bacterianos:
a) Las células individuales de bacterias de los géneros Staphylococcus y Streptococcus, comúnmente asociadas a
cuadros infecciosos de tipo piógeno, tienen una forma esférica con un diámetro entre 0,75 y 1,25 μm.
b) Escherichia coli, bacteria considerada como habitante normal del intestino de mamíferos (incluyendo el
humano), tiene forma de cilindro con un diámetro de 0,5 a 1,0 μm y un largo de 2 a 3 μm.
Figura 1. A) Tamaños relativos de células. B) Comparación de tamaño relativo entre bacterias y virus
A
B

PRINCIPALES HERRAMIENTAS DE TRABAJO MICROBIOLÓGICO
a) Mechero:
El mechero es el principal elemento que nos ayuda a trabajar en forma estéril, este sirve para esterilizar el asa
microbiológica, flamear la boca de tubos de ensayo, pipetas, portaobjetos, etc. y para mantener un ambiente de
trabajo estéril.
b) Placas de Petri:
Placas de vidrio o de plástico en las cuales se deposita una determinada cantidad de medio de cultivo sólido (altura
≈ de 4 mm). Consta de una base y una tapa, debe mantenerse cerrada, excepto en los breves momentos en que
debe sembrarse el medio de cultivo.
c) Asas:
Instrumento con un mango y un alambre (nicrom) en la punta. Existen dos tipos: asa recta (que termina en punta),
y asa en anillo (un pequeño círculo en el extremo). Sirven para sembrar muestras bacterianas en superficie y en
profundidad (asa recta) y para sembrar en superficie y trasladar pequeñas gotas (asa en anillo).
d) Pipetas Pasteur:
Es un tubo angosto que termina en punta, puede ser de vidrio o de plástico, estériles o no. Sirve para trasladar
material líquido (gotas) o bien para diseminar siembras acodando un extremo o formando un rastrillo. Debe
romperse la punta y esterilizarse antes de ser utilizada.
e) Pipetas Graduadas:
Son las pipetas corrientes utilizadas en química, pero que para el uso microbiológico deben esterilizarse en horno
Pasteur envueltas en papel. Al desenvolverse deben flamearse al mechero.
f) Tubos de ensayo:
En microbiología los tubos de ensayo deben esterilizarse en horno Pasteur y taponarlos con algodón hidrófobo o
con tapas especiales de goma o plástico. Debe flamearse la boca del tubo cada vez que se saque la tapa y antes
de volver a colocársela.
g) Microscopio:
En microbiología se emplea el objetivo 40 X para observaciones sin tinción (al fresco) y el objetivo 100 X para
observaciones por inmersión (con aceite) en preparaciones teñidas. El microscopio debe quedar perfectamente
limpio después de finalizada la observación correspondiente.
h) Estufa de Cultivo:
Los productos biológicos o siembras de bacterias en medios de cultivo deben cultivarse en estufas que se
encuentran generalmente a una temperatura de 35 - 37°C.
i) Baño María:
Consiste en un recipiente con agua de la llave que tiene una fuente de calor para mantener una determinada
temperatura. Generalmente se hace hervir el agua, por ejemplo, para fundir el agar en los tubos con medio de
cultivo sólido.

j) Horno Poupinel o Pasteur:
Es un aparato que sirve para esterilizar todo el material de vidrio que se utiliza en microbiología. La esterilización
se realiza a 180°C por una hora Es una esterilización en seco.
k) Autoclave:
Es un aparato que sirve para esterilizar medios de cultivo (agares, caldos, etc.) y también para esterilizar material
contaminado (placas de Petri con cultivos positivos, caldos con crecimiento, muestras patológicas, etc.). La
esterilización se realiza a 120°C por 15 min y es una esterilización húmeda.
Figura 2. Mechero de Bunsen. A) Nombres de sus partes; B) Tipos de llama.
1. cañón
2. base
3. anillo que regula entrada de aire
(virola)
4. entrada de gas (chiclé)
5. tubo de gas
6. llave de paso
Mechero Bunsen
A
B

Figura 3. Medios de cultivos sólidos
Figura 4. Autoclave. A) Vista exterior; B) Esquema de funcionamiento
A B

Figura 5. A) Horno Pasteur (Poupinel); B) Cámara de anaerobiosis
Figura 6. Microscopio Óptico Compuesto
A B

El microscopio óptico compuesto se conforma de los siguientes sistemas:
Sistema óptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo
Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta
Sistema de iluminación
Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación
Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador
Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico
Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo
Platina: Lugar donde se deposita la preparación
Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular
Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos
Tornillos de enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el
microscopio se guardó correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la
preparación es de bacterias.
4. Realizar el enfoque de acuerdo a los siguientes pasos:
- Acercar el lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando
directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación
pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
- Separar lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la
muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente mover el
micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible
volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso.
- El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de
percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de
inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

5. Observación con objetivo de inmersión:
- Bajar totalmente la platina
- Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a
visualizar y donde habrá que echar el aceite
- Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de 40x
- Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el círculo de luz
- Terminar de girar el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión
- Mirando el objetivo, subir la platina lentamente hasta que el lente toque la gota de aceite
- Enfocar cuidadosamente con el micrométrico
- Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento
girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con
el objetivo de inmersión en posición de observación
- Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también
que el objetivo 40x esté perfectamente limpio.

TRABAJO PRÁCTICO 1
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO Y MATERIALES DE TRABAJO
RESULTADOS ESPERADOS
• El estudiante conoce las normas de bioseguridad que son utilizadas en el trabajo microbiológico, según
parámetros de seguridad aplicados en la Universidad
• El estudiante conoce las características del trabajo y los materiales utilizados en el laboratorio de
microbiología
Actividades a desarrollar en la sesión práctica
• De forma expositiva se muestra al alumno las normas relacionadas al correcto desarrollo del Laboratorio
de Microbiología (funcionamiento y medidas de seguridad)
• Se muestra a los alumnos distintos materiales que serán utilizados en el desarrollo de las actividades
prácticas como ejemplo: Mechero, Placa de Petri, Asas microbiológicas, Pipetas Pasteur, microscopio,
porta y cubre objetos, estufa de cultivo, cámara de anaerobiosis (si hubiere), horno, autoclave, entre
otros.
• Se refuerza el manejo del microscopio óptico.
• Se refuerzan los conceptos de esterilidad y buen manejo del material de laboratorio.
Los estudiantes destaparán dos placas de agar sangre y las pondrán una, cerca del mechero durante toda
la hora de clases, mientras que la otra se dejará lejos del mechero, al finalizar la clase se tapan ambas
placas. Incubar a 35-37°C por 18-24 h.
• El profesor explica la importancia del rotulado del material e indica a los estudiantes la obligatoriedad de
presentarse con delantal blanco, ropa cerrada, marcadores (tipo Sharpie) y masking tape (cinta de papel
adhesiva).
• El profesor explica en detalle el funcionamiento del mechero, enseñando a sus estudiantes a encender y
apagar con seguridad el mismo y dando a conocer la capacidad calórica de cada uno de los sectores de la
llama
• El profesor explica a sus estudiantes como trabajar en esterilidad cerca del mechero, explica el manejo y
esterilización de asa de Drigalsky (etanol y llama) y asa microbiológica en punta y redonda (mechero).

ESTRUCTURA BACTERIANA.
OBSERVACION MACROSCOPICA DE COLONIAS BACTERIANAS
CARACTERIZACIÓN BACTERIANA
Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria es la observación directa
de su morfología macroscópica y microscópica. En microbiología, debido a que las bacterias no se pueden ver a
simple vista, no se pueden estudiar de forma individual, por lo que se trabaja con poblaciones bacterianas. Estas
poblaciones se obtienen después de cultivar la bacteria de interés en un medio que le proporcione todos los
nutrientes que requiere: materia orgánica, iones inorgánicos, factores de crecimiento y agua. Además, se debe
cuidar que la temperatura a la cual se va a cultivar sea la adecuada.
En medios sólidos las bacterias crecen formando agregados que se pueden observar macroscópicamente
sobre la superficie y que reciben el nombre de colonias. Se asume que cada colonia se origina de una sola bacteria
que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo sólido hasta formar una agrupación visible (colonia
bacteriana). Por lo tanto, una colonia está formada por millones de bacterias.
La bacteria original desde la cual desciende la colonia se conoce como unidad formadora de colonia (UFC).
Este concepto nos ayuda a estimar el número de bacterias presentes en una muestra de interés. Para esto, se
cultiva en un medio sólido una fracción conocida de la muestra. Posteriormente, se cuentan las colonias que se
desarrollaron. El resultado del recuento bacteriano se expresa como el número de unidades formadoras de
colonia en relación al volumen (mL) o a la masa (g) de la muestra cultivada. En teoría, equivale al número de
bacterias originalmente presenten en la muestra, al momento de realizar la siembra.
Las bacterias que crecen en medios líquidos tienen gran libertad de movimiento, y como carecen de una
superficie sólida, no dan origen a colonias. El desarrollo de una población bacteriana se evidencia mediante la
turbidez del caldo o la sedimentación del cultivo.
El análisis macroscópico se refiere a la observación detallada de la morfología de las colonias, en la cual
se puede identificar características como forma, elevación, margen, superficie, brillo, color, hemólisis (en agar
sangre). Estos atributos son propios del grupo bacteriano y son estables a través de las generaciones, por lo que
este análisis permite un acercamiento a la identificación de los géneros bacterianos.
i ii iii iv
Figura 11. Crecimiento bacteriano. A) Medio sólido; B) Medio líquido:
i) Formación de película en superficie, ii) Formación de sedimento en profundidad, iv) turbidez completa, v) sin crecimiento
A B
Colonia bacteriana

