INFORME DE LA PRACTICA N.- 02: CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICRORGANISMOS DE INTERES BIOTECNOLOGICO AREVALO S. LUNA M. DUEÑAS A. TICONA S.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
Ilo, Moquegua, Perú
2022
PRACTICA N°2
CULTIVO Y
AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS
DE INTERES
BIOTECNOLOGICO
Integrantes:
Arévalo Navarro, Stefani Brilly
Dueñas Rodríguez, Adriana Melody
Luna Merma, Mayra Alexandra
Ticona Vilca, Siory Estefany
Docente:
Dr. Hebert Hernán Soto Gonzales

2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental
PRACTICA N°2: CULTIVO Y AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO
Biotecnología
Asesor:
Dr. Hebert Hernán Soto Gonzales
Responsables:
Arevalo Navarro, Stefani Brilly
Luna Merma, Mayra Alexandra
Ticona Vilca, Siory Estefany
Dueñas Rodriguez, Adriana Melody
VII Ciclo
Ilo, Moquegua, Perú
2022

3. ÍNDICE
INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 4
OBJETIVOS .................................................................................................................... 5
OBJETIVO GENERAL................................................................................................ 5
OBJETIVO ESPECÍFICO ............................................................................................ 5
MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 6
MATERIALES............................................................................................................. 6
EQUIPOS..................................................................................................................... 6
ELABORACIÓN DE AGARES Y CALDOS PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS
...................................................................................................................................... 8
INOCULACIÓN DE MUESTRAS EN PLACAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO
(05-05-2022) ................................................................................................................. 8
CONTEO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS (09-05-2022)................................. 9
PROCEDIMIENTO...................................................................................................... 9
DATOS Y OBSERVACIONES...................................................................................... 10
NORMAS DE SEGURIDAD ..................................................................................... 10
DATOS ...................................................................................................................... 11
DISCUSIONES.......................................................................................................... 12
CONCLUSIONES.......................................................................................................... 16
ANEXOS ....................................................................................................................... 17
TABLA DE ILUSTRACIONES
Figura 1Materiales de vidrio.......................................................................................... 17
Figura 2 Pesado de Caldo nutriente................................................................................ 17
Figura 3 Conteo de colonias en placas inoculadas.......................................................... 18
Figura 4 Presencia de UFC en muestra de suelo............................................................. 18
Figura 5 Colonias formadas en tres de ocho placas Petri ................................................ 18
Figura 6 Aislamiento de colonias en nueva placa Petri con cultivo................................. 18

4. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son organismos ubicuos y en los ambientes naturales se encuentran
usualmente como poblaciones mixtas, por lo que es necesario tenerlos como cultivos puros por
medio de aislamientos, para así poder identificarlos y caracterizarlos. La preparación de un
cultivo puro implica no solo el aislamiento de un determinado microorganismo, sino su
mantenimiento y el de su descendencia. Es importante determinar los diferentes medios de
cultivo y condiciones de incubación óptimas para cada uno de ellos y así lograr la formación
de colonias visibles aisladas. La aislación es la separación de un determinado microorganismo
del resto de microorganismos que le acompañan. El método más usual es la siembra por estría
sobre un método de cultivo sólido dispuesto en una placa de Petri.
Es posible utilizar diferentes estrategias para el aislamiento e identificación de
microorganismos: Separación física mediante diluciones seriadas y siembra en; utilización de
medios de cultivos selectivos y diferenciales y aprovechamiento de características particulares
de los microorganismos. Para facilitar y mejorar el proceso generalmente se combinan estas
estrategias. En nuestro caso utilizamos muestras provenientes de diferentes suelos, el
algarrobal, el río del algarrobal, Moquegua y río Osmore. El suelo está constituido por
minerales de varios tamaños, formas y características químicas, raíces de plantas, población de
organismos vivos (microorganismos) y materia orgánica en varias etapas de descomposición.
Cada factor físico y químico del suelo influye en el crecimiento o actividad de los
microorganismos.
El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno
con condiciones apropiadas. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí
mismos y necesitan los elementos presentes en su composición química. Los nutrientes deben
proporcionar estos elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista
metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar
macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los
factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura,
aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio.

