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                                                                           Organización de un laboratorio de
      Introducción al laboratorio de                                       microbiología de alimentos
       microbiología de alimentos
                                                                          Recibo de muestras
                                                                          Almacén
                                                                          Preparación de
                                                                          medios de cultivo
                                                                          Siembra
                                                                          Descontaminación el
                                                                          material, lavado
                     María Marcela Martínez Miranda                       esterilización y
                                                                          preparación todo
                           M.Sc. Microbiología
                                                                          excepto los medios de
                     Dpto. de Ingeniería de Alimentos                     cultivo
                             Universidad de Caldas
                                                                          Administrativa
                                Marcela Martínez M.Sc.                                                 Marcela Martínez M.Sc.




  Material necesario en el laboratorio de                                    Material necesario en el laboratorio de
  microbiología de alimentos                                                      microbiología de alimentos
Equipo de esterilización:                                              • Otros instrumentos:
autoclave.                                                                 – microscopio
Sistema de conducción                                                     – balanza
de gas dotado con                                                          – Centrífuga
mecheros Bunsen.
                                                                           – nevera
Sistema de eliminación                                                    – peachímetro
de residuos.
                                                                           – agitadores magnéticos
Estufas de aire seco.                                                     – homogenizador
Estufas y baños de agua                                                   – cuenta colonias
caliente.                                                                  – equipo de filtración
Campanas de flujo                                                         – jarra de anaerobiosis
laminar
                                Marcela Martínez M.Sc.                                                 Marcela Martínez M.Sc.




     Material necesario en el laboratorio de                                Toma de muestra de los diferentes alimentos:
          microbiología de alimentos                                              normas generales y protocolos




  • Material menor: mecheros, cuchillos, espátulas, sacabocados, asas
    de platino, pipetas de vidrio, automáticas, material de vidrio,
    material de plásticos desechable, etc.
  • Medios de cultivo
                                                                                         El muestreo de alimentos destinados al análisis
  • Reactivos                                                                      microbiológico es la operación que consiste en separar un
                                                                                 numero determinado de muestras de un lote, remesa, partida,
  • Agua destilada o desionizada                                                 etc. con el fin de obtener unos resultados analíticos fiables. La
                                Marcela Martínez M.Sc.                                                  Marcela Martínez M.Sc.
                                                                                          muestra tiene que ser representativa del total.




                                                                                                                                                             1
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       Objetivos del muestreo                                           Toma de muestras para microbiología
 Detectar la presencia de                                               Debe ser representativa del lote del producto.
  microorganismos patógenos.
 Evaluar el cumplimiento de
                                                                         No debe sufrir daño o transformación durante el transporte y
  las normas microbiológicas.                                            almacenamiento.
 Conocer la vida útil del
  producto.
                                                                         Debe protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por el
 Conocer el estado higiénico                                            aire, el recipiente de muestreo, los equipos de toma de muestra o
                                                                         por una incorrecta manipulación.
  de la industria, ambiente,
  equipos, manipuladores, etc.
 Investigar brotes alimentarios.                                        Debería (siempre que sea posible) enviarse al laboratorio en su
                          Marcela Martínez M.Sc.
                                                                         recipiente original, sin abrir.
                                                                                                   Marcela Martínez M.Sc.




Toma de muestras para microbiología
                                                                        La muestra debe ser identificada de manera clara y
                                                                        completa.
Si el producto es voluminoso, se transfiere en condiciones
asépticas, una porción a un recipiente estéril.                         Información mínima necesaria para el laboratorio:
                                                                         Naturaleza del alimento.
El recipiente no debería llenarse en más de ¾ de su capacidad            Peso de la muestra.
para evitar posibles vertidos y favorecer el mezclado en el
laboratorio.                                                             Fecha, lugar y hora del muestreo.
                                                                         Razones del muestreo.
Utensilios para el muestreo: cucharas, sacabocados, espátulas,           T del producto en el momento del muestreo.
taladros, cuchillos, pipetas, siempre estériles y escogidos de
acuerdo a la naturaleza del alimento.                                    T de recepción.
                                                                             De esto depende la aceptación de la muestra !!!
                           Marcela Martínez M.Sc.                                                  Marcela Martínez M.Sc.