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE BACTERIAS. COLONIAS BACTERIANAS
La observación macroscópica de bacterias es un examen visual de las colonias, en el cual se puede
distinguir características tales como:
- Tamaño (grande, mediana, pequeña, puntiforme) El tamaño de las colonias bacterianas es, en condiciones de
cultivo favorables, bastante uniforme para cada especie o tipo. La visualización del tamaño se suele hacer a simple
vista, aunque a veces es preferible utilizar lupas o estereoscopios para poder discernir con mayor claridad las
características morfológicas a observar. El tamaño de las colonias bacterianas podemos expresarlo en las
siguientes categorías:
Pequeñas o puntiformes: 1 mm de diámetro o menor
Medianas: hasta 4 mm de diámetro
Grandes: mayores de 4 mm de diámetro
- Forma (circular, irregular) La morfología de una colonia viene dada por su borde y forma de elevarse sobre el
medio de cultivo
- Color (blanca, blanquecina, grisácea, dorada, tornasol) Es característico sólo de unas pocas especies bacterianas.
La pigmentación sólo se observa en colonias, y nunca en células individuales. En ocasiones, el pigmento difunde
al medio, dando a éste una tonalidad característica en algunas especies.
- Aspecto o superficie (húmedo, seca, mucosa) La superficie de la colonia, examinada mediante luz reflejada,
puede mostrar un aspecto liso y brillante a la luz o, por el contrario, una textura irregular, rugosa y mate, sin brillo
- Capacidad invasiva de las colonias sobre la placa (velo fino de desarrollo microbiano en la superficie del agar)
- Capacidad hemolítica. Algunas bacterias pueden ser capaces de hemolizar los hematíes de un medio nutritivo
sólido como el agar sangre. Esto es debido a la liberación de unas sustancias denominadas hemolisinas. La
hemólisis de los hematies adyacentes a la colonia puede ser intensa o ligera y se observa como un halo verdoso
más o menos claro alrededor de la colonia. La hemólisis intensa se denomina ßeta hemólisis; la hemólisis parcial
se conoce como alfa hemólisis y la ausencia de ésta se define como gamma hemólisis. Las hemólisis se observan
mirando el medio de cultivo a contraluz, sólo en medios que contienen sangre).
Figura 12. Características macroscópicas de colonias bacterianas

Figura 13. Aspecto de colonias bacterianas. A) Colonia mucosa/viscosa; B) Colonia de bacteria β hemolítica
Colonias invasivas
Colonias secas (opacas) Colonias húmedas (brillantes)
A B
A
B C D

Colonias coloreadas
Figura 14. Aspecto de colonias bacterianas. A) Colonias invasivas; B) Colonias secas (opacas); C) Colonias secas, detalle; D) Colonias húmedas
(brillantes); E) Colonias coloreadas
E

TRABAJO PRÁCTICO 2
ESTRUCTURA BACTERIANA. OBSERVACION MACROSCOPICA
DE COLONIAS BACTERIANAS
• El estudiante deberá ser capaz de distinguir características macroscópicas de colonias bacterianas.
1. Observación macroscópica:
En el laboratorio encontrará placas de Petri que contienen cultivos de diversas bacterias. A partir de ellas observe
características morfológicas de las colonias bacterianas de acuerdo a las instrucciones del profesor.
- Tamaño (grande, mediana, pequeña, puntiforme)
- Forma (circular, irregular)
- Color (blanca, blanquecina, grisácea, dorada, tornasol)
- Aspecto o superficie (húmedo, seca, mucosa)
- Capacidad invasiva
- Capacidad hemolítica (cultivos en agar sangre)
NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio

ESTRUCTURA BACTERIANA.
OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS
La observación microscópica de bacterias consiste en examinar a las bacterias como células independientes, con
ayuda del microscopio y de tinciones que revelan determinadas características, como forma, agrupación,
presencia o ausencia de cápsula, esporas, flagelos, movilidad, entre otras.
A. Observación de bacterias vivas
- Al fresco: Se utiliza para observar bacterias en estado vivo. Se dispone una gota de suspensión bacteriana
(realizada con caldo, agua o suero fisiológico estéril) en un portaobjetos, se coloca un cubreobjeto y se observa
al microscopio, bajo el objetivo con aumento 10x o 40x (sin inmersión), disminuyendo la iluminación y bajando
el condensador del microscopio. Se puede observar movilidad.
- En campo oscuro: Se emplea para la observación de bacterias muy pequeñas que difícilmente se observan con
el microscopio óptico en condiciones corrientes (ej. Treponema pallidum). Se utiliza un condensador especial que
envía la luz de la lámpara de tal manera que no entra directamente a la preparación. Los rayos luminosos son
refractados por los microorganismos observándose como cuerpos brillantes sobre un fondo oscuro.
Figura 15. Micrografía de Treponema pallidum en campo oscuro
B. Observación de bacterias (muertas)
La mayoría de las observaciones microscópicas se realizan con técnicas de coloración, esto implica que las
bacterias mueren. Al teñir las bacterias se pueden percibir con mayor facilidad la forma y el tamaño, utilizando el
mayor aumento del microscopio óptico (objetivo 100x, conocido como objetivo de inmersión porque se utiliza
aceite en la observación de la preparación).
Por otra parte, las tinciones ofrecen información adicional a la morfología de las bacterias, ya que ponen de
manifiesto características de la pared celular (Tinción de Gram) o la existencia de estructuras especiales, como
esporas bacterianas (Tinción con Verde Malaquita),cápsulas (Tinta china) u otras.
Para realizar una tinción bacteriana, se requiere preparar un frotis de la muestra.

Preparación de frotis bacteriano
Se denomina frotis a la extensión que se realiza de una muestra o un cultivo sobre un portaobjetos, para luego
teñirlos. La preparación de cualquier frotis implica tres etapas fundamentales:
- Extensión: suspender las bacterias a examinar en líquido (en caso de provenir de una colonia bacteriana) o
depositar una gota de caldo (en caso de provenir de un cultivo líquido) sobre el portaobjetos, para extender el
fluido sobre el vidrio con ayuda de un asa.
- Secado
- Fijación: El objetivo es adherir las bacterias a la superficie del vidrio. La fijación se puede realizar por medios
físicos o químicos
i) Medios físicos: consiste en exponer el extendido al calor (la forma más usada).
ii) Medios químicos: consiste en colocar el extendido en contacto con una sustancia química, como alcohol
metílico, éter u otro.
Para la realización de un frotis se procede del siguiente modo:
a) Prenda el mechero (recuerde trabajar en la zona estéril, calentando el asa al rojo entre un uso y otro). Asegúrese
que el portaobjetos está completamente limpio
b) Coloque una gota de agua o suero fisiológico en el centro de la lámina (sólo si la muestra o cultivo es sólido)
c) Transfiera con un asa estéril una, dos o tres colonias (depende del tamaño) y mézclelas con el agua formando
una suspensión apenas opalescente. Deje secar al aire
d) Fije el frotis exponiéndolo brevemente a la llama del mechero hasta que esté completamente seco. Evite que
se recaliente, pues se alterará la morfología bacteriana (y corre el riesgo de quebrar la lámina de vidrio).
Compruebe el calor del portaobjetos sobre el dorso de su mano.
Una vez extendida y fijada la preparación se deja actuar sobre ella los colorantes de uso microbiológico.
Tinciones de uso microbiológico
La tinción de los microorganismos consiste en dejar actuar una solución colorante sobre la preparación ya fijada.
Estas soluciones varían de acuerdo al método de tinción que se emplea.
Tinciones simples: Se basan en el uso de un colorante sobre el frotis bacteriano, por lo que todas las células se
observan de un mismo color. Este tipo de tinción sirve exclusivamente para observar forma y agrupación de las
bacterias.
Procedimiento
1. Realice un frotis de la muestra. Asegúrese de fijarlo correctamente.
2. Ubique el portaobjetos en la zona de tinción. Vierta sobre la muestra el colorante escogido, déjelo actuar por
1ó 2 minutos.
3. Lave suavemente el frotis con agua.
4. Seque el portaobjeto inclinándolo sobre papel absorbente para que escurra el agua. Luego puede pasarlo
rápidamente por la llama del mechero para que quede completamente seco.
5. Observar al microscopio, con objetivo de inmersión.

Figura 16: Esquema del procedimiento para realizar una tinción
Tinciones diferenciales: Estas tinciones utilizan más de un colorante, de manera que las bacterias de una muestra
se tiñen de colores distintos de acuerdo a su afinidad por los distintos colorantes. Se ha establecido que la afinidad
tintorial de un grupo bacteriano se correlaciona con una propiedad del grupo, como la estructura a nivel de la
pared bacteriana, por ejemplo. De este modo, bacterias que quedan teñidas de un mismo color pertenecen al
mismo grupo bacteriano también. Entre estas tinciones, las más relevantes son la tinción de Gram y la tinción de
Ziehl - Neelsen.
A. Tinción de Gram (Christian Gram, 1884)
Esta tinción es probablemente la más importante en bacteriología. Permite distinguir, al menos, dos grupos de
bacterias basados en la afinidad por el colorante Cristal Violeta (Gram Positivas, de color azul púrpura) o por el
colorante Safranina (Gram Negativas, de color rojo). Esta diferencia en la afinidad tintorial se relaciona con la
ultraestructura de la pared bacteriana. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicán y
carecen de membrana externa, mientras que las Gram negativas tienen una capa más delgada de peptidoglicán y
poseen una membrana externa.
Existe también un tercer grupo de bacterias denominadas Gram variables, pues simultáneamente presentan
tinción de Gram positiva y tinción de Gram negativa, aún bajo condiciones óptimas de cultivo. Estas bacterias
poseen una pared con estructura de Gram positiva, aunque la capa de peptidoglicán es más delgada que en la
mayoría de las bacterias Gram positivas.
Procedimiento
1. Prepare un frotis.
2. Cubra toda la muestra con Cristal Violeta o Violeta de Genciana al 1%, deje actuar durante 1 minuto.
3. Elimine el exceso de colorante y lave con agua rápida pero cuidadosamente, manteniendo la lámina inclinada.
4. Cubra la preparación con la solución de lugol, deje actuar durante 1 minuto
5. Lave con agua.
6. Decolore con alcohol etílico o alcohol-acetona durante 30 segundos
7. Lave con agua.
8. Cubra el portaobjetos con safranina, deje actuar por 30 segundos
9. Lave con agua.
10. Seque la lámina en forma inclinada sobre papel absorbente. Cuando esté completamente seca, puede
observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Principios de la Tinción de Gram
a. Tinción inicial. Las células se tiñen con Cristal Violeta o Violeta de Genciana, el cual es el colorante primario
(químicamente es una tinción básica). En este paso todas las células se tiñen de morado o azul púrpura.
b. Mordiente. Se adiciona solución de yodo (lugol), que reacciona con el cristal violeta forma un complejo
insoluble en agua. Todas las células continúan de color morado.
c. Decoloración. Se adiciona un solvente orgánico (no polar), el cual actúa lavando el complejo de cristal violeta-
yoduro de las células Gram negativas. De esta manera las bacterias Gram positivas continúan teñidas de morado
y las Gram negativas quedan incoloras. Este es el paso crítico del procedimiento, pues si se exagera decolora las
bacterias Gram positivas y si se hace por muy breve tiempo (o muy débilmente) no decolora a las bacterias Gram
negativas.
d. Tinción de contraste. Estos colorantes reemplazan al colorante primario que ha sido removido de las bacterias
Gram negativas, se utiliza Safranina o Fucsina (esta tinción debe tener una naturaleza química distinta al Cristal
Violeta), para obtener un contraste rojo o rosado. Las bacterias Gram positivas son resistentes a este lavado
(complejo insoluble a agua).
La retención o pérdida del colorante en una bacteria ocurre por el lugar de la ultraestructura en el cual se forma
el complejo cristal violeta-yoduro. Bacterias que carecen de membrana externa pero poseen un grueso
peptidoglicán retienen el colorante primario, mientras las bacterias que presentan membrana externa y una capa
de peptidoglicán más delgada pierden el colorante primario y se tiñen con la tinción de contraste.
Figura 17. Tinción de Gram. a) Etapas de la tinción; b) Micrografía de muestra con bacterias Gram positivas y Gram negativas

