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INFORME FINAL PRÁCTICALABORATORIO
CURSO MICROBIOLOGÍA.
ADRIANA MARCELA PEÑA QUINA
AURA PAOLA ANDRADE
CARLOS MARIO VALENCIA VALENCIA
Directora Curso:
SANDRA PATRICIA MONTENEGRO
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
ESCUELADE CIENCIAS AGRARIAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
ESPECIALIZACIÓN EN BIOTECNOLOGÍAAGRARIA
CURSO DE MICROBIOLOGIA
MAYO 2015
1. INTRODUCCIÓN.
El curso de Microbiología de la especialización de Biotecnología Agraria, dictado a los
estudiantes por la UNAD, contempla en su contenido académico, la realización de una
práctica de laboratorio, como medio de reforzar los conocimientos adquiridos durante el
curso.
La práctica del laboratorio se realizó los días 16, 17 y 18 de Mayo del 2.015, en los
laboratorios, de la sede principal de la UNAD José Celestino Mutis, en la ciudad de Bogotá.
El objetivo fundamental de la práctica de laboratorio, es el de dar a conocer y comprender
los procedimientos y técnicas propias para el análisis microbiológico del suelo, a los
estudiantes del curso de microbiología., teniendo como elementos fundamentales el de
adquirir conocimientos y comprensión de las técnicas de recuento microbiano, los métodos y
principios para el manejo de muestras con diluciones, además de la determinación de
microorganismos patógenos del suelo y su importancia.
En el laboratorio se revisaron las temáticas: Análisis microbiológico del suelo, recuentos
microbianos: Recuentos viables (recuento en placa en superficie y Número más probable) y
determinación de microorganismos patógenos del suelo.
Se destaca laboratorio la importancia de la realización de análisis microbiológicos al suelo
ya que nos permiten determinar la carga microbiana de grupos específicos de
microorganismos cultivables con características comunes (recuentos microbianos) así
como el aislamiento y tipificación de sus géneros y especies.
Además de la realización del análisis microbiológico del suelo, es necesario comprender el
metabolismo microbiano y la caracterización de los mismos, ya que de este depende su
correcta identificación y conocimiento de actividad en el suelo, es necesario entonces
conocer sus características morfológicas, fisiológicas, metabólicas, ecológicas y genéticas.
Para llevar a cabo lo propuesto anteriormente, es necesario realizar la identificación los
microorganismos, para lo cual es indispensable, previamente cultivarlo y aislarlo. La
presencia de crecimiento se establece por la aparición de colonias en medio sólido y de
turbidez en medio líquido. Debe tenerse en cuenta la posible identidad del
microorganismo por: el origen de la muestra, características morfotintoriales, patrón de
crecimiento en medios diferenciales, selectivos y para pruebas bioquímicas, y propiedades
hemolíticas, metabólicas y fermentadoras en varios medios ,
2. OBJETIVOS GENERALES
 Conocer y comprender los procedimientos y técnicas propias para el análisis
microbiológico del suelo.
 Conocer y comprender los procedimientos y fundamentación de las pruebas
bioquímicas como herramienta útil en los procesos de tipificación bacteriana.
 Conocer y comprender las características morfológicas y tintoriales de las baterías y
su utilidad en los procesos de tipificación. Adicionalmente conocer la cámara de
Neubauer y su utilidad para la realización de recuentos celulares.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
 Conocer y comprender las técnicas de recuento microbiano.
 Comprender los métodos y principios para el manejo de muestras con diluciones.
 Conocer y comprender las técnicas para determinación de microorganismos
patógenos del suelo y su importancia.
 Conocer y comprender algunos procesos metabólicos bacterianos.
 Comprender los métodos y principios para los procesos de aislamiento y tipificación
bacteriana.
 Establecer la clasificación bacteriana de acuerdo a sus características morfológicas.
 Conocer los procesos adecuados y necesarios para el montaje de extendidos
bacterianos, la técnica y fundamentación de la coloración de Gram y su utilidad.
 Conocer las características de la cámara de Neubauer.
 Conocer y comprender los procesos para la realización de los recuentos celulares
en la cámara de NeuBauer
3. MATERIALES Y METODOLOGÍA.
3.1 PRÁCTICAMICROBIOLOGÍADE SUELOS
Materiales practica 3.1
- Erlenmeyer con 99 ml de agua peptonada estéril
- Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada estéril
- Pipeteadores
- Piperas de 1ml estériles
- Gradillas
- Cajas de petri con agar nutritivo
- Tubos con caldo lactosado bilis verde brillante ytubo de Durham
- Cajas de petri con los medios VRBA, Mackonkey , King B, Agar
cetrimide, YDCA y OF
- Asas de vidrio para expandir la muestra
- Asa bacteriológica
- Balanza
Metodología practica 3.1
Preparación de la muestra Recuentos microbianos Determinación de patógenos del suelo.
 Pesar 1 gr de suelo y
adicionarlo en condiciones
de asepsia a un Erlenmeyer
con 99 m de agua
peptonada estéril.
 Mezclar y dejar en reposo.
(Dilución 10 -2) En una
gradilla organizar una
serie de 12 tubos con
agua peptonada estéril y
previamente marcados
numerando diluciones
sucesivas, tomar 1 ml de la
dilución inicial y
adicionarla al tubo
marcado con la dilución
10-3.
 Después de mezclar y con
distinta pipeta, realizar
sucesivamente y en igual
forma diluciones hasta la
dilución 10-12.
El recuento de bacterias heterótrofas en placa y el recuento de
coliformes por NMP se realizarán en forma sincrónica. Para ello:
 Se organizará el material así: se seleccionarán tres tubos de
diluciones sucesivas que serán nuestras muestras de trabajo.
Para cada dilución se organizarán 2 cajas de agar nutritivo y
tres tubos de caldo lactosado bilis verde brillante. El
material debe ser marcado adecuadamente con el número
de la dilución y grupo correspondiente.
 Siembra: adicionar 0.1 ml de la dilución seleccionada en el
centro de cada una de las 2 cajas correspondientes para esa
dilución, con la misma pipeta, adicionar 1 ml de la misma
dilución a cada uno de los 3 tubos con caldo lactosado
bilis verde brillante correspondientes. Para cada dilución se
realizará el mismo procedimiento.
 Tomar cada caja de agar nutritivo con el asa de vidrio
previa esterilización se realizará la distribución de la muestra
asegurando una distribución homogénea por toda la superficie
del medio.
 Incubar para su lectura en la siguiente práctica de acuerdo al
proceso investigativo realizada para dar el resultado como
UFC de bacterias heterótrofas por gr de suelo.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES
TOTALES:
Después de su incubación, aquellos tubos donde se
observe turbidez y producción de gas serán sembrados en
medio EMB para su posterior lectura después de incubar 24
horas a 37°C. El establecer las muestras positivas por cada
dilución permitirá realizar los cálculos estableciendo en la tabla
existente para ello el NMP y realizar los cálculos de acuerdo a
la fórmula investigada para que se reporte finalmente como
NMP de coliformes totales por gr de suelo.
Para el aislamiento y tipificación de
patógenos se partirá de las últimas diluciones
obtenidas en la preparación de la muestra
inicial. Se utilizarán los siguientes medios:
VRBA, Mackonkey , King B, Agar cetrimide,
YDCA y OF.
Tomar de cada una de las últimas diluciones
y sembrar en una caja de cada uno de los
medios anteriormente anotados.
Incubar durante 24 horas y de acuerdo a la
lectura realizar nuevas siembras así:
Ante sospecha de presencia de
enterobacterias en el medio mackonkey
realizar tipificación con pruebas bioquímicas
y en caso de crecimiento en el medio YDCA
para Xanthomonas, realizar repique en medio
OF.
3.2 METABOLISMO MICROBIANO
Materiales practica 3.2
- Asa bacteriológica
- Medios de cultivo: EMB, Makconkey, SS, TSI, LIA, Simons citrato,
SIM, úrea, MRVP.
- Cepas para cultivo en Agar nutritivo.
- Incubadora
Metodología practica 3.2
 Realice una descripción de los medios de cultivo antes de ser
inoculados.
 Marque los medios de cultivo con el número de cepa y número de su
grupo.
 Realice mediante el método de siembra en rejilla la siembra de los
medios EMB, Mackonkey y SS previa esterilización y enfriamiento
del asa bacteriológica antes y después de cada siembra.
 Siembre el medio de urea y MRVP (líquidos).
 Para los tubos en agar inclinado (LIA, Simons citrato y TSI), siembre
con asa horizontal, inoculando en profundidad y luego con estría en
superficie.
 Recuerde esterilizar el asa antes y después de cada siembra.
 Siembre el medio de sim (semisólido), por punción hasta el fondo
del tubo.
 Lleve a incubación a 37°C por 24 horas para su lectura.
3.3 MORFOLOGÍABACTERIANA
Materiales practica 3.3
Asa bacteriológica
Láminas portaobjeto
Soluciones para la coloración de Gram (violeta de Gram, lugol, alcohol
acetona, fuscina de Gram)
Cultivos bacterianos
Tubos de ensayo
Solución salina
Pipeteadores
Pipetas
Microscopios
Cámaras de Neubauer
Gradillas
Metodología practica 3.3
Características morfológicas de las bacterias Determinación de patógenos del suelo.
Para el desarrollo de la práctica cada grupo tendrá en su
sitio de trabajo los siguientes elementos: asa
bacteriológica, láminas portaobjetos, solución salina,
mechero, 2 cultivos para estudio uno en medio sólido y
uno en medio líquido.
 Marcar las láminas con el número de la muestra que
se utilizará en cada una
 Previa esterilización del asa bacteriológica y después
de su enfriamiento se tomará una muestra del cultivo
líquido. Esta se extenderá en el portaobjetos del
centro a la periferia en forma ovalada y uniforme.
 Esterilizar el asa después del procedimiento.
 Adicionar una gota pequeña de solución salina en el
centro del portaobjeto.
 Tomar con el asa estéril, una pequeña muestra de
colonia bacteriana y extender del centro a la periferia
en forma uniforme.
 Con los frotis secos, fijar mediante calor con ayuda
del mechero.
 Realizar la coloración de Gram para los dos
extendidos.
 Observar al microscopio mediante objetivo de
inmersión.