          Transporte de la muestra                                        Temperaturas de transporte recomendadas
  Debe asegurar que se minimice la alteración en el número de
  microorganismos presentes.
                                                                          Productos estables: temperatura ambiente
                                                                           (por debajo de 40 ºC)
  La muestra se envía al laboratorio con prontitud, manteniendo
  dentro de lo posible, las condiciones de almacenamiento originales.     Productos inestables a temperatura
                                                                           ambiente: entre 1 ºC y 8 ºC
   Debe empaquetarse de forma que se eviten roturas o derrames.
                                                                          Productos congelados y ultracongelados:
  Las muestras que necesitan refrigeración o congelación deben             menos de - 15 ºC, preferiblemente menos
  transportarse en contenedores aislantes, con refrigerantes o hielo       de - 18ºC
  seco, a fin de mantener las temperaturas de transporte
  respectivas.
                                                                           Referencia:
                                                                           NTC 4092:2009 Microbiología de los alimentos y productos para
                 No debe utilizase hielo suelto para                       alimentación animal- Requisitos generales y directrices para
                      evitar contaminaciones.
                       Marcela Martínez M.Sc.
                                                                           análisis microbiológico. Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                   2
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                   Recepción de la Muestra
 Si las condiciones no son satisfactorias o la muestra es
                                                                                          Almacenamiento de la muestra
 insuficiente, el laboratorio debería rechazarla.                             Temperaturas de almacenamiento
 Documentar las muestras admitidas de tal manera que se                        recomendadas      (NTC 4092:2009)
 garantice la trazabilidad en todas las fases:
         - Identidad y codificación.
                                                                              • Productos estables: temperatura ambiente
                                                                                entre 18 ºC y 27 ºC
         - Fecha y hora de recibo.
         - Detalles del muestreo (fecha, hora y lugar).                       • Productos inestables a temperatura de
         - Nombre y dirección del cliente.                                      refrigeración: 3 ºC 2 ºC
         - Temperatura de recepción.                                          • Productos congelados y ultracongelados:
 Examinar las muestras tan pronto sea posible:                                  menos de - 15 ºC, preferiblemente menos
         - Productos altamente perecederos (mariscos): antes                    de - 18ºC
 de      las    24 h.
         - Productos perecederos: Máximo de 36 h.
                           Marcela Martínez M.Sc.                                                                            Marcela Martínez M.Sc.




                                                                        PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS.
  Se debe asegurar la separación física de las                          Esta operación exige unas reglas de manipulación aséptica muy estrictas, así como
   muestras destinadas al análisis durante el                           la utilización de material y diluyentes estériles, para evitar la contaminación exterior
                                                                        del alimento. Se utilizan campanas o cámaras de flujo laminar adecuadas para la
       almacenamiento a fin de evitar la                                preparación de muestras, que suponen una gran ayuda para evitar el riesgo de
                                                                        cualquier contaminación
           contaminación cruzada




                                                          Reactivos y
      Muestras de        Medios incubados y                medios de
        análisis             cultivos de                   cultivo no
       3 ºC 2 ºC          microorganismos                 inoculados                                                       Marcela Martínez M.Sc.
                            Marcela Martínez M.Sc.
                             5 ºC 3 ºC                     5 ºC 3 ºC




      Trituración y homogeneización de                                              Preparación de diluciones
                   alimentos
                                                                             Muestras sólidas
• Jarra: Consiste en un envase de                                           Solución madre:                                                                      Muestras líquidas
                                                                            1/10 de alimento
  vidrio o acero provisto de una hélice.                                    en Diluyente
                                                                                                                                                                 Solución madre:
                                                                                                                                                                 1/10 de alimento
• Vástago: Provisto de una hélice en                                                                                                                             en Diluyente

  su extremo, que se introduce en la
  mezcla que se va a triturar. Necesita
  un envase de vidrio o acero que se                                      10 ml
                                                                                                                                          10 ml

  adapte especialmente al vástago.