B. Tinción de Ziehl - Neelsen
Esta tinción se emplea para colorear aquellas bacterias que son difíciles de teñir con colorantes básicos (como los
utilizados en la tinción de Gram), porque se muestran impermeables a la coloración. Solamente utilizando
colorantes enérgicos, como la fucsina fenicada, cuya acción se fuerza con el uso de calor o con un prolongado
tiempo de contacto, estas bacterias logran retener el colorante. Y lo hacen de tal manera, que los decolorantes
fuertes como el alcohol y los ácidos no consiguen decolorarlas. Por eso reciben el nombre de bacterias alcohol-
ácido resistente (BAAR).
Esta tinción es empleada para bacterias que poseen una membrana con alto contenido lipídico, característica por
la cual son difíciles de teñir. Las bacterias del género Mycobacterium son BAAR por excelencia, pues el contenido
lipídico de las micobacterias, compuesto por fosfolípidos y ceras principalmente, alcanza hasta un 40% de su peso
seco total. La colorante base de la tinción de Ziehl-Neelsen es la fucsina fenicada, como decolorante se utiliza
ácido clorhídrico al 3% en alcohol etílico, o ácido sulfúrico al 1/4 o ácido nítrico al 1/3; el colorante de contraste
suele ser azul de metileno, pero también se puede usar amarillo victoria o verde malaquita.
Procedimiento
1. Realizar un frotis con material biológico del paciente, obtenido de zonas que contienen bacterias, como
expectoración u orina. La muestra de expectoración se extiende sobre el portaobjetos de manera homogénea (se
puede utilizar otro portaobjetos para extenderla) cubriendo las 2/3 partes de la lámina, para luego fijar con calor.
La muestra de orina debe sedimentar, el sedimento se centrifuga a 1.500 r.p.m. durante 5 minutos. El frotis se
realiza utilizando el pellet; y se debe fijar en la estufa. Esta misma operación se realiza con otros líquidos
corporales, como L.C.R. o líquido pleural.
2. Luego de realizado el frotis, se cubre la lámina con fucsina fenicada (previamente filtrada) y se calienta hasta
que emita vapores blanquecinos visibles. Repetir este proceso dos veces más, evitando que el colorante se seque
sobre la lámina. Contabilizar un tiempo total de actuación del colorante de 8 a 10 minutos.
Cuando aparecen vapores se ha logrado el calentamiento aproximado de 90°C con lo que se obtiene una cubierta
cérea más blanda que se deja impregnar por el colorante.
3. Eliminar la fucsina inclinando el portaobjetos hacia adelante, lavar el frotis con un chorro de agua suave sobre
la parte del portaobjetos que no contiene extendido y dejar escurrir el agua sobre la película coloreada de modo
que ésta no se desprenda.
4. Cubrir la totalidad de la lámina con alcohol-ácido de manera que vaya decolorando y arrastrando suavemente
la fucsina hasta que las partes más gruesas del extendido conserven sólo un ligero tinte rosado. Eliminar el alcohol-
ácido y lavar con agua.
5. Cubrir la lámina con azul de metileno durante 1 minuto.
6. Eliminar el azul de metileno y lavar con agua a baja presión por ambos lados.
7. Secar a temperatura ambiente.
También puede realizarse la técnica en frío, sin necesidad de calentamiento, dejando actuar el colorante durante
30 minutos.
Las bacterias alcohol-ácido resistentes son aquellas que no pierden la coloración inicial con fucsina por acción del
alcohol-ácido y se observarán de color rojo, mientras el resto de la preparación se observará de color azul.

Figura 18: Frotis con tinción de Ziehl-Neelsen
Tinciones especiales: El objetivo de estas tinciones es destacar algunos constituyentes de la bacteria, como
flagelos, cápsulas, esporas o gránulos intracitoplasmáticos. Los procedimientos de estas tinciones son complejos,
pero permiten precisar detalles de la estructura bacteriana. En general, son útiles en trabajos de investigación
bacteriológica, con escasa utilidad en el laboratorio clínico.
Figura 19. Micrografía de bacterias con flagelos teñidos

A. Tinción para cápsula
Se trata de una tinción negativa que permite determinar la presencia de cápsulas polisacáridas, usando tinta china.
Figura 20: Esquema del procedimiento de la tinción de cápsula
Procedimiento
a) Coloque una gota moderada de tinta china sobre una lámina y emulsione sobre ella la bacteria en estudio.
b) Extienda la suspensión de manera que el frotis resulte delgado.
c) Deje secar y fije.
d) Cubra con fucsina o safranina.
e) Lave, seque y observe con objetivo de inmersión.
Figura 21: Cápsulas bacterianas con tinción negativa

B. Tinción de Esporas
Algunos géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia a
condiciones ambientales adversas, como sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas bacterianas se
caracterizan por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora
se debe a la estructura proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también las hace
resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.
Figura 22: Tinción de esporas. A) Esquema del procedimiento; B) Esporas teñidas con verde malaquita
B
A

Morfología Celular
A pesar de su pequeño tamaño las bacterias, pueden presentar una variada morfología. Sin embargo, la gran
mayoría de ellas se pueden caracterizar en las siguientes formas básicas:
i) Cocáceas, células bacterianas de forma esférica o aproximadamente esféricas
ii) Bacilares, células en las cuales uno de sus ejes es mucho mayor que el otro, adoptando la apariencia de
un bastón o cilindro
iii) Espiraladas, células largas que presentan una torsión alrededor de un eje central
iv) Curvas, células retorcidas pero que no alcanzan una torsión completa
Figura 23. Morfología celular de las bacterias
Bacterias cocáceas
Bacterias bacilares
Bacterias espirales
Bacterias de formas
no tradicionales
Bacterias espiroquetas
Bacterias filamentosas

Al dividirse las bacterias, las células hijas pueden quedar unidas o próximas unas a otras dando lugar a
agrupaciones típicas que ayudan a completar su estudio microscópico.
Agrupación de las células bacterianas
Las bacterias presentan diversos modelos de agrupación de acuerdo a los diferentes planos en los que puede
ocurrir la división celular, si las células hijas permanecen junto a la célula madre una vez realizada la división
celular. Cada una de estas disposiciones es típica para un grupo particular, por lo que esta característica puede
usarse en identificación.
Se pueden distinguir las siguientes agrupaciones:
Pares: Las células se presentan mayoritariamente en parejas posterior a una división en un plano. Si la forma
bacteriana es cocácea se habla de diplococos (Ej. Neisseria spp.), si la forma de la célula es bacilar se habla
de diplobacilos.
Tétradas: Resultan de la división de diplococos en el plano perpendicular al primer plano de división. Son 4
células unidas entre sí (Ej. Micrococcus spp.)
Cubos o sarcina: Se producen cuando una tétrada se divide en un tercer plano formando un paquete cúbico
de ocho células que asemejan un cubo. Esta agrupación es característica del género Sarcina (cocácea).
Racimos: En este caso la división celular se produce en tres planos, de forma irregular, dando origen a masas
de células que en la observación microscópica se asemejan a racimos. Esta agrupación es característica del
género Staphylococcus.
Cadenas: Las células se ubican en línea formando cadenas de longitud variable. Esta agrupación se presenta
porque la división celular ocurre en un solo plano y las células no se separan después de la división. La
agrupación en cadena es característica de los géneros Streptococcus (forma cocácea), Bacillus y Lactobacillus
(formas bacilares).
Empalizada: Agrupación que se encuentra sólo en bacterias en forma de bacilo. Las células se disponen una al
lado de la otra dando la impresión de una empalizada. Ej. Corynebacterium spp.
Letra china: también se presenta sólo en bacilos. Las células se disponen formando diferentes ángulos que
dan la idea de letras chinas Ej. Corynebacterium spp.
La agrupación de las células es una propiedad constante en las bacterias, por esta razón, facilita la identificación
bacteriana en el laboratorio.