 Determinar las características morfotintoriales
de cada una de las cepas estudiadas
Realice a partir del cultivo a estudio, diluciones seriadas hasta obtener una dilución 10-
6
Se realizarán los recuentos primero utilizando los cuadrantes externos del retículo y finalmente
el cuadrante central para conocer como se utiliza cada uno en los procedimientos y
como se realizan los cálculos para ello.
 Montaje de la cámara: tome la cámara y fije sobre ella la laminilla. Observe las
dos cuadrículas de la cámara ubicadas entre los surcos en forma de H.
 Con pipeta Pasteur tome una muestra de la dilución a examinar y coloque el
líquido al borde de la laminilla. La muestra se extenderá entre la cámara y la
laminilla por capilaridad. Proceda igualmente para montar la muestra en el lado
contrario de la cámara.
 Observe microscópicamente en pequeño aumento ubicando la cuadrícula, realice un
recorrido sobre la misma identificando los diferentes cuadrantes para realizar el
recuento y cambie a objetivo de 40x.
 Ubíquese en uno de los cuadrantes esquineros con área de 1mm 2 y dividido en 16
cuadros. Realice el recuento de los 16 cuadros en forma organizada y haga lo mismo con
los otros tres cuadrantes de las esquinas.
 Calcule el número de elementos formes de la dilución y de la muestra original.
 De su informe en mm 3 y por ml. Explique los cálculos realizados.
 Cálculos: No de células en mm3
= sumatoria de células en los cuatro cuadrantes/4 X FD X 10
 Recuento en el cuadrante central: se utiliza para células de inferior tamaño como
bacterias, sin embargo facilita el recuento de elementos de un poco mas de tamaño en
forma rápida.
 Recorra el campo microscópico y ubique el cuadrante central revisando su distribución,
número de cuadros y subdivisiones.
 El cuadrante central (1 mm 2 ) está dividido en 25 cuadros cada uno de 0.2mm 2 y
subdividido en 16 cuadros.
 Realice el recuento en cinco de los 25 cuadros así: los cuatro esquineros y el del centro.
 De su informe en mm 3 y por ml. Explique los cálculos realizados.
 Cálculos:No de células/mm 3
= sumatoria de células en los 5 cuadros X 5 X FD X 10
3.4 MORFOFISIOLOGÍAHONGOS Y PARÁSITOS
Materiales practica 3.4
 Cultivos de trabajo
 Cortes histológicos
 Pipetas de Pasteur
 Láminas portaobjeto
 Láminas cubreobjeto
 Lugol parasitológico
 Azul de lactofenol
 Microscopios
Metodología practica 3.4
Práctica 2: características morfológicas de
mohos y levaduras
Práctica 3: características morfológicas de
los parásitos.
Para el desarrollo de esta práctica se contará en
el sitio de trabajo de: mechero, láminas,
laminillas, cultivo de levaduras, microcultivo,
cultivo de mohos en PDA.
OBSERVACIÓN DE LEVADURAS: sobre la
lámina coloque una gota de azul de lactofenol y
transfiera una pequeña cantidad de cultivo de
levadura con ayuda del asa bacteriológica.
Coloque la laminilla y observe al microscopio.
Describa las estructuras.
OBSERVACIÓN DE MOHOS: sobre una lámina
portaobjeto coloque una gota de azul de
lactofenol y con ayuda del asa micológica
transfiera una pequeña porción de la colonia a
examinar. Sobre el preparado coloque la
laminilla y observe al microscopio. Reconozca
las estructuras morfológicas (micelio, hifa,
estructuras de reproducción etc). Mencione y
describa las estructuras observadas y su
importancia en el proceso de diagnóstico para su
identificación.
OBSERVACIÓN DE MOHOS EN
MICROCULTIVO: saque de la caja de petri en la
cual se encuentra el cultivo el preparado.
Coloque la lámina sobre la platina del
microscopio y enfoque observando el centro y
las zonas periféricas (borde del agar), identifique
las diferentes estructuras micóticas y
descríbalas. Mencione las características
observadas útiles en el proceso de clasificación.
Para el desarrollo de la práctica se contará con:
microscopio, gradilla y muestras de análisis,
cortes histológicos.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS
CONCENTRADOS: sobre una lámina
portaobjetos adicione una gota de la muestra a
examinar y coloque el cubreobjetos sobre ella.
Realice un segundo preparado en igual forma
pero adicionando una pequeña gota de lugol
parasitológico.
 Observe al microscopio el preparado primero
en 10X y luego en 40X. De acuerdo a lo
investigado determine la presencia de
huevos de helmintos o formas de
protozoarios. Respáldese con el atlas de
parasitología y el docente.
 Realice la descripción de las formas
encontradas y caracterícela de acuerdo a
sus estructuras específicas.
OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE CORTES
HISTOLÓGICOS: bajo la guía del docente se
realizara el estudio y revisión de cortes
histológicos y preparados coloreados con
diferentes formas parasitarias.
 Realice la descripción de cada uno de los
preparados revisados y las características de
los parásitos relacionados.
4. RESULTADOS
4.1 Práctica microbiología de suelos
Fundamento Caldo lactosado Verde bilis brillante
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la
fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas.
Composición
Fórmula (en gramos por litro)
Bilis de buey deshidratada 20.0
Lactosa 10.0
Peptona 10.0
Verde brillante 0.0133
pH final: 7.2 ± 0.2
Técnica Numero más probable NMP [1]
El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés),
también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos
cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia
positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se
emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible.
El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos
específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de
muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva
puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una
serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el
crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las
muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que
recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios,
mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.
Tabla de NMP 95% por gramo de muestra
Fuente: STANDARD METHODS 9221 B. STANDARD TOTAL COLIFORM
FERMENTATION TECHNIQUE , JUNE 2003
Para el ejercicio académico se trabajó con muestras de suelo del laboratorio de
microbiología JCM la muestra de suelo 1 fue inoculada con entero bacterias para que diesen
positivas las pruebas y pudiésemos comparar resultados.
Se inoculo 1 mL de las concentraciones 10 -5
- 10 -6
- 10 -7
y se hicieron 3 repeticiones de
cada concentración para hallar el NMP. Se llevaron a incubación por 24 horas y se
evaluaron las siguientes características:
- Cambio en la coloración inicial (verde traslucido brillante a turbio) y presencia de
burbuja de más de ¼ del tubo de durham si tiene las dos características se toma
como positiva la prueba y se le asigna el número 1.
- Si es turbio pero no hay burbuja es negativa la prueba se le asigna 0.
- Si tiene burbuja pero esta brillante es negativa la prueba se le asigna 0.
Para el presente informe se presentan los datos de los grupos 1, 2 y 3 en la siguiente tabla.
Tabla de resultados grupo 1,2 y 3
GRUPO 10-5 10-6 10-7
1
Dilución NMP
10 -5 3
10 -6 3
10 -7 3
2
Dilución NMP
10 -5 0
10 -6 0
10 -7 0
3
Dilución NMP
10 -5 0
10 -6 0
10 -7 0
Discusión de los resultados recuentos microbianos.
De acuerdo a la tabla anterior se puede observar que el grupo 1 tiene resultados positivos
para la presencia de coliformes ya que el caldo lactosado verde bilis brillante reacciona con
el grupo coliforme con la fermentación de la lactosa (turbidez) con producción de ácido y
gas (Burbuja).
Analizando la tabla de NMP se busca el número 3-3-3 dado que es positivo en las tres
diluciones y aparece que es > 1100 lo cual es positivo para la presencia de coliformes dado
que la muestra estaba inculada con cepas de E. coli
Lo ideal es esperar 24 horas y hacer siembra en medios selectivos para identificar
características del grupo de estudio. Para esta práctica se trabajó con una bacteria
específica para poder visualizar resultados. Por lo tanto no se desarrolló la práctica de
determinación de patógenos del suelo dado que no se aislaron bacterias de las muestras de
suelo analizadas si no de bacterias ya aisladas para lo cual se hará el análisis en la práctica
de metabolismo bacteriano.
4.2 Metabolismo microbiano – Determinación de patógenos del suelo.
Esta práctica consiste en aislar microrganismos de las diluciones y someterlas a pruebas
bioquímicas para lo cual se evalúa como se comporta determinada bacteria en un sustrato
para esta prueba nuestro grupo trabajo con la bacteria Salmonella enteritidis la cual es un
importante patógeno de las aves de corral y ha sido aislada en pollos parrilleros, aves
reproductoras y parvadas de ponedoras comerciales. La identificación bacteriológica de
aves positivas es difícil debido a la excreción intermitente del organismo. La presencia de
anticuerpos no siempre significa infección, pero es indicativa de exposición previa. Otros
grupos trabajaron con Escherichia coli la cual es una enterobacteria que se encuentra
generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede
encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Por lo tanto es indicador de
contaminación por heces. Tambien se trabajó con Enterobacter aerogenes bacilo Gram-
negativo, anaeróbico facultativo, no esporulante oxidasa negativo, catalasa positivo, citrato
positivo, indol negativo. E. aerogenes es una bacteria patógena causante de infecciones
oportunistas y nosocomiales.
A continuación solo se hara la descripción de los resultados obtenidos con Salmonella
enteritidis.
Medio SIM
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro
de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con
aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la
punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es
importante que la siembra se realice en línea recta.
Incubación
Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Resultados
 Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de
siembra.
 Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
 Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el
medio.
 Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
 Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de
Kovac´s o de Erlich.
 Cepas indol negativas: sin cambio de color.
GRUPO
SIM MUESTRA
INICIAL
RESULTADO RESULTADO
S I M
1 E. coli - + +
2 Salmonella
enteritidis
+ - +
3 E. coli - - -
4 Enterobacter
aerogenesis
- - +
SIM Sulfuro – indol - movilidad
Para la bacteria Salmonella enteritidis se observa que es SH2 positiva por el
ennegrecimiento en todo el medio. Es indol negativa La prueba del indol es una prueba
bioquímica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de
romper el indol del aminoácido triptófano. Esta división molecular es lograda por una serie
de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia
triptofanasa. La movilidad es positiva porque esta relacionada con la prueba SH2.
Características de Enterobacteriaceae
En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional
a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no
cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia:
1. Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros
pleomórficos.
2. No son exigentes, son de fácil cultivo.
3. Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir,
carecen de la enzima citocromo oxidasa.
4. Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
5. Son anaeróbicos facultativos.
6. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la
producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama
de substratos en condiciones aeróbicas.
7. Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos
géneros no son móviles.
