1. I. INTRODUCCION
Las bacterias se presentan en tres formas características, como son: bacilos,
espirilos, algunas presentan variaciones morfológicas, debido a la edad del medio
del cultivo (formas pleomorficas o involución) cada genero tiene sus propias
características tanto en forma ,tamaño y disposición de la célula.
Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los
colorantes básicos se manifiesta si tomamos en cuenta su principal contenido en
ácidosnucleicos. Esta propiedad a sido aprovechada para estudiar mejor los
diferentes tipos morfológicos y estructuras que ayudan a la identificación de una
especie o grupo en particular.
II. OBJETIVOS
- Familiarizar al estudiante con las característicasmorfológicas (tamaño,
forma, disposición), y movimiento, de algunos microrganismos, mediante el
uso del microscopio, en muestra fresca y fijarlas.
- Proporcionar conocimientos sobre los métodos mas comunes de
coloración, como simple y compuesta.

2. III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3.1. Examen en fresco
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos
vivos y observar: la movilidad, el tamaño y la forma de agrupación de los
microorganismos en su estado natural y sin alteraciones; así como gránulos
refráctiles, esporas si teñir y cloroplastos dentro de las células vivas. Sin
embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite
aumentar el contraste de la preparación por la escasa diferencia entre los
índices de refracción del medio y de los microorganismos; por otra parte, el
movimiento continuo de los microorganismos, así como el causado por las
corrientes de fluido, frecuentemente hacen difícil la observación. Por tanto, su
uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante limitado.
Las preparaciones deben de obtenerse de material clínico fresco o de
cultivos recientes durante 24 horas y realizándoles en medios adecuados.
Es una técnica que apenas se utiliza en el diagnostico microbiológico,
porque ofrece muy poca información en cuanto a la estructura y composición
de las bacterias.
3.2. Método de gota pendiente
Esta preparación se realiza colocando una gota de la suspensión
bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un círculo
con vaselina o parafina.(actúa como sellador) o parafina; sobre el cubreobjetos
se coloca un portaobjetos con una excavación central que queda adherido
gracias a la vaselina. Se invierte la preparación y se observa colocándola en la
platina del microscopio. La ventaja de esta técnica, es que la preparación no se
seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.

3. Fig.1: Método de gota pendiente.
3.3. PREPARACIONES FIJAS
La preparación consiste en una capa de la muestra extendida sobre un
portaobjetos libre de grasa. Estapreparación debe ser lo suficientemente
delgada para permitir el paso de la luz a través de ella. El“extendido” o “frote”
se puede hacer de varias maneras:
Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequeña gota de agua
mediante el asa ydistribuyéndolo en el portaobjetos.
Por “impronta”, presionando el porta sobre la muestra.
Colocando una gota de la muestra fluida en el portaobjetos.

4. Los extendidos o frotes se dejan secar al aíre; para asegurar que las células
queden adheridas alportaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se
realizan durante la tinción; la preparación se fija con calor moderado, pasando el
portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias
deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercúrico, procediendo a
hacer la tinción. Esta puede ser:
 Positiva: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las
estructuras en estudio;utilizan colorantes.
 Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparación y se observa la
silueta incolora de losmicroorganismos.
3.3.1. COLORANTES
Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el
contraste; son compuestos coloridosque al combinarse con otras sustancias
les confieren color. Están formados por un grupo cromóforo, queen la parte de
la molécula responsable del color y un grupo auxócromo que, al formar sales,
les permitedisociarse y combinarse. Existen algunos, llamados colorantes
vitales, que pueden añadirse directamentea una preparación en fresco; por
tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantesson
solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados,
es decir, se encuentrenmuertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación por
calor, se realiza una fina extensión de una gotade muestra líquida sobre un
portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparaciónde
forma rápida sobre la llama de un mechero; el calor de la llama mata las
células microbianas pordesnaturalización de sus proteínas. Las proteínas
coaguladas unen las células al porta. Cuando se deseafijar especímenes
delicados se utiliza la fijación química, que es menos agresiva que el calor.
Para ello seañade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico,
formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestralíquida con los
microorganismos.

5. 3.3.1.1. Tipos de colorantes
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados.
Colorantes básicos: son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el
ion cargado positivamente (elcromóforo) y se combinan con los
componentes ácidos de la célula como ADN y ARN.
Colorantes ácidos: es el ion cargado negativamente y se combinan con
los componentes básicos dela célula, como el citoplasma; es decir se
combinan con los componentes celulares en función de susrespectivas
cargas; por lo tanto, los factores como fuerza iónica, composición del
medio, temperatura ypH afectan las tinciones.
Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en
algunas técnicas de tinción. Los mordientes intensifican la tinción porque
aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Se usa cuando la afinidad
química entre el componente celular y el colorante es baja; también se pueden
utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares
externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser
visualizados de otra forma.
Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte
de las células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su
superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes
se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de
metileno. Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas
positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con
microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsinaácida y el
rojo Congo.
Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes
celulares tales como el negro de Sudán, que es liposoluble y permite distinguir
los glóbulos de grasa.