Sin agrupación (aislada)
Agrupación: en pares
Agrupación: en cadenas
Agrupación: empalizada y letra china
Figura 24. Agrupación de bacterias bacilares

Sin agrupación (aislada)
Agrupación: en pares
Agrupación: en cadenas
Agrupación: en tétradas
Agrupación: sarcina
Agrupación: racimo
Figura 25. Agrupación de bacterias cocáceas

TRABAJO PRÁCTICO 3
ESTRUCTURA BACTERIANA. OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS
• El alumno será capaz de describir morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana en preparaciones
microscópicas de acuerdo a tinciones habituales de laboratorio.
1. Tinción de Gram
- En el laboratorio encontrará diversas placas con cultivos bacterianos, a partir de ellas seleccione una bacteria
Gram positivo y una Gram negativo y realice la tinción de Gram correspondiente.
- También podrá encontrar preparaciones de bacterias (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus
sp., Bacillus subtilis, Enterococcus sp. y Micrococcus sp.) teñidas con tinción de Gram listas para ser observadas
al microscopio
- Las bacterias deben ser visualizadas (aumento 100x con aceite de inmersión) y documentadas correctamente
indicando forma celular, agrupación y afinidad tintorial (Gram positivo o Gram negativo)
2. Tinción de Cápsula
- Realice una tinción de cápsula (tinción negativa) de Klebsiella pneumoniae y/o Staphylococcus saprophyticus
• Agregar con micropipeta una gota (50 µl) de tinta china en la orilla de un porta objeto
• Agregar 50 µl de K. pneumoniae o S. saprophyticus sobre la gota anterior
• Esparcir con el cubre objeto en forma de frotis
• Fijar al mechero
• Agregar colorante de contraste fucsina o safranina durante 2 min
• Lavar suavemente con agua y secar con papel absorbente
• Observe con aumento de 40x y 100x con aceite de inmersión
3. Revisión de resultados y preparación del reporte
NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio, incluyendo limpieza y orden del
microscopio.

CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
CRECIMIENTO BACTERIANO
Los microorganismos en general pueden vivir y multiplicarse sobre substratos nutritivos preparados en el
laboratorio, que son denominados medios de cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores
de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio de forma estéril. Estos suministran los
compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos, como agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno,
calcio, fósforo y hierro.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras, en cambio,
necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios diseñados por el
ser humano. Los microorganismos que requieren factores de crecimiento específicos, como aminoácidos,
vitaminas, purinas y otras sustancias que no son capaces de sintetizar, reciben el nombre de microorganismos
exigentes.
Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos y según el
objetivo del estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:
- Contener las sustancias necesarias para el crecimiento del (os) microorganismo (s)
- Mantener condiciones de esterilidad hasta el momento de la siembra
Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías: requerimientos
físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica; entre los
requerimientos químicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el
oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento.
Finalmente, una vez sembradas las bacterias en el medio de cultivo, deben ser incubadas a la temperatura
y tensión de oxígeno adecuadas.
CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos (tales como aminoácidos,
carbohidratos, polialcoholes, vitaminas, minerales)
2. Tener un pH que permita un desarrollo óptimo
3. Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas
4. Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé, tapones de goma, tapas
metálicas o roscas.
UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. Aislamiento de bacterias desde una muestra o material biológico corporal (secreción purulenta, orina, órgano,
fecas u otros) o de un alimento (leche, carne, entre otros).
2. Estudio morfológico de las colonias.
3. Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o cepario)
4. Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas en medios diferenciales.
5. Obtención de toxinas o investigación de sus características.
6. Cultivo y recolección de bacterias para la elaboración de productos biológicos (vacunas, antígenos,
bacteriocinas, toxoides, entre otros)
7. Estudio de susceptibilidad antibiótica

Clasificación de los medios de cultivo
Según su utilidad práctica
Medios corrientes: Son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantención de la mayoría de las bacterias.
Sirven de base para la preparación de los medios especiales.
- Ejemplos: Caldo nutriente, Agua peptonada, Agar nutritivo.
Medios especiales: Son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva sirven para el cultivo de bacterias
muy exigentes. En su formulación, pueden contener sustancias inhibidoras de ciertas bacterias, facilitando el
aislamiento y diagnóstico de los agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas. También pertenecen a esta
clasificación aquellos medios que facilitan el diagnóstico porque manifiestan características bioquímicas de
algunas especies microbianas; esto lo logran por la adición desustancias químicas determinadas.
Los medios especiales se clasifican en:
Medios Mejorados: Se obtienen añadiendo a los medios de cultivo corrientes sustancias de mayor valor nutritivo,
como sangre desfibrinada (conejo, cordero o caballo), suero sanguíneo (equino), suero fetal bovino, huevo,
cerebro, corazón, trozos o extracto de hígado, carne o levadura, entre otros. Estas sustancias tienen el efecto de
proporcionar condiciones favorables para el cultivo de bacterias exigentes, como Streptococcus spp. o
Corynebacterium spp. Como la mayoría de estas sustancias son de naturaleza proteica no pueden ser esterilizadas
por autoclave, pues coagulan con el calor. Cuando esto ocurre, las sustancias deben ser esterilizadas por filtración
y se deben agregar a los medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa asepsia.
- Ejemplos de medios mejorados: Agar Sangre, Agar Cerebro Corazón, caldo de Tetrationato, caldo Selenito
(empleado en el aislamiento de Salmonella spp. desde muestras provenientes de excrementos, orina o aguas
residuales).
Medios Selectivos: Los medios selectivos estimulan el desarrollo de ciertas especies bacterianas mientras inhiben
el desarrollo de otras especies; esto permite el aislamiento y diagnóstico de bacterias patógenas con facilidad y
rapidez, especialmente cuando el causante del cuadro infeccioso se encuentra en zonas corporales donde ya
existen bacterias de forma natural. Por ejemplo, es frecuente que en fecas, orina, exudados, alimentos o agua
haya presencia de bacterias sin interés diagnóstico (que no causan enfermedad), pero que crecerán en los medios
de cultivo corrientes enmascarando la presencia del agente patógeno buscado.
Estas características se obtienen por la adición de sustancias tales como colorantes de anilinas, sales biliares,
antibióticos, entre otros.
- Ejemplos de medios selectivos: Agar Brucella, Agar McConkey, Caldo Selenito Cistina.
Medios indicadores o diferenciales: Son medios comunes o mejorados a los cuales se le ha adiciona ciertas
sustancias que ponen de manifiesto determinadas propiedades bioquímicas, propias de algunas especies
bacterianas, como por ejemplo: producción de H2S gas, de ácidos o de sustancias alcalinas, acción proteolítica,
acción lipolítica, entre otras. Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rápidamente una especie
microbiana de otra semejante; por este motivo se denominan medios indicadores o diferenciales.
- Ejemplos de medios diferenciales: Agar TSI, Agar LIA, Agar Baird Parker, Agar Rambach.

Los medios de cultivo se pueden encontrar en tres estados físicos:
1. Medios Líquidos: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de células estresadas y/o
para el enriquecimiento de bacterias presente en una muestra.
2. Medios Sólidos: se utilizan para obtener colonias aisladas sobre la superficie del medio de cultivo, para el
estudio de la morfología de las colonias, lo que no permiten los medios líquidos. Se diferencian de los anteriores
porque tienen una matriz de sostén, que puede ser agar-agar o gelatina.
3. Medios Semisólidos: se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje de agar
que un medio sólido, por lo que no solidifican totalmente a temperatura ambiente.
Los medios sólidos tienen generalmente agar–agar como agente solidificante, espesante o gelificante. El
agar-agar es una sustancia hidrofílica de carácter coloidal procedente de diversas especies de algas marinas,
especialmente del tipo “Gelidium”, que tiene la propiedad de formar un gel. Químicamente el agar-agar es un
polisacárido de cadena larga. El agar-agar se expende en forma granulada o en polvo, es insoluble en agua fría, se
disuelve solamente a temperatura de ebullición, se mantiene en forma viscosa a 60 – 80°C y solidifica en forma
de un gel estable a 40 - 45°C. Resiste perfectamente la esterilización a 121°C y por su capacidad de retener agua
no se deshidrata fácilmente, lo que permite almacenar los medios por un período de tiempo a 5°C.
La gelatina es atacada y descompuesta por muchos tipos de bacterias; sin embrago, se añade a los medios
de cultivo para estudiar si las bacterias son capaces de atacarla (presencia de enzimas gelatinasas) o cuando las
bacterias degradan el agar-agar (enzimas agarasas).
TÉCNICAS BÁSICAS DE SIEMBRA MICROBIANA
TECNICAS BASICAS DE CULTIVO BACTERIANO
Para un correcto desarrollo de las actividades en microbiología es necesario conocer y practicar las
técnicas básicas de manejo y cultivo de microorganismos. Estas técnicas no han variado mucho desde el estudio
sistemático del mundo microbiano, ya hace más de dos siglos, pero aun representan una manera segura y fiable
para el estudio microbiológico.
Un concepto clave en las técnicas microbiológicas es la ESTERILIDAD, la cual debe estar presente en todo
momento, especialmente en el manejo del material de trabajo. A continuación se especifican las nociones básicas
en el manejo estéril del material microbiológico de importancia y las técnicas de sembrado microbiológico:
A. Esterilización de asas y pipetas
Cada vez que se desee utilizar asas de platino o pipetas capilares deben esterilizarse a la llama del
mechero. Para esterilizar el asa, se coloca el alambre en posición semivertical sobre la llama hasta que se ponga
color rojo vivo, inmediatamente se completa la esterilización flameando la parte metálica del mango.
La esterilización de asas y pipetas capilares se realiza antes y después de haberlas usado con bacterias.
Para tomar bacterias es preciso esterilizar previamente el asa y esperar hasta que esté totalmente fría. El asa se
enfría tocando las paredes de vidrio del tubo, la tapa de la placa de Petri, o bien la zona del medio en que no haya
bacterias. Luego se procede a tomar la muestra.

En el caso de las pipetas, la de tipo capilar debe ser rota en el extremo, si se encuentra sellada, para luego
deslizarla sobre la llama girándola suavemente en una extensión muy superior a la que se introducirá en el tubo,
luego se enfría del mismo modo que el asa de platino.
Las pipetas aforadas pueden estar en cilindros metálicos o envueltas en papel ya estériles. En el primer
caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras,
en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta desde el extremo donde queda parte del papel suelto, de manera
de no tocar su extremo inferior (que estará en contacto con la muestra).
Figura 7. Forma correcta de esterilizar el asa microbiológica
Figura 8. Espacio de trabajo microbiológico
EL ESPACIO DE TRABAJO MICROBIOLOGICO SIEMPRE DEBE ESTAR ORDENADO Y CON LOS
MATERIALES DISPUESTOS PARA EL TRABAJO INDIVIDUAL
B. Flameo de tubos de ensayo.
Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente
antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos al interior del tubo,
a través del aire.

