Como manejar muestras histológicas y citológicas antes de realizar técnicas de patologia molecular como PCR o Hibridación in situ

1. RECOMENDACIONES EN EL TALLADO Y MANEJO
DE BLOQUES. FIJACIÓN, DESCALCIFICACIÓN Y
OTROS FIJADORES.
DAVID DE PABLO VELASCO
TÉCNICO SUP. ESP. ANATOMÍA PATOLÓGICA Y CITOLOGÍA
HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS (MADRID)

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TALLADO
▸ Recomendaciones generales del tallado de muestras, no hay
un protocolo específico para patología molecular
▸ material y zona de trabajo bien
limpia (pinzas, bisturí, tabla de tallar,
…), sobre todo entre pacientes.
▸ para muestras especificas para
patología molecular o biobanco,
coger primero la zona no tumoral
para evitar contaminaciones

3. FIJACIÓN
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▸ FÍSICA
▸ Congelación
▸ QUÍMICA
▸ Basados en metales pesados inhiben las enzimas
usadas en la PCR (Zenker´s, B5, …)
▸ Formaldehído tamponado

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la mejor opción …..
FIJACIÓN

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▸ Comúnmente conocido como
FORMOL
▸ Se usa en concentraciones al 4%
▸ Tiempo optimo de uso 24-48
horas
▸ Mas de 72 horas de fijación
puede degradar el DNA
Formaldehído
3
2
2
peligrosidad
FIJACIÓN
▸ Desde el 1 de Enero de 2016 reconocido cancerígeno,
mutagenico

6. OTROS FIJADORES
▸ ej. PFA (etanol, ac. propiónico, formol) no da buen resultado
y no se elimina totalmente el formol
▸ A dia de hoy, no hay ningún sustituto de formol que haya
sido avalado por la SEAP para su uso en patología molecular
▸ En la actualidad las casas comerciales están apostando más
por la protección del trabajador (ej. botes con formol y capa
de gel que evitar la evaporación, etc) y no por buscar un
sustituto del formol
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7. DESCALCIFICACIÓN
▸ Los basados en ácidos pueden degradar el DNA (Bouin,
descalcificadores comerciales, etc)
▸ Evitar su uso en la medida de lo posible, en muestras con
tejido blando y tejido duro, separar en distintas cápsulas ya
que así se pueden seguir los procedimientos adecuados en
cada uno de ellas, tejido blando fijación habitual con formol
evitando descalcificación y tejido duro, descalcificación y
posterior fijación con formol
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NO USAR

8. MANEJO DE BLOQUES
▸ Recomendaciones generales del manejo de bloques de
biopsias
▸ Limpiar muy bien todo el material (pinzas, cuchillo, etc)
▸ En bloques con exceso de parafina, retirar con cuchillo
limpio siempre que la técnica sea por PCR
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MANEJO DE BLOQUES

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MANEJO DE BLOQUES

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MANEJO DE BLOQUES

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17. XXXVIII CONGRESO NACIONAL DE LA SEAP-IAP
MANEJO DE BLOQUES

18. OPTIMIZACION DE LA MUESTRA
▸ CUANTAS MENOS VECES SE PONGA EL BLOQUE
EN EL MICROTOMO MEJOR
▸ Cuando las muestra son muy pequeñas, al ver la
Hematoxilina-Eosina tenemos que valorar el pedir todos los
cortes de las técnicas que podamos necesitar
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19. CORTE
▸ Todo el material (microtomo, baño, etc) muy bien limpio (con
liquido que degrade el RNA y DNA) y todo lo que sea
posible un solo uso y estéril (cuchilla microtomo, pinzas,
agujas, etc)
▸ Usar guantes
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20. CORTE
▸ Microtomo exclusivo para Patologia Molecular en zona
apartada
▸ Una cuchilla microtomo por paciente
▸ Agujas esteriles
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21. CORTE
▸ Técnicas basadas en hibridación in situ
(FISH, CISH, ROS1, ALK, etc)
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1 corte fino (2-3 micras)
portaobjetos tratado
con polilisina

22. CORTE
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Pequeñas 10 - 15 cortes a 5 micras
P. quirúrgica 4 - 8 cortes a 5 micras
Rulos parafina Cortes
▸ Técnicas basadas en PCR
(HPV, K-Ras, N-Ras, etc.)

23. CORTE
▸ Rulos de Parafina
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Aguja histológica
Bloque temperatura ambiente
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
eppendorf

24. CORTE
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▸ Rulos de Parafina
Bloque temperatura ambiente
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
eppendorf
Aguja histológica

25. CORTE
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▸ Rulos de Parafina
Bloque temperatura ambiente
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
eppendorf
Aguja histológica

26. CORTE
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▸ Rulos de Parafina
Bloque temperatura ambiente
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
eppendorf
Aguja histológica

27. CORTE
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Pinza
▸ Rulos de Parafina
Bloque temperatura ambiente
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
eppendorf

28. CORTE
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▸ Rulos de Parafina
Bloque temperatura ambiente
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
eppendorf
Pinza

29. CORTE
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▸ Rulos de Parafina
Bloque temperatura ambiente
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
eppendorf
Pinza

30. ▸ Cortes
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portaobjetos normal
Bloque temperatura fria
eppendorf
raspar con aguja estéril
la zona tumoral
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
Desparafinar (Xilol -
OH Abs. - OH 96)
CORTE

31. ▸ Cortes
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portaobjetos normal
Bloque temperatura fria
eppendorf
raspar con aguja estéril
la zona tumoral
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
Desparafinar (Xilol -
OH Abs. - OH 96)
CORTE

32. ▸ Cortes
XXXVIII CONGRESO NACIONAL DE LA SEAP-IAP
portaobjetos normal
Bloque temperatura fria
eppendorf
raspar con aguja estéril
la zona tumoral
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
Desparafinar (Xilol -
OH Abs. - OH 96)
CORTE

33. ▸ Cortes
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portaobjetos normal
Bloque temperatura fria
eppendorf
raspar con aguja estéril
la zona tumoral
el patólogo debe seleccionar el
bloque con más carga tumoral
Desparafinar (Xilol -
OH Abs. - OH 96)
CORTE

34. CITOLOGIAS
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▸ Si la proporción tumoral es adecuada
(mínimo 500 células tumorales)
eppendorf
retirar cubreobjetos
raspar la zona seleccionada con una cuchilla estéril
el patólogo debe seleccionar los
cristales con más carga tumoral

35. TAKE HOME MESSAGE
▸ limpieza exaustiva
▸ fijación en formol 4%
▸ no usar decalcificadores
▸ optimizar la muestra
▸ intentar usar la mayor cantidad posible de tumor
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36. GRACIAS
DAVIDEPABLOVELASCO@GMAIL.COM