6. 3.3.2. Tipos de tinciones
Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.
1. Tinciones simples
En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de
tipo básico como safranina, azul demetileno o cristal violeta. Se utilizan
solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el
colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple

7. mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se
añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se
retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser
observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del
colorante.
2. Tinciones diferenciales
Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de
microorganismos. La técnica de tincióndiferencial consta de dos etapas:
una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción
simple) seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se
utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas
por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en
microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol
resistencia, ambas aplicadas a bacterias.
3. Tinción de Gram
Método de identificación de bacterias mediante una tinción específica.
Desarrollado por el médico danésHans Christian Joachim Gram en 1884.
Esta tinción clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivasy Gram
negativas. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen
la tinción azul ybacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas.
Algunas bacterias presentan capacidad variablede tinción de Gram y se
llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los
estafilococos queproducen forúnculos; Gram negativas representativas
son la Escherichia coli de la flora intestinal o losbacilos de la tos ferina;
Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.

8. La técnica incluye tinción primaria, decoloración y tinción de contraste:
En un primer momento las bacterias se tiñen con violeta de genciana
(derivado metilado anilínico) y después se tratan con la solución de Gram
(1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potásico y 300 partes de agua); por
último se lavan con alcohol etílico, o acetona y unas bacterias retienen el
fuerte color azul de lavioleta de genciana y otras se decoloran por
completo (en este momento, las bacterias Gram negativas pierden su
tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante). A veces se
añade una contra tinción con fucsina o eosina para teñir las bacterias
decoloradas de color rojo y hacerlas más visibles que tiñe de rosa las
bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las
bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso.
El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias
Gram positivas y Gram negativas se debe a las diferencias existentes en
sus superficies externas. Las células Gram negativas poseen una capa de
peptidoglicano delgada y una membrana externa. Las bacterias Gram
positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de
membrana externa.
IV. MATERIALES Y METODOS
4.1. MATERIALES
- Muestras
 Tubos conteniendo cultivos bacteriano(caldo o agar):cultivo de 24
horas de Escherichia coli, y Staphylococcus aureus, Bacillus sp; y
cultivos de 48 horas de Saccharomyces cerevisiae.
 Leche coagulada /yogurt / frutas fermentadas, etc.
- Laminas portaobjetos/laminilla cubreobjetos

9. - Asa de siembra
- Torundas estériles
- Solución salina
- Bacteria Gram:
 Cristal violeta
 Lugol
 Decolorante alcohol: acetona
 Colorante de contraste : safranina
- Azul de metileno en solución acuosa.
- Plumón indeleble o lápiz de cera.
- Laminas fijadas
- Microscopio óptico.
4.2. PROCEDIMIENTO
1. Examen en fresco (observar la morfología y motilidad de las bacteria)
- Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado. Con el as de siembra colocar
una gota de la muestra a observar.
- Colocar una laminilla cubreobjetos,sobre la gota, y observar al microscopio
utilizando primero el objetivo de 10x y luego el de 40x.
2. Preparaciones fijadas: Coloraciones
a) Coloración simple
- Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado.
- Con el asa de siembra tomar un inoculo del cultivo bacteriano (si en
caso es liquido), o colocar una gota de solución salina estéril (en caso
de ser solido) en el portaobjeto, luego tomar un poco de la muestra y
mezclar con la solución salina estéril.
- Hacer una extensión en la lámina (frotis), que no sea ni muy gruesa ni
muy fina.

10. - Dejar sacar a temperatura ambiente, o pasando por la llama del
mechero al fin de obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con 2 0 3 gotas de colorante de azul de metileno,
dejar que actué por 1minuto.
- Lavar la preparación con agua corriente, y evita que el chorro de agua
le caiga directamente sobre el frotis.
- Secar y observar en el microscopio óptico, usando el lente de inversión
(100x), con aceite de inversión o cedro.
b) Coloración compuesta : Método Gram
- Tomar un inoculo con el asa de siembra y extenderlo sobre la laminilla
portaobjeto limpio y desengrasada. Haciendo el frotis.
- Fijar la preparación del medio ambiente y a la llama del mechero,
controlar sobre el dorso de la mano si el calentamiento es moderado, ya
que si no habrá calcinación
- Cubrir con la solución cristal violeta por un minuto.
- Lavar ligeramente con agua corriente.
- Cubrir la preparación con lugol, dejando actuar el mordiente, por uno o
dos minutos
- Lavar con agua corriente.
- Agregar alcohol-acetona, hasta que este no arrastre colorante (regular
mediante movimientos de balanceo de la preparación).
- Lavar con agua corriente.
- Contrastar con el colorante safranina, por 30 segundos a 1min.
- Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados.
- Secar al aire o con ayuda al mechero.
- Observar al microscopio óptico, con el objetivo de inversión (100x).