Figura 9. Forma de esterilizar un tubo de ensayo
C. Aislamiento de Bacterias:
Cuando se realiza una siembra en medios sólidos es deseable obtener las bacterias en forma de colonias
aisladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una microbiota mixta, que se manifiesta por el desarrollo
de distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (microbiota normal) o contaminantes del proceso de
muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.
Para realizar diagnóstico microbiológico, el organismo debe ser primero aislado y mantenido puro en condiciones
de laboratorio.
Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de una colonia
a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos con fines diagnósticos. En el caso de los medios líquidos,
una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un aislamiento de 1 gota o 1 asada del cultivo a un
medio sólido para obtener colonias aisladas y asegurarnos de su pureza (todas con características macroscópicas
iguales). Si fuese necesario, las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros,
es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfología y microscópicamente correspondan
a un solo tipo de bacteria. Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana
mediante el traspaso de una colonia a una batería de medios diferenciales.
Aislar una cepa bacteriana significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza, condición indispensable
para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas y lograr así su identificación correcta.
Técnicas de Aislamiento
De medio sólido, de mezcla bacteriana o de muestra patológica a Placa de Petri.
1. Estrías en zig-zag: Se toma el asa con la muestra y se procede a hacer una estría en zig-zag desde un extremo
a otro de la placa. Sin esterilizar el asa se puede repetir la misma operación en una segunda o tercera placa para
llegar a obtener colonias aisladas. Es preciso actuar con rapidez para evitar la contaminación con microorganismos
presentes en el aire. Esta técnica es poco recomendable para personas que poseen poca práctica en laboratorio
microbiológico. (Figura 10. A).
2. Estrías con movimientos de lateralidad (Técnica de siembra por agotamiento): Se toma la placa con la mano
izquierda y se distribuye la siembra en una pequeña área junto a su borde. Se esteriliza el asa, se enfría y se
arrastra un poco de la bacteria ya sembrada hasta otra zona de la placa, deslizando el asa con movimiento en zig-
zag, evitando tocar nuevamente la siembra original. Se continúan los movimientos hasta ocupar toda la superficie
de la placa. (Figura 10. B).

Figura 10. Formas correctas de sembrar un cultivo sobre agar. A) En zigzag; B) por agotamiento
A B

TRABAJO PRÁCTICO 4
CRECIMIENTO BACTERIANO Y CONDICIONES DE CULTIVO
• El estudiante será capaz de relacionar distintos factores abióticos (nutrientes, condiciones de cultivo) con las
características del crecimiento bacteriano.
Crecimiento bacteriano y nutrientes
a) Necesidad de nutriente para crecimiento: A partir de cultivos saturados de Streptococcus pyogenes sembrar,
utilizando un asa curva y técnica por agotamiento, una placa de agar Tripticasa de Soya y una placa de Agar
Tripticasa/Sangre.
Incubar cada medio de cultivo sembrado en estufa a 35-37° C por 24 horas en atmósfera normal
b) Utilización de glucosa (fermentación) para el crecimiento: A partir de cultivos saturados de Escherichia coli y
Pseudomonas sp. sembrar, utilizando asa curva un tubo con caldo mineral con glucosa al 1%, agregar una capa
de aceite mineral (vaselina) e incubar en estufa a 35-37°C por 24 horas en atmósfera normal
Crecimiento bacteriano y factores ambientales
c) Presión osmótica: A partir de cultivos saturados de Staphylococcus aureus y Escherichia coli sembrar,
utilizando asa curva, los siguientes tubos:
-caldo tripticasa de soya
-caldo tripticasa de soya más NaCl 2%
-caldo tripticasa de soya más NaCl 10%
d) pH: A partir de cultivos saturados de Enterococcus sp. y Escherichia coli sembrar, utilizando asa curva, los
siguientes tubos:
-caldo nutritivo, pH 2
e) Registre en su cuaderno los procedimientos realizados y los resultados obtenidos.
NO OLVIDAR: Todas las muestras deben ser correctamente rotuladas y dispuestas en la incubadora respectiva,
su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio.

TRABAJO PRÁCTICO 5
CRECIMIENTO BACTERIANO Y CONDICIONES DE CULTIVO. PARTE II
• El estudiante será capaz de relacionar distintos factores abióticos (nutrientes, condiciones de cultivo) con las
características del crecimiento bacteriano
2. Revisión de resultados: los estudiantes deben documentar los resultados obtenidos relacionando estos con
las propiedades bacterianas en cada caso
3. Comentar, discutir sus resultados y confeccionar el reporte
NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio.

UNIDAD DE APRENDIZAJE II
VARIACIÓN GENÉTICA: SUS CONSECUENCIAS
• Evidencia una modificación genética en una cepa bacteriana de acuerdo al mecanismo genético
involucrado
Sesión 7.
Trabajo práctico 6. Transformación: realización de la transformación
Sesión 8.
Trabajo práctico 7. Observación y análisis de los resultados de transformación bacteriana
Sesión 9.
Trabajo práctico 8. Conjugación: Preparación de medios, realización de procedimiento de conjugación
Sesión 10.
Trabajo práctico 9. Observación y análisis de los resultados de conjugación
Sesión 11.
Trabajo práctico 10. Transducción: Preparación de medios, adsorción de fagos realización del procedimiento
Sesión 12.
Trabajo práctico 11. Observación y análisis de los resultados e transducción

Genética Bacteriana
La genética bacteriana presenta una serie de particularidades con respecto las conocidas en células
eucariontes. Además de las diferencias a nivel de estructuras y conformación del material genético, la forma en
que las bacterias modifican su información genética en respuestas a cambios ambientales es algo muy interesante.
Junto a la regulación genética en la expresión genética, las bacterias pueden poseen mecanismos activos que
alteran la información genética (Mutación) y capturan material genético desde individuos no relacionados
(Transferencia Horizontal de Genes). Estos mecanismos son responsables, en parte, de la adaptación que las
especies bacterianas presentan a las diversas condiciones ambientales. Estos cambios pueden ser tan variados
como: aumento de niveles de radiación ambiental, adaptación a nuevas fuentes nutricionales, respuesta a
metabolitos potencialmente tóxicos, como péptidos y antibióticos, entre otros.
La resistencia a los antibióticos, la distribución entre la población bacteriana de factores de virulencia y nuevas
capacidades metabólicas son consecuencias directa de los fenómenos genéticos que ocurren en bacterias, las
cuales son factores importantes a considerar al estudiar la evolución de las bacterias, especialmente en la parte
epidemiológica que últimamente ha sido fundamental en el diseño de estrategias de predicción y contención de
agentes infecciosos.
La capacidad de incorporar material genético desde individuos no emparentados (transferencia horizontal de
genes) tiene 3 mecanismos que han sido descritos:
1) TRANSFORMACION: Este mecanismo involucra la incorporación a la bacteria de DNA desnudo. Este tipo de
trasferencia puede capturar DNA desde cualquier fuente externa
2) TRANSDUCCION: Este tipo de transferencia está basada en la infección de fagos. Los fagos son un tipo de
virus que infecta de manera relativamente específica, en algunos casos con preferencia entre cepas bacterianas,
la transferencia es un poco más restringida, pero es posible transferir una cantidad más grande de información
3) CONJUGACION: Es un mecanismo de transferencia genética que se genera mediante una estructura llamada
PILI, el cual sirve de puente para la transferencia de material genético. Para que se realice este tipo de
transferencia es necesaria la presencia, en una de las bacterias, de un factor conjugante, que puede estar en
estructuras extracromosomales o al interior del cromosoma. Este tipo de transferencia depende de señales
presentes tanto en el DNA como en la bacteria

TRABAJO PRACTICO 6
Transformación Bacteriana
Resultados esperados:
• El estudiante desarrolla la técnica de transformación bacteriana en condiciones de laboratorio
• El estudiante comprende las bases del fenómeno que se realiza
A. Transformación bacteriana: Para la realización de esta actividad se requiere de la cepa de Escherichia coli
HB101 la cual viene incorporada en el kit de transformación y que ha sido crecida en una placa de agar LB
• Con un asa microbiológica se agrega una cantidad de bacteria HB Escherichia coli HB101 a una solución
de transformación
• A este preparado se le introduce con otra asa una disolución de plásmido GFP en una relación de
concentración de 10 ng/µl
• Incubamos durante 10 min en hielo.
• Luego ponemos durante 50 seg la muestra en un baño a 42 °C
• Volvemos a dejar en hielo durante un minuto.
• Añadimos 250 µl de LB a los tubos
• Y colocamos las células a crecer (10 min a temperatura ambiente)
• Sembramos 100 µl en una placa de cultivo de LB-agar CON EL ANTIBIOTICO DE SELECCIÓN ADECUADO
usando un asa de vidrio (a la forma de rastrillo) para extender
• Llevamos el cultivo a una estufa a 37° C y lo dejamos incubar durante 24 h
Una vez crecidas las bacterias, se realiza recuento y como control se siembra en una placa con antibióticos las
bacterias sometidas al mismo procedimiento pero sin el plásmido.