Adicional a ello, las enterobacterias no forman esporas, algunas producen toxinas y
pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son
quimioheterótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono
y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa, aunque algunas requieren
aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22 °C y
37 °C.
Medio LIA - Lisina Hierro Agar.
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella
spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido
sulfhídrico.
Siembra
Por punción profunda con aguja de inoculación.
Incubación
En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C.
Resultados
1- Decarboxilación de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminación de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna
cepas de Morganella spp.
3-Producción de ácido sulfhídrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)
Microorganismos Color en el pico de flauta Color en la base del tubo Ennegrecimiento del medio
P roteus mirabilis A T C C 43071 Rojo A marillo Negativo
Salmonella typhimurium ATCC 14028 P úrpura P úrpura P ositivo
Salmonella enteritidis A T C C 13076 P úrpura P úrpura P ositivo
P rovidencia spp. Rojo A marillo Negativo
C itrobacter freundii P úrpura A marillo P ositivo
M organella spp.* Rojo A marillo Negativo
Edwarsiella spp. P úrpura P úrpura P ositivo
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 P úrpura P úrpura Negativo
Escherichia coli A T C C 25922 P úrpura P úrpura Negativo
*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina.
GRUPO LIA
MUESTRA
INICIAL
RESULTADO
1 E.coli -
2 Salmonella enteritidis -
3 E. coli -
4 Enterobacter
aerogenesis
-
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El
citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color
amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y
esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene
lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de
la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24
hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y
el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio
debido a la formación de sulfuro de hierro.
Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan
la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
Teroricamente la prueba para Salmonella enteritidis debe tomar tonalidades descritas en la
tabla pero en laboratorio la prueba es negativa quizá por la temperatura o porque no se
cumplieron las 24 horas completas.
CIT Simmons Citrato Agar
Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato como única fuente de carbono y energía.
Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando
una ansa sin arrastrar el agar.
Incubación
A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.
Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y
no hay cambio de color.
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de
sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo
bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor
enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el
indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial
en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de
carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente
producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa,
a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente,
oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos
orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción
de citrato permeasa.
GRUPO
SIMMONS
CITRATO
CIT
MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E. coli -
2 Salmonella enteritidis +
3 E. coli -
4 Enterobacter aerogenesis +
Salmonella enteritidis es positiva para esta prueba dado que se observó crecimiento y color
azul en el pico, alcalinidad.
TSI Agar-hierro-triple azúcar
Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la
fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la
superficie del medio.
Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta
la glucosa.
2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa,
lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de
azúcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo
produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de
carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de
ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se
combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de
fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a
sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico
sulfuro de hierro de color negro.
GRUPO
TSI MUESTRA INICIAL RESULTADO
G L S GAS H2S
1 E. coli + + + - -
2 Salmonella
enteritidis
+ + - + +
3 E. coli - - - - -
4 Enterobacter
aerogenesis
+ + + + -
G: glucosa; L: lactosa; S: sacarosa
Es positivo para glucosa y lactosa porque hay cambios en la base y el medio del agar y
negativo para sacarosa porque el pico de flauta quedo del color inicial. Se observa una
burbuja de aire en la base lo cual es positivo para gas y el color negro es positivo para la
producción de H2S
Agar OF
Medio de cultivo utilizado en las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana en base al
metabolismo oxidativo-fermentativo de las bacterias Gram negativas, a la movilidad y
producción de gas.
Siembra
Inocular, por cada hidrato de carbono que se use y para cadamicroorganismo en estudio, 2
tubos conteniendo el medio O.F. y el mismo hidrato de carbono. Rotular un tubo con la
inscripción: “Abierto” y otro tubo con la inscripción: “Cerrado” (sellado).
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas del microorganismo en estudio, preparar un
inóculo poco denso y sembrar utilizando aguja de inoculación. Picar hasta aproximadamente
0.6 mm del fondo.
Agregar al tubo “cerrado” (sellado) 1 o 2 ml de vaselina o parafina fundida estéril, para
excluir el oxígeno.
Luego, tapar ambos tubos con las tapas apropiadas.
Incubación
Durante 48 horas, a 35-37 ºC, en aerobiosis.
Algunos microorganismos requieren hasta 4 días, y otros hasta 14 días de incubación.
Resultados
El uso del hidrato de carbono, ya sea por fermentación u oxidación, produce acidez en el
medio, con el consecuente viraje del color verde al amarillo.
a. Microorganismos oxidativos del hidrato de carbono en estudio: producen una
reacción ácida solo en el tubo “abierto”. Presentan poco o nulo desarrollo y ausencia
de producción de ácido en el tubo “cerrado”.
b. Microorganismos fermentadores del hidrato de carbono en estudio: producen una
reacción ácida en ambos tipos de tubos.
c. Microorganismos que no utilizan el hidrato de carbono en estudio: no producen
cambios ninguno de los 2 tubos, los cuales permanecen verdes.
Se debe informar: producción de ácido (A), ácido con gas (AG), alcalino (K) o sin cambio (-).
También, puede informarse si el organismo es móvil, cuando crece lejos de la línea de
inoculación.
GRUPO OF
MUESTRA
INICIAL
RESULTADO
1. E-coli +
2. Salmonella enteritidis +
3. E. coli -
4. Enterobacter aerogenesis +
El medio basal O.F., fue desarrollado por Hugh y Leifson, para evidenciar la importancia del
significado taxonómico del metabolismo oxidativo-fermentativo de los hidratos de carbono
por las bacterias Gram negativas.
Cuando un microorganismo es inoculado en 2 tubos del medio O.F. conteniendo el mismo
hidrato de carbono, y uno de los 2 tubos es sellado con vaselina o parafina antes de la
incubación, se puede diferenciar bien el metabolismo oxidativo o fermentativo, así como la
no utilización de un hidrato de carbono por la bacteria en estudio.
En el medio de cultivo, el agregado de una alta concentración de un determinado hidrato de
carbono, hace que los microorganismos utilicen para su desarrollo dicha sustancia, evitando
que bacterias aeróbicas utilicen la tripteína presente con la consecuente producción de
reacción alcalina, la que se neutraliza por la ligera acidez producida por un microoganismo
oxidativo.
El fosfato dipotásico agrega capacidad reguladora, el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH que vira al color amarillo en medio
ácido. El contenido de agar, da la propiedad de ser un medio semisólido, y permite
determinar la movilidad y la distribución de los productos ácidos en el medio de cultivo. La
glucosa es el hidrato de carbono mas frecuente que se agrega al medio basal O.F., pero
también pueden agregarse otros azúcares, como ser, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol o
xilosa, entre otros.
Por oxidación o fermentación de un determinado hidrato de carbono, se acidifica el medio y
el indicador de pH vira del color verde al amarillo.
Agar SS Salmonella Shigella Agar.
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de
Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su
presencia.
Siembra
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de
Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su
presencia.
Incubación
Durante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos Colonias
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Transparentes, centro negro
Shigella flexneri Incoloras
Shigella sonnei Incoloras
Proteus mirabilis ATCC 43071 Transparentes, centro negro
Escherichia coli ATCC 25922 Rosadas a rojas
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas cremosas y mucosas
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Incoloras, de muy escaso crecimiento
GRUPO SS MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E. coli +
No foto No foto
2 Salmonella enteritidis
-
3 E. coli
-
4 Enterobacter aerogenesis -
La prueba dio negativa para Salmonella enteritidis aunque teóricamente se reporta como
positiva quizá porque no se llevó a cabo la incubación en aerobiosis.
Prueba de UREA.
Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureásica.
Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Siembra
Sembrar un inóculo denso a partir de un cultivo puro de 24 horas.
Incubación
A 35-37 ºC, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12,24 y 48 horas de incubación.
Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas.
Resultados
Microorganismo Actividad ureásica Color del medio
Proteus mirabilis ATCC 43071 Positiva Rojo-rosado
Escherichia coli ATCC 25922 Negativa Amarillo
S. flexneri ATCC 12022 Negativa Amarillo
S. typhimurium ATCC 14028 Negativa Amarillo
GRUPO UREA
MUESTRA
INICIAL
RESULTADO
1 E. coli -
2 Salmonella
enteritidis
-
3 E. coli -
4 Enterobacter
aerogenesis
-
La prueba dio negativa para urea al parecer porque las bacterias de estudio son
descomponedoras de urea pero lentas ya que teóricamente se recomienda visualizar a las
72 horas y solo se revisó a las 24 horas. Aunque comparado con la muestra inicial se
observan cambios en la coloración como turbiedad y otras que se tornan rosadas.
MR-VP Medio
Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer.
Es particularmente útil para la clasificación de enterobacterias.
Siembra
Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubación
En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.
Resultados
a-Prueba del rojo de metilo:
Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio.
b-Prueba del Voges Proskauer:
Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio
al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente
durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.
1-Prueba del rojo de metilo:
Positivo: color rojo.
Negativo: color amarillo.
2-Prueba de Voges Proskauer:
Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación
del tubo.
Negativo: ausencia de color rojo.
Microorganismo Crecimiento RM VP
E. coli A TCC 25922 Bueno + -
K. pneumoniae A TCC 700603 Bueno - +
P . mirabilis ATCC 43071 Bueno + -
S. typhimurium A TCC 14028 Bueno + -
C itrobacter freundii Bueno + -
Enterobacter aerogenes Bueno - +
GRUPO MRVP MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E-coli -
2 Salmonella enteritidis +
3 E. coli +
4 Enterobacter aerogenesis -
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.
La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías
metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico,
ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un
indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición
de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales
neutros.
Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar
hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta
coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la
peptona del medio para dar un color rojo.
Esta prueba no se pudo caracterizar porque no reacciono con las pruebas de rojo de metilo
Prueba Agar cetrimide
Medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras
especies del género. Su fórmula cumple con los requerimientos de la Armonización de
Farmacopeas Europea, Japonesa y de los Estados Unidos de Norteamérica (EP, JP y USP
respectivamente).
Siembra
En superficie, por inoculación directa de la muestra estriando o a partir de un caldo de
enriquecimiento
Incubación
En aerobiosis, a 35-37 °C durante 24-48 horas.
Resultados
Observar el crecimiento microbiano, las características de las colonias y la producción de
pigmentos. La presencia de un color verde-azulado corresponde a producción de piocianina,
mientras que un color verde corresponde a la producción de pioverdina y un color rosa claro,
rojizo o marrón oscuro corresponde a la producción de piorrubina. Examinar las placas bajo
luz ultravioneta, ya que la producción de fluoresceína se observa de color amarillo verdoso
brillante que difunde en el agar a partir del crecimiento microbiano.