• Triturador de paletas (Stomacher),                                                                                                              10-1         10-2      10-3        10-4     10-5
                                                                             10-1        10-2      10-3         10-4        10-5
  que actúa golpeando rítmicamente la
  mezcla de alimento y diluyente que                                                                                                                             BPW Agua de peptona tamponada
                                                                                                                                                                 Peptona                10 g
                                                                          Diluyente Agua de triptona                   Solución Tinger 1/4
  ha sido introducida previamente en                                      (Tryptone Water: TW)                         Cloruro sódico               9g           Cloruro sódico         5g
                                                                          Triptona                   10 g              Cloruro cálcico anhidro      0,42g        Fosfato disódico       9g
  una bolsa de plástico estéril.                                          Cloruro sódico             5g                Hidrogeno Carbonato sódico   0,20g        Fosfato potásico       1,5g
                                                                          Agua destilada             1.000 ml          Agua destilada               1.000 ml     Agua destilada         1.000 ml


                            Marcela Martínez M.Sc.                                                                         Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                                                                     3
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    Recuento de viables:(Método indirecto)                                                   Métodos de siembra para recuento
                                                                                                        de viables




    Consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra
    sobre el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número
    de viables contando el número de colonias que se forman puesto                                  Ventajas: sólo células viables, sencillo, sensible
    que cada una de estas deriva de una UFC. Para que la medida sea
    correcta desde el punto de vista estadístico, es necesario contar
                                                                                                    Desventajas: dispersar bien los microorganismos, hay
    entre 30 y 300 UFC.     Marcela Martínez M.Sc.                                                  que esperar de 24 a Marcela Martínez tener resultados
                                                                                                                        48 h para M.Sc.




RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS                                            RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
 Método de siembra en superficie                                                            Método de siembra en masa
                                                                                                                                                                                     RECUENTO
                                                                                                                                                 Agar nutritivo de recuento
                                                                  RECUENTO                                                                       (Plate Count Agar: PCA)
                                                                                                                                                                                  U.F.C. = C x 1/D x 1/i
                                                                                                                                                 Triptona               5g
              Suspensión madre 1:10 TW                         U.F.C. = C x 1/D x 1/i                   Suspension madre 1:10 TW                 Extracto de levadura   2,50 g
                                                                                                                                                                                  C= nº colonias contadas
                                                                                                                                                 Dextrosa               1g
                                                               C= nº colonias contadas                                                                                            D= dilución
                                                                                                                                                 Agar                   2g
 10 ml                                                         D= dilución                  10 ml                                                                                 I= inóculo
                                                                                                                                                 Agua destilada        1.000 ml
                                                               I= inóculo




     10-1      10-2        10-3      10-4     10-5                                              10-1     10-2     10-3      10-4     10-5



                                                                                                                   1 ml
                          0,1ml




                                                                                                                 Agar PCA

                      Agar PCA                                                                              Incubación 31ºC, 72h
              Incubación 31ºC, 72h


                                      Marcela Martínez M.Sc.                                                                       Marcela Martínez M.Sc.
                                                                                                                 Recuento




                                                                                           Cálculo del número de
                                                                                           unidades formadoras
                                                                                           de colonias (ufc)/ml




                                                                                         ufc/ml= n° de colonias (30-300) x 1/dilución x 1/vol.sembrado (ml)
                                      Marcela Martínez M.Sc.                             Ej. ufc/ml= 50 x 1/10-6 x 1/0.1ml=50 x 107 = 5.0 x 108
                                                                                                                       Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                                                                            4
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  GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE
 MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (NTC-
                4092)
  Rangos para el recuento:
   – 30-300 UFC: Aerobios mesófilos; coliformes,
     recuento de bacterias termófilas, proteolíticas,
     lipolíticas.

   – 20-200 UFC: S. aureus, B. cereus,
     Clostridium sulfito reductores etc.

   – 15-150 UFC: Mohos y levaduras, levaduras
     osmofílicas.
                    Marcela Martínez M.Sc.                                   Marcela Martínez M.Sc.