TRABAJO PRACTICO 7
Transformación Bacteriana. Resultados
• El estudiante observa e interpreta los resultados obtenidos en la actividad de transformación
• El estudiante calcula la eficiencia de transformación
• De acuerdo a las indicaciones del profesor debe colocar las placas con las bacterias transformantes
en contacto con la luz UV y observar lo que ocurre
• Contar las colonias resultantes y calcular la eficiencia de transformación

TRABAJO PRACTICO 8
Conjugación Bacteriana
• El estudiante desarrolla la técnica de Conjugación bacteriana en condiciones de laboratorio
A. CONJUGACIÓN
1. Crecer inóculos frescos de la bacteria dadora (EC100D R995, KanR
) y receptora (S. Typhimurium LT2, CamR
)
2. Colocar una pequeña gota de las bacterias (dadora y receptora) en una relación 10:1 sobre una placa de
agar Luria, dejar secar.
3. Incubar durante la noche a 37ºC.
4. Realizar un arrastre de las colonias bacterianas y resuspender en 1 ml de NaCl 0,85% estéril.
5. Realizar diluciones seriadas a partir de la suspensión bacteriana y sembrar
Calcular de frecuencia de conjugación mediante el recuento de colonias resistentes a kanamicina
su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio

TRABAJO PRACTICO 9
Conjugación Bacteriana. Resultados
• El estudiante observa e interpreta el resultado de la Conjugación
• El estudiante calcula la eficiencia de la conjugación
• Contar las colonias resultantes en las distintas placas y calcular la eficiencia de Conjugación

TRABAJO PRACTICO 10
Transducción Bacteriana
• El estudiante desarrolla la técnica de Transducción bacteriana en condiciones de laboratorio
A. TRANSDUCCIÓN
Para esta actividad práctica utilizaremos el Fago P22
1. Cultivar la cepa sensible por 16 horas en 2 ml de LB.
2. Mezclar las bacterias y el fago en tubos eppendorf según el siguiente esquema:
Placa µl 14028s µl lisado P22
1 100 -
2 - 100
3 100 100
3. Incubar los tubos a 37ºC por 20 min para permitir la adsorción de los fagos
4. Agregar 200 µl de Caldo Luria a los tubos e incubar por 20 min a 37°C para permitir la expresión fenotípica de
la resistencia a kanamicina
5. Sembrar 200 µl de cada tubo en placas de Agar Luria/Kanamicina con un rastrillo flameado en alcohol. Dejar
secar
6. Incubar las placas a 37ºC durante toda la noche
7. Realizar recuento de las colonias en cada placa. No debe haber colonias en las placas controles (1 y 2)
su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio

TRABAJO PRACTICO 11
Transducción Bacteriana. Resultados
• El estudiante observa e interpreta el resultado de la Transducción
• El estudiante calcula la eficiencia de la Transducción
• Contar las colonias resultantes en las distintas placas y calcular la eficiencia de Transducción

UNIDAD DE APRENDIZAJE III
CONTROL DE MICROORGANISMOS
• Demuestra el efecto de los métodos de control físicos, químicos y antibióticos sobre el crecimiento
bacteriano
Sesión 13
Trabajo práctico 12. Control de microorganismos. Agentes físicos de control
Sesión 14
Trabajo práctico 13. Control de microorganismos. Agentes físicos de control. Análisis de resultados
Sesión 15
Trabajo práctico 14. Control de microorganismos. Agentes químicos de control
Sesión 16
Trabajo práctico 15 Control de microorganismos. Agentes químicos de control. Análisis de resultados
Sesión 17
Trabajo práctico 16. Control de microorganismos. Agentes antibacterianos
Sesión 18
Trabajo práctico 17. Control de microorganismos. Agentes antibacterianos. Análisis de resultados

CONTROL DE MICROORGANISMOS.
AGENTES FISICOS DE CONTROL
ASEPSIA
Etimológicamente, el concepto asepsia significa “ausencia de podredumbre”. El término designa al
conjunto de técnicas que impiden el acceso de las bacterias no deseables al campo de trabajo hospitalario. El
objetivo es lograr o mantener la ausencia de microorganismos infecciosos en los tejidos vivos. Se dice que un
material es aséptico cuando está privado de gérmenes (por esterilización o desinfección).
SEPSIS
Hace referencia a la presencia de microorganismos patógenos en una o varias estructuras orgánicas. Una
sepsis, localizada en un punto determinado del cuerpo, puede provocar una respuesta inflamatoria sistémica, si
no es detectada y tratada a tiempo. Cuando la sepsis está localizada en sangre se denomina bacteriemia. El cuadro
de sepsis y bacteriemia juntos recibe el nombre de septicemia.
ANTISEPSIA
Es la técnica o el proceso que, por su baja toxicidad, se utiliza para conseguir la asepsia de la piel y de las
mucosas asociadas, en un organismo. La antisepsia normalmente es llevada a la práctica mediante agentes
químicos. Este término no implica la destrucción de todas las formas de vida; ya que, generalmente, los
antisépticos poseen un efecto bacteriostático. Una sustancia química bacteriostática inhibe el crecimiento o
multiplicación de las bacterias, evitando que aumente la cantidad de microorganismos en el tiempo. Sin embargo,
a veces, los antisépticos tienen efecto bactericida; es decir, destruyen a los microorganismos disminuyendo su
viabilidad. Los bacteriolíticos son sustancias que, además de ser bactericidas, lisan las células bacterianas.
Figura 27. Efectos de sustancias antisépticas y desinfectantes
ESTERILIZACION
Es un proceso de saneamiento preventivo mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de
vida microbianas, incluyendo bacterias y formas esporuladas altamente resistentes, hongos y virus. Se entiende
por muerte la pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo.
La esterilización se define como la destrucción completa o eliminación total de los microorganismos
patógenos y saprófitos que se encuentran en la superficie o en el interior de objetos y sustancias. El criterio
práctico para evaluar la esterilidad es la ausencia de crecimiento microbiano en un medio adecuado.

La eliminación de los microorganismos puede efectuarse mediante procesos físicos, mecánicos o
químicos. Los métodos físicos y mecánicos se incluyen en el término esterilización y los métodos químicos en el
concepto de desinfección.
El método escogido para esterilizar un producto depende fundamentalmente de su naturaleza y
estabilidad frente al calor u otros agentes esterilizantes. Así, por ejemplo, cuando necesitemos agregar suero
equino a un medio de cultivo líquido para enriquecerlo, no podemos aplicar calor para esterilizarlo, ya que se
produciría la coagulación de las proteínas del suero alterando su composición. Situación semejante ocurre con
otras sustancias o materiales termolábiles, para los cuales se utilizan métodos de esterilización que no alteren su
estabilidad, uniformidad o identidad de dichas sustancias o materiales.
DESINFECCIÓN
La desinfección puede definirse como el proceso encaminado a la eliminación de microorganismos por
alteración de su estructura o su metabolismo, con el objetivo de impedir su propagación. En este proceso se
elimina gran cantidad de bacterias, virus y hongos, pero no necesariamente todas las formas de vida de estos
microorganismos. Por lo tanto, la desinfección es un término relativo, donde el resultado dependerá del nivel de
desinfección aplicado, desde una desinfección química (con grado de esterilización) a una mínima reducción del
número de microorganismos contaminantes. Estos procedimientos se aplican únicamente a objetos inanimados.
La eficacia del procedimiento de desinfección se ve determinada por:
• Naturaleza del objeto a desinfectar
• El número y grado de resistencia de los microorganismos presentes en la superficie
• Cantidad de materia orgánica presente.
1. Desinfección de Alto nivel: Se utiliza esta desinfección para elementos invasivos que no soportan los
mecanismos de Esterilización. Tiene eficacia máxima cuando se elimina todo resto de materia orgánica.
2. Desinfección de Medio Nivel: Se utilizan en materiales y equipos donde es poco probable la contaminación por
esporas bacterianas.
3. Desinfección de Bajo Nivel: Se utiliza en los materiales que no atraviesan mucosas, solo contacto externo.
CLASIFICACIÓN DE SPAULDING
La clasificación de Spaulding, que data y rige desde 1968, es un criterio de indicadores para la desinfección de
objetos y materiales que se utilizan en el ámbito sanitario y hospitalario, que van a tener contacto con el paciente,
tipificados de acuerdo al riesgo de infección.
• Críticos: Penetran en los tejidos o cavidades. Normalmente deben estar estériles.
• Semicríticos: Entran en contacto con tejidos mucosos. Deben estar libre de bacterias.
• No Críticos: Deben por lo menos ser lavados, tienen contacto con piel sana.

Nivel Tipo de Equipo Ejemplo Mínimo nivel requerido
Crítico Instrumento inducido
directamente en el torrente
sanguíneo o en zonas estériles
del cuerpo.
Instrumentales quirúrgicos,
cateterismos cardíacos;
Catéteres IV, etc.
Esterilización
Semicrítico Objeto en contacto con mucosa
intacta
Endoscopios flexibles, tubos
endotraqueal, laringoscopios,
etc.
Desinfección de Alto nivel
(D.A.N.)
No Crítico Objeto en contacto con piel
intacta.
Manguito de presión sanguínea,
Otoscopio, etc.
Desinfección de Mediano y
Bajo nivel
Figura 28. Cuadro resumen. Criterios de desinfección, clasificación de Spaulding
La esterilización y desinfección conllevan generalmente a la destrucción, eliminación o inhibición de los
microorganismos, y constituyen los principales medios para prevenir infecciones en los hospitales.
Estos procedimientos se realizan mediante tres tipos de agentes:
1) Agentes Físicos
2) Agentes Químicos
3) Agentes Mecánicos
CLASIFICACION DE LOS METODOS DE ESTERILIZACION O DESINFECCIÓN
1. METODOS FISICOS: Se basan en la aplicación de agentes físicos naturales como, por ejemplo,
temperatura (calor), luz, radiación UV, radiación ionizante, entre otros.
Los métodos físicos conducen a la asepsia; es decir, a la ausencia de microorganismos patógenos y
saprófitos.
2. METODOS MECANICOS: Las sustancias que no se pueden esterilizar por métodos físicos o químicos se
pueden tratar por métodos mecánicos, como la filtración.
La filtración se basa en los procesos físico-químicos observados entre los cuerpos microbianos o
elementos en suspensión y una sustancia semi-porosa. Así se consigue separar y retener los microorganismos de
los líquidos o superficies que los contienen. Los líquidos a filtrar deben atravesar por presión o vacío pequeños
canalículos de manera que los microorganismos queden retenidos en el filtro por adsorción. En el mecanismo de
adsorción influyen la viscosidad del líquido, pH, cargas eléctricas, tiempo y temperatura. Los filtros (de asbesto,
vidrio, porcelana, celulosa) deben tener un diámetro de poro inferior al diámetro de las bacterias. Un tamaño de
poro utilizado ampliamente para este fin es 0.22 μm (no retienen virus).
3. METODOS QUIMICOS: Se utilizan sustancias químicas, como óxido de etileno, fenol, alcohol, halógenos
o tensoactivos, para conseguir que el metabolismo bacteriano se detenga.
Los métodos químicos conducen a la antisepsia (impedimento o retraso del desarrollo de
microorganismos patógenos en relación con el organismo humano) o a la desinfección (destrucción de
microorganismos patógenos y saprófitos sobre objetos o superficies inanimadas).