GRUPO AC MUESTRA INICIAL RESULTADO
10 -5 -
10 -5 -
10 -5 -
10 -5 -
Para esta prueba se sembró de la dilución 10-5 del suelo y dio negativo por lo cual se
describe la ausencia de Pseudomonas aeruginosa.
Pseudomonas agar F. King B
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de
Pseudomonas spp. en base a la producción de fluoresceína. Conocido también como medio
King B.
Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de
Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio.
Incubación
Durante 18-24 horas a 35-37 ºC, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a
25-30 ºC, o dejar a 22 ºC y observar diariamente hasta 7 días.
Resultados
Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm.
Se considera un resultado positivo la observación de fluoresceína, que es un pigmento de
color amarillo, amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo
el medio de cultivo debido a fenómenos de difusión.
GRUPO
KING-
B
RESULTADO GRUPO 3 RESULTADO GRUPO 2
1 E.coli -
2 Salmonella
enteritidis
+
3 E. coli +
4
Enterobacter
aerogenesis
-
En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la
concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de
piocianina y piorrubina.
YDCA
indican los componentes del medio: Yeast (levadura), ‘calcium carbonate’ (carbonato de
calcio), dextrosa y agar.
Resultados
GRUPO VDCA MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E-coli -
2 Salmonella
enteritidis
-
3 E. coli -
4 Enterobacter
aerogenesis
-
Negativo no se encontró en las bases de datos consultadas especificaciones de este medio
de cultivo.
Agar EMB
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de
bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubación
De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un
mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos
Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o
sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y
azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo
metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o
rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento
de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el
desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como
colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias
oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas
no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de
azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo
de especies de Salmonella y Shigella.
GRUPO EMB MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E-coli -
2 Salmonella
enteritidis
-
3 E. coli -
4 Enterobacter
aerogenesis
-
Agar ENDO
Desarrollado para el recuento de coliformes totales en agua, bebidas y otras muestras por
medio de la técnica de filtración por membrana.
Siembra
Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación
de la muestra.
- Embeber la almohadilla con el caldo m-Endo hasta la saturación (la cantidad de medio de
cultivo depende del grado de absorción de la misma).
- Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo.
Incubación
Incubar las placas a 35-37 °C por 24 horas. Ocasionalmente, los microorganismos no
coliformes pueden producir brillo metálico. Para confirmar las colonias sospechosas,
transferirlas a tubos con caldo verde brillante y bilis al 2%, con campanitas de Durham.
Incubar los tubos por 24-48 horas a 35-37 °C. Los coliformes habrán producido gas por
fermentación de la lactosa, al cabo de ese período.
Resultados
El recuento debe realizarse en aquellas placas que contengan entre 20 y 80 colonias y no
más de 200, ya que se trata de un medio selectivo.
La concentración microbiana debe expresarse como el número de microorganismos
presentes en 100 ml de muestra.
Grupo
ENDO
10 E-5
ENDO
Bacteria
Conocida
ENDO 10-5 ENDO BACTERIA
CONOCIDA
1 E-coli
+ -
2 Salmonella
enteritidis - -
3 E. coli
- -
4
Enterobacter
aerogenesis
- -
4.3 Morfología Bacteriana Resultados
MICROORGANISMO IMAGEN DESCRIPCION
Enterobacter
aerogenesis
Bacteria que pertenece al
género Enterobacter, de la
familia de las
Enterobacteriaceae. Es un
bacilo Gram-negativo,
anaeróbico facultativo, no
esporulante oxidasa negativo,
catalasa positivo, citrato
positivo, indol negativo.
Muestra de suelo
Basilos gram +, Cocos gram -
Resultados Cámara De Neubauer
Instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de esporas y células
en un medio líquido, cámara de recuento está adaptada al microscopio de campo claro o al
de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente
deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de
dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple
tensión superficial (en especial una vez que se haya añadido la muestra líquida).
Luego se introduce, por capilaridad entre la cámara y el cubre, el líquido con las células a
contar, generalmente tras una dilución previa; puesto que la cámara tiene dos zonas esto
permite hacer dos recuentos simultáneamente. Se observa la retícula al microscopio con el
aumento adecuado y se cuentan las células.
A partir del número de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el
campo de la retícula, se calcula la concentración de células en la muestra líquida aplicada.1
El cálculo de la concentración de células se puede expresar así:
Partículas / μl = (partículas contadas) / [ (superficie contada (mm²)∙profundidad de la
cámara(mm) ] ∙ dilución
Reticulo Neubauer.jpg
En la retícula central, la cámara de Neubauer tiene un cuadrado primario que contiene
nueve cuadrados secundarios, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados
terciarios. El cuadrado secundario central contiene no 16, sino 25 cuadrados, cada uno de
ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central
se cuentan los hematíes, utilizando sólo los cuadrados de los bordes del terciario central y
uno de los centrales. En los secundarios de los
bordes superiores e inferiores de la cámara se hace
el recuento leucocitario.
Grupo 1
Cuadrícula 1
26 2 6 5
5 10 7 9
-- - - -
9 15 18 52
Ʃ 40 27 31 66
Total 164
Cuadrícula 2
4 - - 9
- - - -
- - - -
9 15 18 52
Ʃ 16 18 28 6
Total 81
Cuadrícula 3
1 15 4 3
1 - 9 -
1 1 11 9
- 5 4 1
Ʃ 3 21 28 4
Total 56
Cuadrícula 4
18 13 10 16
6 10 7 4
5 9 26 10
2 2 4 3
Ʃ 31 34 47 34
Total 141
Ʃ= 164+81+56+141= 442
Promedio= 110,5
UFC/gr= 110,5*6*10= 6.630
Grupo 2
Cuadrícula 1
35 39 35 53
40 29 41 41
37 42 28 31
33 25 40 31
Ʃ
Total 580
Cuadrícula 2
39 29 42 38
33 32 33 44
28 25 31 30
27 41 42 28
Ʃ
Total 537
Cuadrícula 3
25 37 35 33
32 27 25 25
30 30 38 29
34 32 30 30
Ʃ
Total 492
Cuadrícula 4
35 36 37 29
34 81 29 30
29 30 35 31
32 34 28 -
Ʃ
Total 513
Ʃ= 580+537+492+513= 2.122
Promedio= 530.5
UFC/gr= 530.5*6*10= 31.830
4.4 Resultados de observación de hongos
Todos los hongos son organismos eucariotes y poseen al menos nucleo y membrana
nuclear, retículo endoplásmico, mitocondrias y aparato secretor. Los hongos crecen en dos
formas básicos: levaduras y mohos. Los mohos son hongos filamentosos multicelulares
cuya forma y estructura tenida en cuenta a partir de sus características macro y
microscópicas permiten su clasificación. Macroscopicamente se tendrán en cuenta las
características de las colonias en los medios de cultivo. Microscopicamente lo será la
existencia y características de sus estructuras.
MICROORGANISM
O
IMAGEN DESCRIPCION
Hongo sp1
Al tomar muestras de
hongos filamentosos para
observarlos al microscopio,
frecuentemente se
fragmenta el micelio. Sobre
todo en el estudio de los
dermatofitos, este
inconveniente se obvia
obteniendo un microcultivo.
El hongo crece sobre un
cubreobjetos que luego se
coloca sobre un
portaobjetos al que
añadimos un
transparentador con
colorante ( Lactofenol). De
este modo se observan las
hifas intactas facilitando su
correcta identificación.
Hongo sp2
Hongo sp3 Los conidióforos generan
esporas solitarias o en
cadena. A veces están
agrupados en un haz
(coremio) o sobre un
conjunto de hifas
entrelazadas (acérvula,
esporodoquio) o dentro de
un conidioma (picnidio).
Hongo sp4 HIFA es la unidad
vegetativa en la estructura
de los hongos.
Su forma es filamentosa y
de tipo tubular con paredes
celulares, pudiendo
presentar tabiques (hifas
septadas) o no (hifas
aseptadas) y que contienen
en su interior citoplasma
que viene a ser una
sustancia similar a la clara
de huevo junto con
pequeñas estructuras con
morfologías y funciones
determinadas denominadas
organoides.
CONCLUSIONES
Esta práctica permite un acercamiento a las técnicas bioquímicas para la identificación de
microorganismos de diferentes grupos aunque en la actualidad pruebas de ADN ribosomal
permiten acercarse mas a la identificación taxonómica de los microorganismos de interés.
Las pruebas bioquímicas sirven para hacer identificación de familias sin embargo la
identificación hasta especie es muy compleja.
La tinción de gram permite conocer características de la pared celular de los individuos de
estudio y clasificar en grandes grupos de acuerdo a la taxonomía de bergeys.
La actividad permite el acercamiento del estudiante de formación virtual al manejo de
herramientas tecnológicas para conocer los métodos y técnicas empleados en la actualidad.
La cámara de neubauer se usa para hallar densidad poblacional pero deben hacerse varia
repeticiones para sacar promedios ya que se observaron diferencias significativas en el
ejercicio que se hizo.
El video sobre la vida en el suelo es un objeto de aprendizaje que permite acercarnos al
universo microbiano y la relevacia para todos los ciclos biogeoquímicos.
El uso de organosclorados tiene efecto sobre la diversidad microbiana como estudiantes de
la especialización debemos enfocarnos en las buenas practicas sobre el uso del suelo ya
que es un sistema dinamico.
Se ha podido apreciar la importancia de la actividad de los microorganismos en los
diferentes aspectos que denotan la fertilidad de un suelo y la sostenibilidad de ecosistemas
y agroecosistemas. El manejo de diversas prácticas culturales (establecimiento de
leguminosas en rotación de cultivos, abonos verdes, aplicación de materia orgánica) permite
que los sistemas agrícolas requieran menos aplicaciones externas de energía; con ello se
favorece la conservación del recurso suelo en una condición por demás favorable. Por otra
parte, estas prácticas permiten que la actividad microbiana sea favorecida y que se tenga
mayor diversidad de microorganismos, de tal forma que se establezcan diversas relaciones
tróficas que contribuyan a la sanidad y fertilidad de los suelos manipulados en esta forma.