      Recuento y expresión de                                Recuento y expresión de
            resultados                                     Recuento y expresión de resultados
                                                                     resultados
1. Se calcula el promedio de colonias para cada una     4. Se redondea el resultado calculado a dos
   de las diluciones a examinar multiplicando el           cifras significativas. Para esto si la última cifra
   resultado por el factor inverso de la dilución
   respectiva.                                             es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica;
                                                           si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior
2. Dividir el resultado obtenido de la mayor dilución
   (Menos concentrada) por el resultado de la menor
                                                           se incrementa en una unidad.
   dilución (más concentrada).                          5. Los resultados se expresan en UFC por gramo
3. Si el cociente de esta división es mayor a 2,           o mililitro de producto según la naturaleza del
   reportar el resultado obtenido en la dilución más       mismo, expresado como un número entre 10 y
   concentrada. Pero, si el cociente es menor de 2         99 (dos cifras significativas enteras)
   reportar la media aritmética de los recuentos de
   las dos diluciones consecutivas.                        multiplicado por 10X donde x es la potencia
                    Marcela Martínez M.Sc.                 apropiada de 10. Martínez M.Sc.
                                                                             Marcela




                                                                   Casos especiales
                                                        • CASO 1: Cuando el número de UFC se
                                                          encuentran por debajo del rango
                                                          mínimo en ambas cajas, se informará así:
                                                           – Se descarta el recuento obtenido en la mayor
                                                             dilución y se calcula la media aritmética de
                                                             las colonias presentes en las dos cajas de la
                                                             menor dilución multiplicándose por el inverso
                                                             de la dilución y se informa el resultado como
                                                             sigue:
                                                           – Conteo estimado de UFC por gramo o
                    Marcela Martínez M.Sc.                   mililitro    Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                    5
06/12/2011




         Casos especiales                                      Casos especiales
• CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las          • CASO 3: Crecimiento abundante, si las dos cajas
                                                     correspondientes a la primera dilución presentan
  dos cajas correspondientes a la primera            crecimiento mayor de 300 colonias:
  dilución no presentan crecimiento se               – Se divide la caja en 2, 4, 6, 8 cuadrantes
  reportará como negativo y se informa el            – Se cuenta el número de colonias presente en un
  resultado como sigue:                                cuadrante y se multiplica por el total de
                                                       cuadrantes y por el inverso de la dilución.
  – Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro
                                                     – Se continua el recuento como en el caso general
  – < 1x10X UFC por gramo o mililitro según            pero se informa el resultado como Conteo
                                                       estimado de UFC por gramo o mililitro
    corresponda. C.E.
                  Marcela Martínez M.Sc.                                   Marcela Martínez M.Sc.




                  Marcela Martínez M.Sc.                                   Marcela Martínez M.Sc.




  Recuento de viables en medio líquido                          Recuento de viables por
      Número más probable (NMP)                                 filtración con membrana




                                                   Ventajas: se puede usar en muestras diluidas, células
                                                   viables

                  Marcela Martínez M.Sc.
                                                   Desventajas: tarda de 24h Martínez M.Sc.
                                                                        Marcela
                                                                                a 48h




                                                                                                                   6
06/12/2011




“Solo una cosa vuelve a un sueño imposible:
            el miedo a fracasar”
              Marcela Martínez M.Sc.   Paulo Coelho




                                                              7

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Introducción al laboratorio de microbiología de alimentos