Métodos Físicos
I. CALOR SECO
El mecanismo de esterilización del calor seco es producir un aumento de las reacciones de oxidación de
los microorganismos.
A. la llama
La destrucción de los microorganismos mediante la llama es un procedimiento muy eficaz cuando el
material a esterilizar es indestructible o se va a inutilizar. Se usa para esterilizar el asa de platino que se calienta
al rojo blanco (1300°C), espátulas, pinzas, pipetas, bocas de tubo o matraces, etc., empleando la llama del mechero
Bunsen por un tiempo de exposición de 10 segundos (también se denomina “ flameado“).
Cuando, además de matar las bacterias, se destruye mediante el fuego el material que las contiene, se
habla de incineración. Este procedimiento se utiliza para destruir fluidos y restos orgánicos procedentes del
hospital, animales muertos por enfermedades contagiosas, ropa, vendas y objetos altamente contaminados.
B. Por aire caliente
El aire caliente confinado a temperatura de 160 a 180°C mantenido durante 1 hora, destruye con
seguridad todas las bacterias y sus esporas. Para su aplicación se recurre al uso del horno de aire caliente, siendo
el más usado el horno Pasteur, que tiene como fuente calórica una resistencia eléctrica que está ubicada en la
parte inferior de la cámara. El horno Pasteur se utiliza para esterilizar material de vidrio (tubos, placas Petri,
matraces, etc.), de porcelana, de acero y otros materiales inalterables a esa temperatura. Nunca se emplea para
esterilizar material plástico, líquidos o medios de cultivo.
II. CALOR HUMEDO
El mecanismo de esterilización por calor húmedo induce la coagulación de las proteínas del protoplasma
bacteriano y de los ácidos nucleicos, y la destrucción de las membranas celulares. Se considera un método más
efectivo que el calor seco por su mayor poder de penetración.
A. Por agua en ebullición
El agua en ebullición (100°C) es suficiente para matar formar vegetativas de bacterias, pero no sus
esporas. Se utiliza para esterilizar material de laboratorio resistente al calor, por ejemplo jeringas, agujas, pinzas,
etc. que se sumergen en un baño con agua a ebullición por aproximadamente 10 a 20 minutos.
B. Por vapor fluente
Se utiliza para la esterilización de instrumentos de cirugía, equipos de lechería, equipos de la industria de
alimentos, entre otros. Se alcanza una temperatura de aproximadamente 100°C si se mantiene sin presión y a
nivel del mar. Una exposición por 15 minutos es suficiente para destruir la forma vegetativa de las bacterias, pero
no sus esporas.
C. Por vapor de agua a presión
Las esporas de algunas bacterias son capaces de resistir los 100°C. La esterilidad completa sólo se alcanza
con el uso de calor húmedo a temperaturas más altas, en la forma de vapor saturado bajo presión. En ausencia
de aire, vapor de agua sometido a alta presión, tiene una temperatura constante. Por lo tanto, si conocemos la
presión podemos fácilmente conocer la temperatura que alcanza el vapor:
* vapor de agua a 121°C se obtiene con 1 atmósfera o 15 libras /(pulgada)2

En el laboratorio, el vapor de agua a presión se utiliza para esterilizar medios de cultivo, artículos de
plástico o polipropileno, soluciones u otros materiales para los cuales no se puede utilizar calor seco.
Los equipos empleados para la esterilización, bajo estas condiciones, se denominan autoclaves.
Existen distintos modelos de autoclaves (de carga vertical u horizontal), pero en general todos tienen las
siguientes partes: fuente calórica (gas, resistencia eléctrica o red de vapor), manómetro (con una escala lb/in2 o
Kg/cm2 o atmósferas), termómetro, llave de escape de vapor, válvula de seguridad, llave de descarga de agua y
llave de entrada de agua. Los autoclaves siempre deben ser manipulados por personal entrenado y autorizado.
Figura 29. Autoclave. A) Esquema del funcionamiento del autoclave; B) Etapas de autoclavado; C) Aspecto exterior

III. RADIACIONES
La radiación es absorbida por el ADN de los microorganismos, produciendo mutaciones letales o
modificaciones químicas del ADN de manera ya no es posible su proliferación. También inducen la formación de
sustancias químicas como oxhidrilos y átomos de hidrógeno, altamente reactivos con los procesos celulares
vitales. La radiación ultravioleta actúa directamente sobre el ADN en los líquidos que contienen oxígeno y
compuestos orgánicos mediante la producción de peróxidos orgánicos.
A. Luz solar
La luz solar tiene una propiedad bactericida muy eficaz, especialmente entre longitudes de onda de 2.100
a 3.000 Angstroms. Las bacterias esporógenas (productoras de esporas) son más resistentes que las no
esporógenas (no productoras de esporas). Lo mismo sucede con las bacterias fluorescentes que convierten las
ondas cortas (germicidas) en ondas largas de menor actividad. No es de mucha utilidad su acción esterilizante en
el laboratorio.
B. Radiación ultravioleta
Los rayos UV tienen escaso poder de penetración, lo que se utiliza principalmente para esterilizar las
superficies del material expuesto a la irradiación. En laboratorio, generalmente, se utilizan lámparas que emiten
luz con longitud de onda entre 2.650 y 2.750 Angstroms (Å) en la esterilización de aire, de ambientes y superficies
de trabajo o campo quirúrgico. Debe mantenerse un registro de las horas de esterilización de cada tubo, ya que
tienen una vida útil limitada que debe ser controlada.
C. Radiaciones ionizantes
Se utilizan preferentemente rayos gamma, que son radiaciones de alta energía emitidas por un isótopo
radioactivo de Cobalto 60 o Cesio 137. Dado su alto poder de penetración y la no generación de calor, se emplean
en la esterilización de material termosensible como el plástico (tubos, placas, jeringas y bolsas desechables), hilos
de sutura, entre otros.
Métodos Mecánicos
I. FILTRACION
Los filtros de uso corriente en el laboratorio son:
a) Filtros Seitz: Son discos de asbesto de diferentes diámetros y diferente porosidad. Estos discos se montan en
un aparato metálico donde se coloca el líquido a filtrar. Los discos se desechan después de su uso. Los filtros y sus
soportes se deben esterilizar en autoclave.
b) Filtros de vidrio poroso: Se fabrican en base a vidrio finamente pulverizado y comprimido.
c) Filtros de membrana: Son discos de ésteres de celulosa (acetato o triacetato) con 12 porosidades distintas,
según su uso. Los discos de poros con 0.22 μm de diámetro se consideran esterilizantes (para eliminación de
bacterias).

TRABAJO PRACTICO 12
AGENTES FISICOS DE CONTROL
• El estudiante será capaz de interpretar los resultados obtenidos en la aplicación de métodos de control
de microorganismos
1. Esterilización con fuego. Esterilizar un asa, luego tomar un inóculo a partir de un cultivo (Escherichia coli en
placa) y sembrar una mitad de placa de agar Tripticasa. Posteriormente, tomar el inóculo a partir del mismo
cultivo bacteriano, esterilizar el asa y luego sembrar en la otra mitad de placa. Incubar a 35-37°C por 24 h.
2. Efecto del agua caliente a distintas temperaturas. En el laboratorio dispondrá de 3 baños termorregulados
con las siguientes temperaturas (50, 70 y 100°C respectivamente).
A partir de un cultivo saturado de E. coli, sembrar una asada en tres caldos de caldo tripticasa estériles.
Repetir la operación con Bacillus subtilis. Colocar los tubos, de E. coli y B. subtilis a las temperaturas de 50,
70 y 100°C por 5 min. Terminado el proceso enfriar al agua corriente y luego incubar por 24 h a 37°C.
3. Efecto de radiación UV en el crecimiento bacteriano. Sembrar Escherichia coli y B. subtilis sobre tres placas de
agar tripticasa (en tapiz bacteriano con tórula) respectivamente. Someter las placas a distintos tiempos de
radiación UV: 0 (control), 5, 10 y 15 min. Luego incubar a 37°C por 48 h.

TRABAJO PRÁCTICO 13
AGENTES FISICOS DE CONTROL. PARTE II
de microorganismos
1. Revisión de resultados: los estudiantes deben documentar los resultados obtenidos
2. Los estudiantes deben realizar un análisis de los resultados obtenidos

AGENTES QUÍMICOS DE CONTROL
Métodos Químicos
Los antisépticos y desinfectantes son sustancias químicas ampliamente utilizadas. De acuerdo a su acción
se pueden clasificar en bactericidas (destruyen las bacterias) o bacteriostáticos (inhiben el desarrollo bacteriano,
pero éste se reanuda cuando se retira el agente, de modo que tienen una acción reversible).
La actividad germicida de los desinfectantes depende de las condiciones de uso: concentración, tiempo,
temperatura, pH, cantidad y calidad de la materia orgánica presente, características de la superficie, tipo y
concentración de microorganismos, entre otros.
Las sustancias químicas más frecuentemente usadas en el laboratorio son los siguientes:
1. ALCOHOLES: El alcohol etílico (etanol) es no tóxico, es incoloro e inodoro. Es útil contra las formas vegetativas
pero ineficaces contra las esporas. Actúa por deshidratación y desnaturalización de las proteínas. La concentración
óptima es al 70% (4 volúmenes de alcohol 95° más 1 volumen de agua destilada). El alcohol isopropílico es más
bactericida que el etanol, por lo que está desplazando al primero, ya que está libre de las restricciones legales de
la ley de alcoholes. Los demás alcoholes no son de uso práctico debido a su insolubilidad, olor y alto costo. Se usan
como antiséptico y desinfectante.
2. CLORO: El Hipoclorito de Sodio comercial viene a una concentración entre el 2,5 % y el 8 %. Para su uso en el
laboratorio se debe diluir al 1 %. El Hipoclorito de Sodio es un desinfectante de acción bactericida mediada por la
oxidación de los grupos sulfhidrilos libres.
3. YODO: tiene una acción bactericida sobre formas vegetativas y esporas, sobre hongos y algunos virus. Actúan
directamente por yoduración y oxidación, interfiriendo los procesos de óxido reducción y fosforilación
bacterianos. Se utiliza como tintura (solución alcohólica al 2% o 3%), lugol (solución acuosa al 5%) o para aumentar
la acción bactericida del alcohol etílico (alcohol yodado al 2%).
4. YODOFOROS: es una asociación de yodo con polímeros (polivinilpirrolidina) generalmente se usa al 10%, lo que
permite una liberación lenta de yodo (1%). Tiene acción bactericida y se utiliza como antiséptico y desinfectante.
5. FENOL: la solución al 0.2% tiene una acción bacteriostática, al 1% es letal para la mayoría de las bacterias y al
1.5% es fungicida. Se usa en soluciones acuosas, es de bajo costo tiene un gran poder de penetración aún en la
piel intacta.
6. IONES DE METALES PESADOS: sales de mercurio (Timerosal, Mercurio Cromo), plata (Nitrato de plata), Zinc
(Sulfato de zinc) y cobre (Sulfato de cobre) en concentraciones altas desnaturalizan las proteínas. Actúan
combinándose a los grupos sulfhidrilos. Se inactivan fácilmente en presencia de materia orgánica y no actúan
sobre las esporas.
7. AGENTES ALQUILANTES: sustituyen átomos lábiles de hidrógeno con radicales alquilo. Un ejemplo es el óxido
de etileno que se usa para esterilizar materiales plásticos. Tiene una gran penetración, muy activo contra esporas
y virus. Es extremadamente tóxico y forma mezclas explosivas con el aire.