El conocimiento de la actividad fisiológica de los microorganismos del suelo ha permitido
seleccionar aquellos con potencial de uso en la agricultura. De esta manera, el hombre ha
utilizado bacterias y hongos que propician mejor crecimiento y desarrollo de las plantas en
los agroecosistemas donde se aplican. Con ello, y de acuerdo con un adecuado manejo de
los sistemas, es posible incrementar la actividad microbiana del suelo, propiciando así el
fortalecimiento de la sostenibilidad de los ecosistemas y agroecosistemas. Sin embargo, el
uso de ciertos microorganismos debe contemplar algunos aspectos que permitan definir su
potencial benéfico e incluso la factibilidad de utilizarlos, ya que algunos de ellos no son
susceptibles de ser aplicados directamente en cultivos básicos (frijol o maíz), como es el
caso de los hongos micorrízicos arbusculares, por ejemplo.
BIBLIOGRAFÍA.
AHMED E. Microbiología de los alimentos. Manual de laboratorio. Editorial Acribia, España.
2006.
BARTHA R, ATLAS R. Ecología microbiana y microbiogía ambiental. Cuarta edición.
Prentice Hall. 2001.
Cerrato, R. F., & Alarcón, A. (2002). La microbiología del suelo en la agricultura sostenible.
Universidad Autónoma del Estado de México, Programa Editorial Universitario.
KONEMAN Diagnóstico microbiológico. Sexta edición. Editorial Panamericana. 2008.
MARK C. Microbiología del suelo. Un enfoque exploratorio. Editorial Cengage learning,
Argentina. 2000.
PARKER J, MARTINKO J, MADIGAN M. Brock biología de los microorganismos. Décima
edición. Prentice Hall. 2003.
WILLEY J, SHERWOOD L, WOOLVERTON CH. Microbiologia de Prescott, Harley y Klein.
Séptima edición. Editorial Macgraw Hill, Madrid España. 2009.

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Informe final práctica microbiología v2.0

  • 1. INFORME FINAL PRÁCTICALABORATORIO CURSO MICROBIOLOGÍA. ADRIANA MARCELA PEÑA QUINA AURA PAOLA ANDRADE CARLOS MARIO VALENCIA VALENCIA Directora Curso: SANDRA PATRICIA MONTENEGRO UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELADE CIENCIAS AGRARIAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE ESPECIALIZACIÓN EN BIOTECNOLOGÍAAGRARIA CURSO DE MICROBIOLOGIA MAYO 2015
  • 2. 1. INTRODUCCIÓN. El curso de Microbiología de la especialización de Biotecnología Agraria, dictado a los estudiantes por la UNAD, contempla en su contenido académico, la realización de una práctica de laboratorio, como medio de reforzar los conocimientos adquiridos durante el curso. La práctica del laboratorio se realizó los días 16, 17 y 18 de Mayo del 2.015, en los laboratorios, de la sede principal de la UNAD José Celestino Mutis, en la ciudad de Bogotá. El objetivo fundamental de la práctica de laboratorio, es el de dar a conocer y comprender los procedimientos y técnicas propias para el análisis microbiológico del suelo, a los estudiantes del curso de microbiología., teniendo como elementos fundamentales el de adquirir conocimientos y comprensión de las técnicas de recuento microbiano, los métodos y principios para el manejo de muestras con diluciones, además de la determinación de microorganismos patógenos del suelo y su importancia. En el laboratorio se revisaron las temáticas: Análisis microbiológico del suelo, recuentos microbianos: Recuentos viables (recuento en placa en superficie y Número más probable) y determinación de microorganismos patógenos del suelo. Se destaca laboratorio la importancia de la realización de análisis microbiológicos al suelo ya que nos permiten determinar la carga microbiana de grupos específicos de microorganismos cultivables con características comunes (recuentos microbianos) así como el aislamiento y tipificación de sus géneros y especies. Además de la realización del análisis microbiológico del suelo, es necesario comprender el metabolismo microbiano y la caracterización de los mismos, ya que de este depende su correcta identificación y conocimiento de actividad en el suelo, es necesario entonces conocer sus características morfológicas, fisiológicas, metabólicas, ecológicas y genéticas. Para llevar a cabo lo propuesto anteriormente, es necesario realizar la identificación los microorganismos, para lo cual es indispensable, previamente cultivarlo y aislarlo. La presencia de crecimiento se establece por la aparición de colonias en medio sólido y de turbidez en medio líquido. Debe tenerse en cuenta la posible identidad del microorganismo por: el origen de la muestra, características morfotintoriales, patrón de crecimiento en medios diferenciales, selectivos y para pruebas bioquímicas, y propiedades hemolíticas, metabólicas y fermentadoras en varios medios ,
  • 3. 2. OBJETIVOS GENERALES  Conocer y comprender los procedimientos y técnicas propias para el análisis microbiológico del suelo.  Conocer y comprender los procedimientos y fundamentación de las pruebas bioquímicas como herramienta útil en los procesos de tipificación bacteriana.  Conocer y comprender las características morfológicas y tintoriales de las baterías y su utilidad en los procesos de tipificación. Adicionalmente conocer la cámara de Neubauer y su utilidad para la realización de recuentos celulares. 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.  Conocer y comprender las técnicas de recuento microbiano.  Comprender los métodos y principios para el manejo de muestras con diluciones.  Conocer y comprender las técnicas para determinación de microorganismos patógenos del suelo y su importancia.  Conocer y comprender algunos procesos metabólicos bacterianos.  Comprender los métodos y principios para los procesos de aislamiento y tipificación bacteriana.  Establecer la clasificación bacteriana de acuerdo a sus características morfológicas.  Conocer los procesos adecuados y necesarios para el montaje de extendidos bacterianos, la técnica y fundamentación de la coloración de Gram y su utilidad.  Conocer las características de la cámara de Neubauer.  Conocer y comprender los procesos para la realización de los recuentos celulares en la cámara de NeuBauer 3. MATERIALES Y METODOLOGÍA. 3.1 PRÁCTICAMICROBIOLOGÍADE SUELOS Materiales practica 3.1 - Erlenmeyer con 99 ml de agua peptonada estéril - Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada estéril - Pipeteadores - Piperas de 1ml estériles - Gradillas - Cajas de petri con agar nutritivo - Tubos con caldo lactosado bilis verde brillante ytubo de Durham - Cajas de petri con los medios VRBA, Mackonkey , King B, Agar cetrimide, YDCA y OF - Asas de vidrio para expandir la muestra - Asa bacteriológica - Balanza
  • 4. Metodología practica 3.1 Preparación de la muestra Recuentos microbianos Determinación de patógenos del suelo.  Pesar 1 gr de suelo y adicionarlo en condiciones de asepsia a un Erlenmeyer con 99 m de agua peptonada estéril.  Mezclar y dejar en reposo. (Dilución 10 -2) En una gradilla organizar una serie de 12 tubos con agua peptonada estéril y previamente marcados numerando diluciones sucesivas, tomar 1 ml de la dilución inicial y adicionarla al tubo marcado con la dilución 10-3.  Después de mezclar y con distinta pipeta, realizar sucesivamente y en igual forma diluciones hasta la dilución 10-12. El recuento de bacterias heterótrofas en placa y el recuento de coliformes por NMP se realizarán en forma sincrónica. Para ello:  Se organizará el material así: se seleccionarán tres tubos de diluciones sucesivas que serán nuestras muestras de trabajo. Para cada dilución se organizarán 2 cajas de agar nutritivo y tres tubos de caldo lactosado bilis verde brillante. El material debe ser marcado adecuadamente con el número de la dilución y grupo correspondiente.  Siembra: adicionar 0.1 ml de la dilución seleccionada en el centro de cada una de las 2 cajas correspondientes para esa dilución, con la misma pipeta, adicionar 1 ml de la misma dilución a cada uno de los 3 tubos con caldo lactosado bilis verde brillante correspondientes. Para cada dilución se realizará el mismo procedimiento.  Tomar cada caja de agar nutritivo con el asa de vidrio previa esterilización se realizará la distribución de la muestra asegurando una distribución homogénea por toda la superficie del medio.  Incubar para su lectura en la siguiente práctica de acuerdo al proceso investigativo realizada para dar el resultado como UFC de bacterias heterótrofas por gr de suelo. PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES: Después de su incubación, aquellos tubos donde se observe turbidez y producción de gas serán sembrados en medio EMB para su posterior lectura después de incubar 24 horas a 37°C. El establecer las muestras positivas por cada dilución permitirá realizar los cálculos estableciendo en la tabla existente para ello el NMP y realizar los cálculos de acuerdo a la fórmula investigada para que se reporte finalmente como NMP de coliformes totales por gr de suelo. Para el aislamiento y tipificación de patógenos se partirá de las últimas diluciones obtenidas en la preparación de la muestra inicial. Se utilizarán los siguientes medios: VRBA, Mackonkey , King B, Agar cetrimide, YDCA y OF. Tomar de cada una de las últimas diluciones y sembrar en una caja de cada uno de los medios anteriormente anotados. Incubar durante 24 horas y de acuerdo a la lectura realizar nuevas siembras así: Ante sospecha de presencia de enterobacterias en el medio mackonkey realizar tipificación con pruebas bioquímicas y en caso de crecimiento en el medio YDCA para Xanthomonas, realizar repique en medio OF.