  • 1. 06/12/2011 Organización de un laboratorio de Introducción al laboratorio de microbiología de alimentos microbiología de alimentos Recibo de muestras Almacén Preparación de medios de cultivo Siembra Descontaminación el material, lavado María Marcela Martínez Miranda esterilización y preparación todo M.Sc. Microbiología excepto los medios de Dpto. de Ingeniería de Alimentos cultivo Universidad de Caldas Administrativa Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Material necesario en el laboratorio de Material necesario en el laboratorio de microbiología de alimentos microbiología de alimentos Equipo de esterilización: • Otros instrumentos: autoclave. – microscopio Sistema de conducción – balanza de gas dotado con – Centrífuga mecheros Bunsen. – nevera Sistema de eliminación – peachímetro de residuos. – agitadores magnéticos Estufas de aire seco. – homogenizador Estufas y baños de agua – cuenta colonias caliente. – equipo de filtración Campanas de flujo – jarra de anaerobiosis laminar Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Material necesario en el laboratorio de Toma de muestra de los diferentes alimentos: microbiología de alimentos normas generales y protocolos • Material menor: mecheros, cuchillos, espátulas, sacabocados, asas de platino, pipetas de vidrio, automáticas, material de vidrio, material de plásticos desechable, etc. • Medios de cultivo El muestreo de alimentos destinados al análisis • Reactivos microbiológico es la operación que consiste en separar un numero determinado de muestras de un lote, remesa, partida, • Agua destilada o desionizada etc. con el fin de obtener unos resultados analíticos fiables. La Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. muestra tiene que ser representativa del total. 1
  • 2. 06/12/2011 Objetivos del muestreo Toma de muestras para microbiología  Detectar la presencia de Debe ser representativa del lote del producto. microorganismos patógenos.  Evaluar el cumplimiento de No debe sufrir daño o transformación durante el transporte y las normas microbiológicas. almacenamiento.  Conocer la vida útil del producto. Debe protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por el  Conocer el estado higiénico aire, el recipiente de muestreo, los equipos de toma de muestra o por una incorrecta manipulación. de la industria, ambiente, equipos, manipuladores, etc.  Investigar brotes alimentarios. Debería (siempre que sea posible) enviarse al laboratorio en su Marcela Martínez M.Sc. recipiente original, sin abrir. Marcela Martínez M.Sc. Toma de muestras para microbiología La muestra debe ser identificada de manera clara y completa. Si el producto es voluminoso, se transfiere en condiciones asépticas, una porción a un recipiente estéril. Información mínima necesaria para el laboratorio:  Naturaleza del alimento. El recipiente no debería llenarse en más de ¾ de su capacidad  Peso de la muestra. para evitar posibles vertidos y favorecer el mezclado en el laboratorio.  Fecha, lugar y hora del muestreo.  Razones del muestreo. Utensilios para el muestreo: cucharas, sacabocados, espátulas,  T del producto en el momento del muestreo. taladros, cuchillos, pipetas, siempre estériles y escogidos de acuerdo a la naturaleza del alimento.  T de recepción. De esto depende la aceptación de la muestra !!! Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Transporte de la muestra Temperaturas de transporte recomendadas Debe asegurar que se minimice la alteración en el número de microorganismos presentes.  Productos estables: temperatura ambiente (por debajo de 40 ºC) La muestra se envía al laboratorio con prontitud, manteniendo dentro de lo posible, las condiciones de almacenamiento originales.  Productos inestables a temperatura ambiente: entre 1 ºC y 8 ºC Debe empaquetarse de forma que se eviten roturas o derrames.  Productos congelados y ultracongelados: Las muestras que necesitan refrigeración o congelación deben menos de - 15 ºC, preferiblemente menos transportarse en contenedores aislantes, con refrigerantes o hielo de - 18ºC seco, a fin de mantener las temperaturas de transporte respectivas. Referencia: NTC 4092:2009 Microbiología de los alimentos y productos para No debe utilizase hielo suelto para alimentación animal- Requisitos generales y directrices para evitar contaminaciones. Marcela Martínez M.Sc. análisis microbiológico. Marcela Martínez M.Sc. 2
  • 3. 06/12/2011 Recepción de la Muestra Si las condiciones no son satisfactorias o la muestra es Almacenamiento de la muestra insuficiente, el laboratorio debería rechazarla. Temperaturas de almacenamiento Documentar las muestras admitidas de tal manera que se recomendadas (NTC 4092:2009) garantice la trazabilidad en todas las fases: - Identidad y codificación. • Productos estables: temperatura ambiente entre 18 ºC y 27 ºC - Fecha y hora de recibo. - Detalles del muestreo (fecha, hora y lugar). • Productos inestables a temperatura de - Nombre y dirección del cliente. refrigeración: 3 ºC 2 ºC - Temperatura de recepción. • Productos congelados y ultracongelados: Examinar las muestras tan pronto sea posible: menos de - 15 ºC, preferiblemente menos - Productos altamente perecederos (mariscos): antes de - 18ºC de las 24 h. - Productos perecederos: Máximo de 36 h. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS. Se debe asegurar la separación física de las Esta operación exige unas reglas de manipulación aséptica muy estrictas, así como muestras destinadas al análisis durante el la utilización de material y diluyentes estériles, para evitar la contaminación exterior del alimento. Se utilizan campanas o cámaras de flujo laminar adecuadas para la almacenamiento a fin de evitar la preparación de muestras, que suponen una gran ayuda para evitar el riesgo de cualquier contaminación contaminación cruzada Reactivos y Muestras de Medios incubados y medios de análisis cultivos de cultivo no 3 ºC 2 ºC microorganismos inoculados Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 5 ºC 3 ºC 5 ºC 3 ºC Trituración y homogeneización de Preparación de diluciones alimentos Muestras sólidas • Jarra: Consiste en un envase de Solución madre: Muestras líquidas 1/10 de alimento vidrio o acero provisto de una hélice. en Diluyente Solución madre: 1/10 de alimento • Vástago: Provisto de una hélice en en Diluyente su extremo, que se introduce en la mezcla que se va a triturar. Necesita un envase de vidrio o acero que se 10 ml 10 ml adapte especialmente al vástago. • Triturador de paletas (Stomacher), 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 que actúa golpeando rítmicamente la mezcla de alimento y diluyente que BPW Agua de peptona tamponada Peptona 10 g Diluyente Agua de triptona Solución Tinger 1/4 ha sido introducida previamente en (Tryptone Water: TW) Cloruro sódico 9g Cloruro sódico 5g Triptona 10 g Cloruro cálcico anhidro 0,42g Fosfato disódico 9g una bolsa de plástico estéril. Cloruro sódico 5g Hidrogeno Carbonato sódico 0,20g Fosfato potásico 1,5g Agua destilada 1.000 ml Agua destilada 1.000 ml Agua destilada 1.000 ml Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 3
  • 4. 06/12/2011 Recuento de viables:(Método indirecto) Métodos de siembra para recuento de viables Consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número de viables contando el número de colonias que se forman puesto Ventajas: sólo células viables, sencillo, sensible que cada una de estas deriva de una UFC. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadístico, es necesario contar Desventajas: dispersar bien los microorganismos, hay entre 30 y 300 UFC. Marcela Martínez M.Sc. que esperar de 24 a Marcela Martínez tener resultados 48 h para M.Sc. RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS Método de siembra en superficie Método de siembra en masa RECUENTO Agar nutritivo de recuento RECUENTO (Plate Count Agar: PCA) U.F.C. = C x 1/D x 1/i Triptona 5g Suspensión madre 1:10 TW U.F.C. = C x 1/D x 1/i Suspension madre 1:10 TW Extracto de levadura 2,50 g C= nº colonias contadas Dextrosa 1g C= nº colonias contadas D= dilución Agar 2g 10 ml D= dilución 10 ml I= inóculo Agua destilada 1.000 ml I= inóculo 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1 ml 0,1ml Agar PCA Agar PCA Incubación 31ºC, 72h Incubación 31ºC, 72h Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Recuento Cálculo del número de unidades formadoras de colonias (ufc)/ml ufc/ml= n° de colonias (30-300) x 1/dilución x 1/vol.sembrado (ml) Marcela Martínez M.Sc. Ej. ufc/ml= 50 x 1/10-6 x 1/0.1ml=50 x 107 = 5.0 x 108 Marcela Martínez M.Sc. 4
  • 5. 06/12/2011 GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (NTC- 4092) Rangos para el recuento: – 30-300 UFC: Aerobios mesófilos; coliformes, recuento de bacterias termófilas, proteolíticas, lipolíticas. – 20-200 UFC: S. aureus, B. cereus, Clostridium sulfito reductores etc. – 15-150 UFC: Mohos y levaduras, levaduras osmofílicas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Recuento y expresión de Recuento y expresión de resultados Recuento y expresión de resultados resultados 1. Se calcula el promedio de colonias para cada una 4. Se redondea el resultado calculado a dos de las diluciones a examinar multiplicando el cifras significativas. Para esto si la última cifra resultado por el factor inverso de la dilución respectiva. es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica; si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior 2. Dividir el resultado obtenido de la mayor dilución (Menos concentrada) por el resultado de la menor se incrementa en una unidad. dilución (más concentrada). 5. Los resultados se expresan en UFC por gramo 3. Si el cociente de esta división es mayor a 2, o mililitro de producto según la naturaleza del reportar el resultado obtenido en la dilución más mismo, expresado como un número entre 10 y concentrada. Pero, si el cociente es menor de 2 99 (dos cifras significativas enteras) reportar la media aritmética de los recuentos de las dos diluciones consecutivas. multiplicado por 10X donde x es la potencia Marcela Martínez M.Sc. apropiada de 10. Martínez M.Sc. Marcela Casos especiales • CASO 1: Cuando el número de UFC se encuentran por debajo del rango mínimo en ambas cajas, se informará así: – Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media aritmética de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución multiplicándose por el inverso de la dilución y se informa el resultado como sigue: – Conteo estimado de UFC por gramo o Marcela Martínez M.Sc. mililitro Marcela Martínez M.Sc. 5
  • 6. 06/12/2011 Casos especiales Casos especiales • CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las • CASO 3: Crecimiento abundante, si las dos cajas correspondientes a la primera dilución presentan dos cajas correspondientes a la primera crecimiento mayor de 300 colonias: dilución no presentan crecimiento se – Se divide la caja en 2, 4, 6, 8 cuadrantes reportará como negativo y se informa el – Se cuenta el número de colonias presente en un resultado como sigue: cuadrante y se multiplica por el total de cuadrantes y por el inverso de la dilución. – Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro – Se continua el recuento como en el caso general – < 1x10X UFC por gramo o mililitro según pero se informa el resultado como Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro corresponda. C.E. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Recuento de viables en medio líquido Recuento de viables por Número más probable (NMP) filtración con membrana Ventajas: se puede usar en muestras diluidas, células viables Marcela Martínez M.Sc. Desventajas: tarda de 24h Martínez M.Sc. Marcela a 48h 6
  • 7. 06/12/2011 “Solo una cosa vuelve a un sueño imposible: el miedo a fracasar” Marcela Martínez M.Sc. Paulo Coelho 7