11. V. RESULTADOS
Cuadro 1: Observaciones microorganismos.
VI. DISCUSION
La tinción compuesta y la tinción gram que hemos realizado en la práctica no se
obtuvieron resultados, ya que no se observaron el microscopio.
La tinción gram fue para el yogur, pero se realizó una tinción simple para el yogur
lo cual se observoLactobacillusdelbrueckiisubsp. Bulgaricus de coloración azul ,
esto indica que la coloración simple fue útil para el reconocimento de estos
microorganismo.
Nombre del
microorganismo
Forma de la
célula
Tamaño de
la célula
Disposición
celular
Clasificación
Muestra 1
(Agar nutritivo)
Gram (+) y (-)
Muestra 2
(Levadura)
Cocos
1-10 um. De
ancho y 2-3
um. De
longuitud
Independiente
estafilococos
Gram (+)
Muestra 3
(Yogurt) Bacilos
0,2-5 um. Independiente
bacilos
Gram (-)

12. VII. CONCLUSIONES
- Se conoció las técnicas de coloración como la simple y compuesta.
- Se observó las distintas formas y tamaños de las bacterias
analizadas en el laboratorio.
- La forma de bacteria presente en el yogurt es de forma esférica
conocida también como cocos.
- Se pudo notar en la coloración de tinción simple los estafilococos
coloreado de azul.
- En la tercera muestra no se distinguió muchos detalles pues esto se
debe a que no se obtuvo una buena extensión

13. VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué es necesario que se fije la preparación a la llama el
mechero?
La fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del
preparado durante la coloración así como también preservar la forma
original de los microorganismos.
El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la
llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para
ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos
más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol,
formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc.
2. ¿Debido a que las bacterias Gram (+) se colorean de color
violeta y las Gram (-) de rojo? Explique.
La explicación de las diferencias en el comportamiento tintorial
entre bacterias G(+) y G(-), se deben en la estructura y composición de
la pared celular bacteriana.
La pared de las bacterias Gram (+) está constituida
fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglucano (20-30 nm),
que es un polímero de N- acetil glucosamina y ácido N-acetil murámico.
Las cadenas de peptidoglucano, se unen a través de puentes formados
por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a
otra. En esta capa podemos también encontrar ácidos teicoicos,
formados por ésteres fosfato de glicerol o ribitol, y ácidos lipoteicoicos
cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos pero se hallan anclados
a la membrana citoplasmática.
En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglucano es mucho más
delgada (3-5 nm) y poseen una membrana externa de

14. estructuracompleja en cuya composición intervienen fosfolípidos,
proteínas y lipopolisacáridos.
3. ¿Ud. Cree que mediante la coloración Gram se puede observar
al Mycobacterium tuberculosis? Explique de acuerdo a su
respuesta. ¿En caso negativo describir el método para
observarlo y como se llama?
No, porque Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las
micobacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos
micólicos). Es observado mediante el método de: Tinción de ácido-
alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Esta tinción tiene interés desde el
punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos
microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes, tales como
Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) o M.leprae (lepra).
Procedimiento y descripción:
1. Extensión (Mycobacterium phleiy Micrococcusluteus).
2. Fijación.
3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza.
Empapar el papel conFucsina fenicada y pasarlo por encima de la
llama del mechero para que haya emisión devapores. Cuando dejen
de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la
llama,volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario.
Repetir hasta 5 minutos.
4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua.
5. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos.
6. Lavar con agua
7. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2
minutos.
8. Lavar con agua, secar y observar (100×).

15. Tinción de
esporas
4. Describir el método para colorear esporas bacterianas.
Describiremos las técnicas de Dorner y de Moeller :
Para la coloración de esporos según Dorner, se sensibiliza y colorea
ala espora con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre
nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras
celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se verán las
esporas rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro.
La técnica de Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en
caliente para sensibilizar y colorear ala espora. La decoloración se
realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se
observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul.
5. ¿Cree Ud. que el tamaño de la célula coloreada es natural o no?
¿Explique porque?
6. De acuerdo a sus observaciones en las láminas fijadas
(anteriormente) ¿Qué semejanzas encuentra en las muestras
estudiadas?

16. IX. REFERNCIA BIBLIOGRAFICA
- Manual de microbiología general de la UNAM:Velásquez, M. O.;
Vierna, G. L. y Luna, M. B.: Manejo y cuidado de los
microorganismos. Pp.25-32
- http://aulavirtual.usal.es/
- http://www.ucbcba.edu.bo/
- MOSSEL D. QUEVEDO F. Control microbiológica de los alimentos.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de Farmacia y
Bioquímica. Lima-Perú. 1967.
- NEVOT A. Control Bacteriológica Práctica de los Alimentos de
Origen Animal. Editorial. Flammarion. Paris. 1342.
- MANRIQUE V. VAILENAS R. Manual de Laboratorio de
Microbiologia General. Universidad Agraria La Molina. Lima – Perú.
1980. Pag. 01-20p.