  • 5. 3.2 METABOLISMO MICROBIANO Materiales practica 3.2 - Asa bacteriológica - Medios de cultivo: EMB, Makconkey, SS, TSI, LIA, Simons citrato, SIM, úrea, MRVP. - Cepas para cultivo en Agar nutritivo. - Incubadora Metodología practica 3.2  Realice una descripción de los medios de cultivo antes de ser inoculados.  Marque los medios de cultivo con el número de cepa y número de su grupo.  Realice mediante el método de siembra en rejilla la siembra de los medios EMB, Mackonkey y SS previa esterilización y enfriamiento del asa bacteriológica antes y después de cada siembra.  Siembre el medio de urea y MRVP (líquidos).  Para los tubos en agar inclinado (LIA, Simons citrato y TSI), siembre con asa horizontal, inoculando en profundidad y luego con estría en superficie.  Recuerde esterilizar el asa antes y después de cada siembra.  Siembre el medio de sim (semisólido), por punción hasta el fondo del tubo.  Lleve a incubación a 37°C por 24 horas para su lectura. 3.3 MORFOLOGÍABACTERIANA Materiales practica 3.3 Asa bacteriológica Láminas portaobjeto Soluciones para la coloración de Gram (violeta de Gram, lugol, alcohol acetona, fuscina de Gram) Cultivos bacterianos Tubos de ensayo Solución salina Pipeteadores Pipetas Microscopios Cámaras de Neubauer Gradillas
  • 6. Metodología practica 3.3 Características morfológicas de las bacterias Determinación de patógenos del suelo. Para el desarrollo de la práctica cada grupo tendrá en su sitio de trabajo los siguientes elementos: asa bacteriológica, láminas portaobjetos, solución salina, mechero, 2 cultivos para estudio uno en medio sólido y uno en medio líquido.  Marcar las láminas con el número de la muestra que se utilizará en cada una  Previa esterilización del asa bacteriológica y después de su enfriamiento se tomará una muestra del cultivo líquido. Esta se extenderá en el portaobjetos del centro a la periferia en forma ovalada y uniforme.  Esterilizar el asa después del procedimiento.  Adicionar una gota pequeña de solución salina en el centro del portaobjeto.  Tomar con el asa estéril, una pequeña muestra de colonia bacteriana y extender del centro a la periferia en forma uniforme.  Con los frotis secos, fijar mediante calor con ayuda del mechero.  Realizar la coloración de Gram para los dos extendidos.  Observar al microscopio mediante objetivo de inmersión.  Determinar las características morfotintoriales de cada una de las cepas estudiadas Realice a partir del cultivo a estudio, diluciones seriadas hasta obtener una dilución 10- 6 Se realizarán los recuentos primero utilizando los cuadrantes externos del retículo y finalmente el cuadrante central para conocer como se utiliza cada uno en los procedimientos y como se realizan los cálculos para ello.  Montaje de la cámara: tome la cámara y fije sobre ella la laminilla. Observe las dos cuadrículas de la cámara ubicadas entre los surcos en forma de H.  Con pipeta Pasteur tome una muestra de la dilución a examinar y coloque el líquido al borde de la laminilla. La muestra se extenderá entre la cámara y la laminilla por capilaridad. Proceda igualmente para montar la muestra en el lado contrario de la cámara.  Observe microscópicamente en pequeño aumento ubicando la cuadrícula, realice un recorrido sobre la misma identificando los diferentes cuadrantes para realizar el recuento y cambie a objetivo de 40x.  Ubíquese en uno de los cuadrantes esquineros con área de 1mm 2 y dividido en 16 cuadros. Realice el recuento de los 16 cuadros en forma organizada y haga lo mismo con los otros tres cuadrantes de las esquinas.  Calcule el número de elementos formes de la dilución y de la muestra original.  De su informe en mm 3 y por ml. Explique los cálculos realizados.  Cálculos: No de células en mm3 = sumatoria de células en los cuatro cuadrantes/4 X FD X 10  Recuento en el cuadrante central: se utiliza para células de inferior tamaño como bacterias, sin embargo facilita el recuento de elementos de un poco mas de tamaño en forma rápida.  Recorra el campo microscópico y ubique el cuadrante central revisando su distribución, número de cuadros y subdivisiones.  El cuadrante central (1 mm 2 ) está dividido en 25 cuadros cada uno de 0.2mm 2 y subdividido en 16 cuadros.  Realice el recuento en cinco de los 25 cuadros así: los cuatro esquineros y el del centro.  De su informe en mm 3 y por ml. Explique los cálculos realizados.  Cálculos:No de células/mm 3 = sumatoria de células en los 5 cuadros X 5 X FD X 10
  • 7. 3.4 MORFOFISIOLOGÍAHONGOS Y PARÁSITOS Materiales practica 3.4  Cultivos de trabajo  Cortes histológicos  Pipetas de Pasteur  Láminas portaobjeto  Láminas cubreobjeto  Lugol parasitológico  Azul de lactofenol  Microscopios Metodología practica 3.4 Práctica 2: características morfológicas de mohos y levaduras Práctica 3: características morfológicas de los parásitos. Para el desarrollo de esta práctica se contará en el sitio de trabajo de: mechero, láminas, laminillas, cultivo de levaduras, microcultivo, cultivo de mohos en PDA. OBSERVACIÓN DE LEVADURAS: sobre la lámina coloque una gota de azul de lactofenol y transfiera una pequeña cantidad de cultivo de levadura con ayuda del asa bacteriológica. Coloque la laminilla y observe al microscopio. Describa las estructuras. OBSERVACIÓN DE MOHOS: sobre una lámina portaobjeto coloque una gota de azul de lactofenol y con ayuda del asa micológica transfiera una pequeña porción de la colonia a examinar. Sobre el preparado coloque la laminilla y observe al microscopio. Reconozca las estructuras morfológicas (micelio, hifa, estructuras de reproducción etc). Mencione y describa las estructuras observadas y su importancia en el proceso de diagnóstico para su identificación. OBSERVACIÓN DE MOHOS EN MICROCULTIVO: saque de la caja de petri en la cual se encuentra el cultivo el preparado. Coloque la lámina sobre la platina del microscopio y enfoque observando el centro y las zonas periféricas (borde del agar), identifique las diferentes estructuras micóticas y descríbalas. Mencione las características observadas útiles en el proceso de clasificación. Para el desarrollo de la práctica se contará con: microscopio, gradilla y muestras de análisis, cortes histológicos. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS CONCENTRADOS: sobre una lámina portaobjetos adicione una gota de la muestra a examinar y coloque el cubreobjetos sobre ella. Realice un segundo preparado en igual forma pero adicionando una pequeña gota de lugol parasitológico.  Observe al microscopio el preparado primero en 10X y luego en 40X. De acuerdo a lo investigado determine la presencia de huevos de helmintos o formas de protozoarios. Respáldese con el atlas de parasitología y el docente.  Realice la descripción de las formas encontradas y caracterícela de acuerdo a sus estructuras específicas. OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE CORTES HISTOLÓGICOS: bajo la guía del docente se realizara el estudio y revisión de cortes histológicos y preparados coloreados con diferentes formas parasitarias.  Realice la descripción de cada uno de los preparados revisados y las características de los parásitos relacionados.
  • 8. 4. RESULTADOS 4.1 Práctica microbiología de suelos Fundamento Caldo lactosado Verde bilis brillante En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas. Composición Fórmula (en gramos por litro) Bilis de buey deshidratada 20.0 Lactosa 10.0 Peptona 10.0 Verde brillante 0.0133 pH final: 7.2 ± 0.2 Técnica Numero más probable NMP [1] El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés), también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible. El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. Tabla de NMP 95% por gramo de muestra
  • 9. Fuente: STANDARD METHODS 9221 B. STANDARD TOTAL COLIFORM FERMENTATION TECHNIQUE , JUNE 2003 Para el ejercicio académico se trabajó con muestras de suelo del laboratorio de microbiología JCM la muestra de suelo 1 fue inoculada con entero bacterias para que diesen positivas las pruebas y pudiésemos comparar resultados. Se inoculo 1 mL de las concentraciones 10 -5 - 10 -6 - 10 -7 y se hicieron 3 repeticiones de cada concentración para hallar el NMP. Se llevaron a incubación por 24 horas y se evaluaron las siguientes características: - Cambio en la coloración inicial (verde traslucido brillante a turbio) y presencia de burbuja de más de ¼ del tubo de durham si tiene las dos características se toma como positiva la prueba y se le asigna el número 1. - Si es turbio pero no hay burbuja es negativa la prueba se le asigna 0. - Si tiene burbuja pero esta brillante es negativa la prueba se le asigna 0. Para el presente informe se presentan los datos de los grupos 1, 2 y 3 en la siguiente tabla. Tabla de resultados grupo 1,2 y 3 GRUPO 10-5 10-6 10-7 1 Dilución NMP 10 -5 3 10 -6 3 10 -7 3
  • 10. 2 Dilución NMP 10 -5 0 10 -6 0 10 -7 0 3 Dilución NMP 10 -5 0 10 -6 0 10 -7 0 Discusión de los resultados recuentos microbianos. De acuerdo a la tabla anterior se puede observar que el grupo 1 tiene resultados positivos para la presencia de coliformes ya que el caldo lactosado verde bilis brillante reacciona con el grupo coliforme con la fermentación de la lactosa (turbidez) con producción de ácido y gas (Burbuja). Analizando la tabla de NMP se busca el número 3-3-3 dado que es positivo en las tres diluciones y aparece que es > 1100 lo cual es positivo para la presencia de coliformes dado que la muestra estaba inculada con cepas de E. coli Lo ideal es esperar 24 horas y hacer siembra en medios selectivos para identificar características del grupo de estudio. Para esta práctica se trabajó con una bacteria específica para poder visualizar resultados. Por lo tanto no se desarrolló la práctica de determinación de patógenos del suelo dado que no se aislaron bacterias de las muestras de suelo analizadas si no de bacterias ya aisladas para lo cual se hará el análisis en la práctica de metabolismo bacteriano. 4.2 Metabolismo microbiano – Determinación de patógenos del suelo. Esta práctica consiste en aislar microrganismos de las diluciones y someterlas a pruebas bioquímicas para lo cual se evalúa como se comporta determinada bacteria en un sustrato para esta prueba nuestro grupo trabajo con la bacteria Salmonella enteritidis la cual es un importante patógeno de las aves de corral y ha sido aislada en pollos parrilleros, aves reproductoras y parvadas de ponedoras comerciales. La identificación bacteriológica de aves positivas es difícil debido a la excreción intermitente del organismo. La presencia de anticuerpos no siempre significa infección, pero es indicativa de exposición previa. Otros
  • 11. grupos trabajaron con Escherichia coli la cual es una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Por lo tanto es indicador de contaminación por heces. Tambien se trabajó con Enterobacter aerogenes bacilo Gram- negativo, anaeróbico facultativo, no esporulante oxidasa negativo, catalasa positivo, citrato positivo, indol negativo. E. aerogenes es una bacteria patógena causante de infecciones oportunistas y nosocomiales. A continuación solo se hara la descripción de los resultados obtenidos con Salmonella enteritidis. Medio SIM Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Siembra A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta. Incubación Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich. Resultados  Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra.  Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.  Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.  Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.  Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich.  Cepas indol negativas: sin cambio de color. GRUPO SIM MUESTRA INICIAL RESULTADO RESULTADO S I M 1 E. coli - + + 2 Salmonella enteritidis + - + 3 E. coli - - - 4 Enterobacter aerogenesis - - + SIM Sulfuro – indol - movilidad Para la bacteria Salmonella enteritidis se observa que es SH2 positiva por el ennegrecimiento en todo el medio. Es indol negativa La prueba del indol es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano. Esta división molecular es lograda por una serie
  • 12. de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa. La movilidad es positiva porque esta relacionada con la prueba SH2. Características de Enterobacteriaceae En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia: 1. Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos. 2. No son exigentes, son de fácil cultivo. 3. Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa. 4. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. 5. Son anaeróbicos facultativos. 6. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas. 7. Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles. Adicional a ello, las enterobacterias no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa, aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22 °C y 37 °C. Medio LIA - Lisina Hierro Agar. Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico. Siembra Por punción profunda con aguja de inoculación. Incubación En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C. Resultados 1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Producción de ácido sulfhídrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)
  • 13. Microorganismos Color en el pico de flauta Color en la base del tubo Ennegrecimiento del medio P roteus mirabilis A T C C 43071 Rojo A marillo Negativo Salmonella typhimurium ATCC 14028 P úrpura P úrpura P ositivo Salmonella enteritidis A T C C 13076 P úrpura P úrpura P ositivo P rovidencia spp. Rojo A marillo Negativo C itrobacter freundii P úrpura A marillo P ositivo M organella spp.* Rojo A marillo Negativo Edwarsiella spp. P úrpura P úrpura P ositivo Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 P úrpura P úrpura Negativo Escherichia coli A T C C 25922 P úrpura P úrpura Negativo *Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina. GRUPO LIA MUESTRA INICIAL RESULTADO 1 E.coli - 2 Salmonella enteritidis - 3 E. coli - 4 Enterobacter aerogenesis - En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Teroricamente la prueba para Salmonella enteritidis debe tomar tonalidades descritas en la tabla pero en laboratorio la prueba es negativa quizá por la temperatura o porque no se cumplieron las 24 horas completas. CIT Simmons Citrato Agar Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.