Notas del editor

  1. El estado de la muestra recibida para el examen es de gran importancia. Si las muestras se recogen y manejan incorrectamente o no son representativas del lote muestreado, los resultados no serán significativos. Las interpretaciones sobre un lote grande de alimentos se basan en una muestra relativamente pequeña de la porción. Por lo tanto los procedimientos de muestreo establecidos se deben aplicar uniformemente. Una muestra representativa es esencial cuando los patógenas o sus toxinas se encuentran en pequeño número dentro del alimento o cuando la destrucción de un producto establecida por ley depende del contenido bacteriano.
  2. Toma de muestras selectiva : Se utiliza generalmente toma de muestras selectiva cuando se quiere aumentar la posibilidad de detectar productos defectuosos o que incumplen las normas vigentes, las muestras que se toman para atender reclamos se suelen seleccionar y de esta forma hay una mayor probabilidad de confirmar hechos conocidos por esto se denomina muestra selectiva. Es selectiva por que se orienta a aumentar la probabilidad de tomar productos sospechosos   Toma de muestra objetiva : Método de toma de muestras recomendado por la FAO para productos alimenticios importados ya que no se han supervisado las operaciones de fabricación en el país importador y en consecuencia no se dispone de indicios para tomar muestras selectivas.   El muestreo objetivo implica que el inspector tiene acceso a todas las unidades que componen el lote para el muestreo y que cada unidad es identificable y tiene las mismas posibilidades de resultar seleccionada. Se lleva a cabo extrayendo al azar pequeñas unidades de varios puntos dentro del lote, combinándolas luego para formar la muestra. La toma de muestras objetiva resulta complicada al ser difícil proceder con objetividad cuando se trata de determinar la calidad de un lote determinado de alimentos no homogéneos, siempre quedará la duda sobre si la muestra recogida fue demasiado pequeña o excesivamente grande y si la selección se hizo realmente al azar.   Toma de muestras Mixta (objetiva – selectiva) La mayoría de los muestreos son selectivos u objetivos sin embargo en ocasiones al recoger una muestra objetiva y a causa de alguna observación se puede cambiar a la toma de muestras selectiva. Por ejemplo: Si se detectan latas anormales en un lote de productos enlatados muestreados al azar el responsable de la toma de muestras debe cambiar inmediatamente su proceder y recoger una muestra selectiva basándose en su hallazgo de latas hinchadas, con derrames u algún otro defecto.
  3. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, éstos se pueden recolectar por filtración a través de una membrana (de 0.2 µmde tamaño de poro) y posterior colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.