8. DETERGENTES: Sólo son desinfectantes, destruyen membranas. Son tensoactivos (o surfactantes), es decir,
disminuyen la tensión superficial y favorecen el arrastre por el agua, dan una función de barrido. Los jabones
neutros son poco efectivos, por lo que el mayor efecto sobre los microorganismos se debe a la acción mecánica
con la cual se acompaña la aplicación. Su actividad disminuye con la materia orgánica y son inefectivos contra M.
tuberculosis, virus de la hepatitis y esporas.
Los detergentes se pueden clasificar, de acuerdo a su naturaleza química, en: no iónicos, aniónicos y
catiónicos (sales de amonio cuaternario), que son los más usados.
La efectividad de los detergentes catiónicos (con carga positiva) se atribuye a la capacidad de romper
membranas, inactivar enzimas productoras de energía y a la desnaturalización de las proteínas externas de la
célula. Son compuestos de amonio cuaternario (NH4), en los que los hidrógenos se sustituyen por cadenas de
carbono. Uno de los más usados, y el primero que se comercializó (1935), es el cloruro de benzalconio, por su baja
toxicidad y su buena acción detergente. El cloruro de benzalconio se usa en la desinfección preoperatoria de la
piel (concentración del 0.05 - 0.5%) y en toallitas antisépticas, posee un nivel de desinfección bajo. La actividad
antimicrobiana de los amonios cuaternarios (o Quats, por si siglas en inglés) se inactiva por los surfactantes
aniónicos, como los jabones. Sin embargo, los Quats de tercera generación permanecen activos en aguas duras y
toleran residuos aniónicos, por lo que se usan en la limpieza de pisos y paredes. Otros desinfectantes relacionados
son la clorhexidina y la octenidina. Son desinfectantes de material médico, alimentación y antisepsia de la piel.
9. FORMALDEHIDO: puede utilizarse en solución (Formalina) o al estado gaseoso como gas (formol) para
desinfectar ambientes de trabajo (aire). Al mezclar Permanganato de potasio (1 parte) con Formalina (2 partes),
se libera gas formol que es altamente bactericida y virucida.
Esterilización de virus
La velocidad de inactivación de los virus se relaciona con la concentración del agente y la duración de la
exposición. Los agentes inactivantes de virus son el formaldehído, luz UV, hidroxilamina y elementos radioactivos.
Los agentes activos contra las proteínas virales son calor, enzimas proteolíticas, ácidos débiles, luz
ultravioleta, compuestos sulfhidrilos y detergentes. Los agentes lipotróficos virales son solventes (como el
cloroformo)
10. ÁCIDOS Y ALCALIS: A pH extremos los microorganismos se inactivan. Sin embargo, algunos microorganismos
toleran pH muy extremos. Esto presenta utilidad, por ejemplo, para detectar M. tuberculosis al resistir pH básico
(álcalis). Las sustancias químicas que alteran el pH son utilizados principalmente para la preservación de otros
compuestos químicos, como los alimentos en la industria alimentaria. Ejemplos:
- Ácido benzoico - Refrescos, alimentos ácidos
- Ácido sórbico - Quesos
- Propionato cálcico – Pan

TRABAJO PRACTICO 14
AGENTES QUIMICOS DE CONTROL
de microorganismos
1. Efecto de desinfectantes de superficies. Utilizando 4 placas de agar tripticasa de soya, los estudiantes deben
dividir, utilizando un marcador, cada placa en dos partes.
Placa 1. En la primera mitad sembrar una muestra obtenida con una tórula humedecida con agua destilada
estéril, que se ha pasado por una superficie “sucia”. En la segunda mitad sembrar una muestra obtenida a
partir de una superficie que ha sido desinfectada previamente por cloro (deje actuar el cloro por 5 minutos)
Placa 2. En la tercera mitad sembrar una muestra obtenida a partir de una superficie que ha sido desinfectada
previamente con cloro (deje actuar el cloro por 10 minutos) y en la cuarta mitad sembrar una muestra
obtenida a partir de una superficie desinfectada previamente con cloro que ha actuado por 15 minutos.
Incubar las plAcas a 37°C por 24 h.
Placa 3. En la primera mitad sembrar una muestra obtenida con una tórula humedecida con agua destilada
estéril, que se ha pasado por una superficie “sucia”. En la segunda mitad sembrar una muestra obtenida a
partir de una superficie que ha sido desinfectada previamente por desinfectante en aerosol tipo “Lysoform”
(deje actuar por 5 minutos)
Placa 4. En la tercera mitad sembrar una muestra obtenida a partir de una superficie que ha sido desinfectada
previamente con el aerosol (deje actuar por 10 minutos) y en la cuarta mitad sembrar una muestra obtenida
a partir de una superficie desinfectada previamente con el aerosol que ha actuado por 15 minutos. Incubar
las placas a 35-37°C por 24 h.
2. Desinfección corporal. Utilizando 4 placas de agar sangre, los estudiantes deben dividir, utilizando un
marcador, cada placa en dos partes.
Para determinar el efecto de antisépticos sobre la microbiota normal del cuerpo, se debe realizar el mismo
procedimiento descrito previamente, seleccionando una superficie, tomando la muestra y retomando
posterior a la aplicación de alcohol gel sobre una superficie corporal y de solución de clorhexidina.
Posteriormente incubar a 35-37°C por 24 h.

TRABAJO PRÁCTICO 15
AGENTES QUIMICOS DE CONTROL. PARTE II
de microorganismos
1. Revisión de resultados: los estudiantes deben documentar los resultados obtenidos
2. Los estudiantes deben realizar un análisis de los resultados obtenidos

CONTROL DE MICROORGANISMOS
AGENTES ANTIBACTERIANOS DE CONTROL
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD MICROBIANA A ANTIBIÓTICOS
Los antibióticos son productos naturales de hongos, actinomicetos o bacterias, capaces de matar a los
microorganismos o de inhibir su crecimiento. La producción de antibióticos se asocia en particular con
microorganismos del suelo, presentes en la naturaleza, que al parecer proporcionan una ventaja selectiva a esos
microbios en su competencia por el espacio y los nutrientes. Aunque la mayoría de los agentes antibacterianos y
antimicóticos, usados hoy día en clínica, proceden de productos naturales de la fermentación, la mayor parte de
esos productos después son modificados químicamente para mejorar sus propiedades antibacterianas o
farmacológicas. Sin embargo, otros antibacterianos son completamente sintéticos, como las sulfamidas y las
quinolonas. Así pues, el término “antibacteriano” se usa con frecuencia en vez del término “antibiótico”.
A. Espectro de actividad antibacteriana.
Cada agente antibacteriano puede actuar solamente sobre un determinado número de especies bacterianas,
de tal manera que su utilidad clínica se dirige a las infecciones producidas por ese grupo de microorganismos. El
conjunto de especies bacterianas que pueden ser inhibidas o muertas por un agente antibacteriano (que son
susceptibles al antibacteriano) constituye el espectro de actividad antibacteriana, para ese agente en particular.
Generalmente, se acepta que los antibacterianos que actúan solamente sobre bacterias Gram-positivas, o bien
solamente sobre Gram-negativas poseen espectro antibacteriano reducido. En cambio, aquellos que pueden
actuar sobre especies de ambos grupos de microorganismos poseen amplio espectro antibacteriano. Es
importante comprender que esta clasificación de espectro antibacteriano se relaciona a la tendencia del
compuesto para actuar preferentemente sobre uno o los dos grupos bacterianos definidos por la tinción de Gram.
B. Tipo de actividad antibacteriana.
Los antibacterianos pueden inhibir el desarrollo bacteriano (actividad bacteriostática) o matar
microorganismos (actividad bactericida). En el laboratorio se expresa la actividad inhibitoria de estos compuestos
a través de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la actividad bactericida a través de la concentración
mínima bactericida (CMB). La primera (CMI) se define como la concentración más baja de antibacteriano que es
capaz de inhibir el crecimiento o desarrollo de una cepa bacteriana, y la segunda (CMB), como la menor
concentración que produce la muerte del cultivo. Ambas concentraciones se pueden determinar con relativa
exactitud en el laboratorio y son frecuentemente utilizados para evaluar la actividad antibacteriana de los
compuestos antibacterianos.
Un antibacteriano tendrá mayor potencia en la medida en que sus CMI y CMB sean más bajas, es decir, que
las concentraciones requeridas para inhibir o matar una cepa bacteriana sean bajas. Cuando un agente
antibacteriano es administrado en el organismo como tratamiento de un proceso infeccioso, puede manifestar
una actividad bacteriostática o, bien, una bactericida sobre el agente etiológico. En el primer caso se denominan
compuestos bacteriostáticos y si pueden matar microorganismos in vivo se denominan bactericidas. El efecto que
produce el antimicrobiano in vivo es una consecuencia de la relación entre la CMI, la CMB y la concentración de
antibacteriano que se alcanza en el lugar de la infección. La mayor posibilidad de obtener un efecto bactericida in
vivo sobre una cepa bacteriana existe cuando la CMB del antibacteriano es muy baja, ya que es hace factible que
en el organismo se sobrepase dicha concentración.

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