  • 14. Incubación A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación. Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa. GRUPO SIMMONS CITRATO CIT MUESTRA INICIAL RESULTADO 1 E. coli - 2 Salmonella enteritidis + 3 E. coli - 4 Enterobacter aerogenesis + Salmonella enteritidis es positiva para esta prueba dado que se observó crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. TSI Agar-hierro-triple azúcar Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubación A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis. Resultados 1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de
  • 15. azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. GRUPO TSI MUESTRA INICIAL RESULTADO G L S GAS H2S 1 E. coli + + + - - 2 Salmonella enteritidis + + - + + 3 E. coli - - - - - 4 Enterobacter aerogenesis + + + + - G: glucosa; L: lactosa; S: sacarosa Es positivo para glucosa y lactosa porque hay cambios en la base y el medio del agar y negativo para sacarosa porque el pico de flauta quedo del color inicial. Se observa una burbuja de aire en la base lo cual es positivo para gas y el color negro es positivo para la producción de H2S Agar OF Medio de cultivo utilizado en las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana en base al metabolismo oxidativo-fermentativo de las bacterias Gram negativas, a la movilidad y producción de gas. Siembra Inocular, por cada hidrato de carbono que se use y para cadamicroorganismo en estudio, 2 tubos conteniendo el medio O.F. y el mismo hidrato de carbono. Rotular un tubo con la inscripción: “Abierto” y otro tubo con la inscripción: “Cerrado” (sellado). A partir de un cultivo puro de 18-24 horas del microorganismo en estudio, preparar un inóculo poco denso y sembrar utilizando aguja de inoculación. Picar hasta aproximadamente 0.6 mm del fondo. Agregar al tubo “cerrado” (sellado) 1 o 2 ml de vaselina o parafina fundida estéril, para excluir el oxígeno.
  • 16. Luego, tapar ambos tubos con las tapas apropiadas. Incubación Durante 48 horas, a 35-37 ºC, en aerobiosis. Algunos microorganismos requieren hasta 4 días, y otros hasta 14 días de incubación. Resultados El uso del hidrato de carbono, ya sea por fermentación u oxidación, produce acidez en el medio, con el consecuente viraje del color verde al amarillo. a. Microorganismos oxidativos del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida solo en el tubo “abierto”. Presentan poco o nulo desarrollo y ausencia de producción de ácido en el tubo “cerrado”. b. Microorganismos fermentadores del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida en ambos tipos de tubos. c. Microorganismos que no utilizan el hidrato de carbono en estudio: no producen cambios ninguno de los 2 tubos, los cuales permanecen verdes. Se debe informar: producción de ácido (A), ácido con gas (AG), alcalino (K) o sin cambio (-). También, puede informarse si el organismo es móvil, cuando crece lejos de la línea de inoculación. GRUPO OF MUESTRA INICIAL RESULTADO 1. E-coli + 2. Salmonella enteritidis + 3. E. coli - 4. Enterobacter aerogenesis + El medio basal O.F., fue desarrollado por Hugh y Leifson, para evidenciar la importancia del significado taxonómico del metabolismo oxidativo-fermentativo de los hidratos de carbono por las bacterias Gram negativas. Cuando un microorganismo es inoculado en 2 tubos del medio O.F. conteniendo el mismo hidrato de carbono, y uno de los 2 tubos es sellado con vaselina o parafina antes de la incubación, se puede diferenciar bien el metabolismo oxidativo o fermentativo, así como la no utilización de un hidrato de carbono por la bacteria en estudio. En el medio de cultivo, el agregado de una alta concentración de un determinado hidrato de carbono, hace que los microorganismos utilicen para su desarrollo dicha sustancia, evitando que bacterias aeróbicas utilicen la tripteína presente con la consecuente producción de reacción alcalina, la que se neutraliza por la ligera acidez producida por un microoganismo oxidativo. El fosfato dipotásico agrega capacidad reguladora, el cloruro de sodio mantiene el balance
  • 17. osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH que vira al color amarillo en medio ácido. El contenido de agar, da la propiedad de ser un medio semisólido, y permite determinar la movilidad y la distribución de los productos ácidos en el medio de cultivo. La glucosa es el hidrato de carbono mas frecuente que se agrega al medio basal O.F., pero también pueden agregarse otros azúcares, como ser, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol o xilosa, entre otros. Por oxidación o fermentación de un determinado hidrato de carbono, se acidifica el medio y el indicador de pH vira del color verde al amarillo. Agar SS Salmonella Shigella Agar. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Siembra Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Incubación Durante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Colonias Salmonella typhimurium ATCC 14028 Transparentes, centro negro Shigella flexneri Incoloras Shigella sonnei Incoloras Proteus mirabilis ATCC 43071 Transparentes, centro negro Escherichia coli ATCC 25922 Rosadas a rojas Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas cremosas y mucosas Enterococcus faecalis ATCC 29212 Incoloras, de muy escaso crecimiento GRUPO SS MUESTRA INICIAL RESULTADO 1 E. coli + No foto No foto 2 Salmonella enteritidis - 3 E. coli - 4 Enterobacter aerogenesis - La prueba dio negativa para Salmonella enteritidis aunque teóricamente se reporta como positiva quizá porque no se llevó a cabo la incubación en aerobiosis. Prueba de UREA. Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Siembra Sembrar un inóculo denso a partir de un cultivo puro de 24 horas. Incubación A 35-37 ºC, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12,24 y 48 horas de incubación.
  • 18. Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas. Resultados Microorganismo Actividad ureásica Color del medio Proteus mirabilis ATCC 43071 Positiva Rojo-rosado Escherichia coli ATCC 25922 Negativa Amarillo S. flexneri ATCC 12022 Negativa Amarillo S. typhimurium ATCC 14028 Negativa Amarillo GRUPO UREA MUESTRA INICIAL RESULTADO 1 E. coli - 2 Salmonella enteritidis - 3 E. coli - 4 Enterobacter aerogenesis - La prueba dio negativa para urea al parecer porque las bacterias de estudio son descomponedoras de urea pero lentas ya que teóricamente se recomienda visualizar a las 72 horas y solo se revisó a las 24 horas. Aunque comparado con la muestra inicial se observan cambios en la coloración como turbiedad y otras que se tornan rosadas. MR-VP Medio Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación de enterobacterias. Siembra Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio. Incubación En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días. Resultados a-Prueba del rojo de metilo: Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio. b-Prueba del Voges Proskauer: Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio. 1-Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo. Negativo: color amarillo.
  • 19. 2-Prueba de Voges Proskauer: Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo. Negativo: ausencia de color rojo. Microorganismo Crecimiento RM VP E. coli A TCC 25922 Bueno + - K. pneumoniae A TCC 700603 Bueno - + P . mirabilis ATCC 43071 Bueno + - S. typhimurium A TCC 14028 Bueno + - C itrobacter freundii Bueno + - Enterobacter aerogenes Bueno - + GRUPO MRVP MUESTRA INICIAL RESULTADO 1 E-coli - 2 Salmonella enteritidis + 3 E. coli + 4 Enterobacter aerogenesis - En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo. Esta prueba no se pudo caracterizar porque no reacciono con las pruebas de rojo de metilo Prueba Agar cetrimide Medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del género. Su fórmula cumple con los requerimientos de la Armonización de Farmacopeas Europea, Japonesa y de los Estados Unidos de Norteamérica (EP, JP y USP respectivamente). Siembra En superficie, por inoculación directa de la muestra estriando o a partir de un caldo de enriquecimiento Incubación En aerobiosis, a 35-37 °C durante 24-48 horas. Resultados
  • 20. Observar el crecimiento microbiano, las características de las colonias y la producción de pigmentos. La presencia de un color verde-azulado corresponde a producción de piocianina, mientras que un color verde corresponde a la producción de pioverdina y un color rosa claro, rojizo o marrón oscuro corresponde a la producción de piorrubina. Examinar las placas bajo luz ultravioneta, ya que la producción de fluoresceína se observa de color amarillo verdoso brillante que difunde en el agar a partir del crecimiento microbiano. GRUPO AC MUESTRA INICIAL RESULTADO 10 -5 - 10 -5 - 10 -5 - 10 -5 - Para esta prueba se sembró de la dilución 10-5 del suelo y dio negativo por lo cual se describe la ausencia de Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas agar F. King B Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas spp. en base a la producción de fluoresceína. Conocido también como medio King B. Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Incubación Durante 18-24 horas a 35-37 ºC, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30 ºC, o dejar a 22 ºC y observar diariamente hasta 7 días. Resultados Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm. Se considera un resultado positivo la observación de fluoresceína, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenómenos de difusión. GRUPO KING- B RESULTADO GRUPO 3 RESULTADO GRUPO 2 1 E.coli - 2 Salmonella enteritidis + 3 E. coli + 4 Enterobacter aerogenesis -
  • 21. En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina. YDCA indican los componentes del medio: Yeast (levadura), ‘calcium carbonate’ (carbonato de calcio), dextrosa y agar. Resultados GRUPO VDCA MUESTRA INICIAL RESULTADO 1 E-coli - 2 Salmonella enteritidis - 3 E. coli - 4 Enterobacter aerogenesis - Negativo no se encontró en las bases de datos consultadas especificaciones de este medio de cultivo. Agar EMB Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Siembra En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas. Incubación De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. Resultados Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo
  • 22. de especies de Salmonella y Shigella. GRUPO EMB MUESTRA INICIAL RESULTADO 1 E-coli - 2 Salmonella enteritidis - 3 E. coli - 4 Enterobacter aerogenesis - Agar ENDO Desarrollado para el recuento de coliformes totales en agua, bebidas y otras muestras por medio de la técnica de filtración por membrana. Siembra Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación de la muestra. - Embeber la almohadilla con el caldo m-Endo hasta la saturación (la cantidad de medio de cultivo depende del grado de absorción de la misma). - Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo. Incubación Incubar las placas a 35-37 °C por 24 horas. Ocasionalmente, los microorganismos no coliformes pueden producir brillo metálico. Para confirmar las colonias sospechosas, transferirlas a tubos con caldo verde brillante y bilis al 2%, con campanitas de Durham. Incubar los tubos por 24-48 horas a 35-37 °C. Los coliformes habrán producido gas por fermentación de la lactosa, al cabo de ese período. Resultados El recuento debe realizarse en aquellas placas que contengan entre 20 y 80 colonias y no más de 200, ya que se trata de un medio selectivo. La concentración microbiana debe expresarse como el número de microorganismos presentes en 100 ml de muestra. Grupo ENDO 10 E-5 ENDO Bacteria Conocida ENDO 10-5 ENDO BACTERIA CONOCIDA 1 E-coli + - 2 Salmonella enteritidis - - 3 E. coli - -
  • 23. 4 Enterobacter aerogenesis - - 4.3 Morfología Bacteriana Resultados MICROORGANISMO IMAGEN DESCRIPCION Enterobacter aerogenesis Bacteria que pertenece al género Enterobacter, de la familia de las Enterobacteriaceae. Es un bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo, no esporulante oxidasa negativo, catalasa positivo, citrato positivo, indol negativo. Muestra de suelo Basilos gram +, Cocos gram - Resultados Cámara De Neubauer Instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de esporas y células en un medio líquido, cámara de recuento está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensión superficial (en especial una vez que se haya añadido la muestra líquida). Luego se introduce, por capilaridad entre la cámara y el cubre, el líquido con las células a contar, generalmente tras una dilución previa; puesto que la cámara tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos simultáneamente. Se observa la retícula al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las células.
  • 24. A partir del número de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo de la retícula, se calcula la concentración de células en la muestra líquida aplicada.1 El cálculo de la concentración de células se puede expresar así: Partículas / μl = (partículas contadas) / [ (superficie contada (mm²)∙profundidad de la cámara(mm) ] ∙ dilución Reticulo Neubauer.jpg En la retícula central, la cámara de Neubauer tiene un cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados terciarios. El cuadrado secundario central contiene no 16, sino 25 cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central se cuentan los hematíes, utilizando sólo los cuadrados de los bordes del terciario central y uno de los centrales. En los secundarios de los bordes superiores e inferiores de la cámara se hace el recuento leucocitario. Grupo 1 Cuadrícula 1 26 2 6 5 5 10 7 9 -- - - - 9 15 18 52 Ʃ 40 27 31 66 Total 164 Cuadrícula 2 4 - - 9 - - - - - - - - 9 15 18 52 Ʃ 16 18 28 6 Total 81 Cuadrícula 3 1 15 4 3 1 - 9 - 1 1 11 9 - 5 4 1 Ʃ 3 21 28 4 Total 56 Cuadrícula 4 18 13 10 16 6 10 7 4 5 9 26 10 2 2 4 3 Ʃ 31 34 47 34 Total 141 Ʃ= 164+81+56+141= 442 Promedio= 110,5 UFC/gr= 110,5*6*10= 6.630 Grupo 2 Cuadrícula 1 35 39 35 53 40 29 41 41 37 42 28 31 33 25 40 31 Ʃ Total 580 Cuadrícula 2 39 29 42 38 33 32 33 44 28 25 31 30 27 41 42 28 Ʃ Total 537 Cuadrícula 3 25 37 35 33 32 27 25 25 30 30 38 29 34 32 30 30 Ʃ Total 492 Cuadrícula 4 35 36 37 29 34 81 29 30 29 30 35 31 32 34 28 - Ʃ Total 513 Ʃ= 580+537+492+513= 2.122 Promedio= 530.5 UFC/gr= 530.5*6*10= 31.830
  • 25. 4.4 Resultados de observación de hongos Todos los hongos son organismos eucariotes y poseen al menos nucleo y membrana nuclear, retículo endoplásmico, mitocondrias y aparato secretor. Los hongos crecen en dos formas básicos: levaduras y mohos. Los mohos son hongos filamentosos multicelulares cuya forma y estructura tenida en cuenta a partir de sus características macro y microscópicas permiten su clasificación. Macroscopicamente se tendrán en cuenta las características de las colonias en los medios de cultivo. Microscopicamente lo será la existencia y características de sus estructuras. MICROORGANISM O IMAGEN DESCRIPCION Hongo sp1 Al tomar muestras de hongos filamentosos para observarlos al microscopio, frecuentemente se fragmenta el micelio. Sobre todo en el estudio de los dermatofitos, este inconveniente se obvia obteniendo un microcultivo. El hongo crece sobre un cubreobjetos que luego se coloca sobre un portaobjetos al que añadimos un transparentador con colorante ( Lactofenol). De este modo se observan las hifas intactas facilitando su correcta identificación. Hongo sp2
  • 26. Hongo sp3 Los conidióforos generan esporas solitarias o en cadena. A veces están agrupados en un haz (coremio) o sobre un conjunto de hifas entrelazadas (acérvula, esporodoquio) o dentro de un conidioma (picnidio). Hongo sp4 HIFA es la unidad vegetativa en la estructura de los hongos. Su forma es filamentosa y de tipo tubular con paredes celulares, pudiendo presentar tabiques (hifas septadas) o no (hifas aseptadas) y que contienen en su interior citoplasma que viene a ser una sustancia similar a la clara de huevo junto con pequeñas estructuras con morfologías y funciones determinadas denominadas organoides. CONCLUSIONES Esta práctica permite un acercamiento a las técnicas bioquímicas para la identificación de microorganismos de diferentes grupos aunque en la actualidad pruebas de ADN ribosomal permiten acercarse mas a la identificación taxonómica de los microorganismos de interés. Las pruebas bioquímicas sirven para hacer identificación de familias sin embargo la identificación hasta especie es muy compleja. La tinción de gram permite conocer características de la pared celular de los individuos de estudio y clasificar en grandes grupos de acuerdo a la taxonomía de bergeys. La actividad permite el acercamiento del estudiante de formación virtual al manejo de herramientas tecnológicas para conocer los métodos y técnicas empleados en la actualidad. La cámara de neubauer se usa para hallar densidad poblacional pero deben hacerse varia repeticiones para sacar promedios ya que se observaron diferencias significativas en el ejercicio que se hizo.
  • 27. El video sobre la vida en el suelo es un objeto de aprendizaje que permite acercarnos al universo microbiano y la relevacia para todos los ciclos biogeoquímicos. El uso de organosclorados tiene efecto sobre la diversidad microbiana como estudiantes de la especialización debemos enfocarnos en las buenas practicas sobre el uso del suelo ya que es un sistema dinamico. Se ha podido apreciar la importancia de la actividad de los microorganismos en los diferentes aspectos que denotan la fertilidad de un suelo y la sostenibilidad de ecosistemas y agroecosistemas. El manejo de diversas prácticas culturales (establecimiento de leguminosas en rotación de cultivos, abonos verdes, aplicación de materia orgánica) permite que los sistemas agrícolas requieran menos aplicaciones externas de energía; con ello se favorece la conservación del recurso suelo en una condición por demás favorable. Por otra parte, estas prácticas permiten que la actividad microbiana sea favorecida y que se tenga mayor diversidad de microorganismos, de tal forma que se establezcan diversas relaciones tróficas que contribuyan a la sanidad y fertilidad de los suelos manipulados en esta forma. El conocimiento de la actividad fisiológica de los microorganismos del suelo ha permitido seleccionar aquellos con potencial de uso en la agricultura. De esta manera, el hombre ha utilizado bacterias y hongos que propician mejor crecimiento y desarrollo de las plantas en los agroecosistemas donde se aplican. Con ello, y de acuerdo con un adecuado manejo de los sistemas, es posible incrementar la actividad microbiana del suelo, propiciando así el fortalecimiento de la sostenibilidad de los ecosistemas y agroecosistemas. Sin embargo, el uso de ciertos microorganismos debe contemplar algunos aspectos que permitan definir su potencial benéfico e incluso la factibilidad de utilizarlos, ya que algunos de ellos no son susceptibles de ser aplicados directamente en cultivos básicos (frijol o maíz), como es el caso de los hongos micorrízicos arbusculares, por ejemplo. BIBLIOGRAFÍA. AHMED E. Microbiología de los alimentos. Manual de laboratorio. Editorial Acribia, España. 2006. BARTHA R, ATLAS R. Ecología microbiana y microbiogía ambiental. Cuarta edición. Prentice Hall. 2001. Cerrato, R. F., & Alarcón, A. (2002). La microbiología del suelo en la agricultura sostenible. Universidad Autónoma del Estado de México, Programa Editorial Universitario. KONEMAN Diagnóstico microbiológico. Sexta edición. Editorial Panamericana. 2008. MARK C. Microbiología del suelo. Un enfoque exploratorio. Editorial Cengage learning, Argentina. 2000. PARKER J, MARTINKO J, MADIGAN M. Brock biología de los microorganismos. Décima edición. Prentice Hall. 2003. WILLEY J, SHERWOOD L, WOOLVERTON CH. Microbiologia de Prescott, Harley y Klein. Séptima edición. Editorial Macgraw Hill, Madrid España. 2009.