5. Para que se cultiven con éxito, las bacterias requieren la provisión de nutrientes en el medio
de cultivo. Hay muchas formulaciones diferentes disponibles para satisfacer las diferentes
necesidades nutricionales de las especies bacterianas. El tipo de medio la elección dependerá
del propósito del cultivo. Rico, nutritivo o medios completos puede ser útil cuando se intenta
aumentar el volumen de un cultivo puro y mantener las células bacterianas en buenas
condiciones. medios mínimos por otro lado, proporcionará sólo las necesidades básicas para la
supervivencia y puede ser útil para manipular qué vías se activan en la bacteria.
El caldo de cultivo en medio líquido, también conocido como cultivo en caldo, proporciona
a las bacterias presentes un fácil acceso a los nutrientes disponibles en comparación con las
colonias bacterianas estáticas. El agar nutritivo a los medios líquidos permite colocarlos en
placas de Petri, como pendientes o en tapones, los medios selectos promueven o inhiben el
crecimiento de ciertas especies, grupos de especies o cepas con propiedades particulares. Esto
puede basarse en la capacidad de una cepa para utilizar nutrientes específicos, producir ciertos
subproductos o resistencia a ciertos antibióticos. Se puede utilizar la selección tanto en caldo
como en medios sólidos.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
- Desarrollar las principales técnicas de aislamiento, selección, conservación,
mantenimiento de cepas microbianas de importancia biotecnológica, manejo de equipos
de laboratorio y preparación de medio de cultivo.
OBJETIVO ESPECÍFICO
- Inicio del punto de partida de los proyectos biotecnológicos encargados a cada grupo.
- Fomentar el trabajo en equipo para facilitar el cumplimiento de objetivos de los
proyectos, por lo que incrementara la motivación y la creatividad, favoreciendo las
habilidades de cada integrante.
- Motivar al estudiante en temas de investigación aplicada a la biotecnología ambiental.
- Conocer la infraestructura de los laboratorios de la EPIAM asociados a los principios
de las buenas prácticas de laboratorio (BPL) con responsabilidad.

6. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES
- Medios de cultivo (Agar Nutriente y Caldo Nutriente)
- 25 placas Petri
- 12 tubos de ensayo
- Vaso precipitado de 100 mL y 600 mL
- Frasco de vidrio de 1000 mL
- 2 pipetas de 10 ml
- Matraz Erlenmeyer
- Embudo de decantación
- Probeta
- Agua filtrada Tipo-II libre de sales
- 250 mondadientes
- Papel Kraft
- Cinta
- Bolsas zip
- Pabilo
- Papel aluminio
- Muestras de suelo
EQUIPOS
- Autoclave
- Balanza analítica
- Agitador magnético
- Contador de colonias
- Cámara de flujo laminar

7. AUTOCLAVE
BALACE ANALÍTICA
CONTADOR DE COLONIAS
CÁMARA DE FLUJO LAMINAR
AGRITADOR MAGNETICO

8. ELABORACIÓN DE AGARES Y CALDOS PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS
- Colocar los tubos de ensayo en el vaso precipitado de 600 mL (12A) y los 250
mondadientes en el vaso precipitado de 100 ml
- Colocar 250 ml de agua en el matraz de 500 ml (4A) y tapar con un tampón.
- Forrar todos los materiales con papel aluminio y papel Kraft, sujetarlos con pabilo.
- Rotular todos los materiales a utilizar.
- Encender la autoclave y colocar los materiales en la cámara de la autoclave y tapar,
dejar por 15 min hasta que llegue a los 121°C.
- Pesar 3.25 gr. de caldo nutritivo y 10 gr. de Agar nutriente.
- Colocar los 10 gr. de Agar nutriente en el vaso precipitado de 1000 ml y agregar 400
ml de agua destilada, llevar esta solución al agitar a 25°C a 400 rpm.
- Vaciar la solución de Agar nutriente en la probeta y agregar 100 ml de agua destilada.
- Colocar esta solución preparada en un frasco y tapar con papel aluminio.
- Colocar los 3.25 gr. de Caldo nutriente en el vaso precipitado de 1000 ml y agregar 200
ml de agua destilada, colocar el magneto y llevar esta solución al agitar a 25°C a 400
rpm.
- Vaciar la solución de Agar nutriente en la probeta y agregar 50 ml de agua destilada.
- Colocar esta solución preparada en un frasco y tapar con papel aluminio.
- Llevar los materiales a la estufa a una temperatura determinada.
INOCULACIÓN DE MUESTRAS EN PLACAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (05-05-2022)
- Retirar los materiales autoclavados un día anterior de la estufa a una temperatura
determinada.
- Llevar la botella con 500 ml Agar Nutritivo hacía la cámara de flujo laminar, donde se
trabajará con un mechero Bunsen para mantener el contorno ambientado y evitar la
contaminación de los materiales.
Para el trabajo en la cámara de flujo laminar, es necesario antes desinfectarse las manos
con alcohol al 70% para evitar la contaminación de lo trabajado.
- Llenar las placas Petri con Agar Nutritivo, lo suficiente para que llene toda la placa
Petri y no haya burbujas existentes. Posteriormente, dejamos solidificar el agar nutritivo
a temperatura ambiente, puesto a que, al no ser un caldo, este tenderá a solidificarse sin
necesidad de un proceso o tratamiento previo.

9. - Una vez solidificadas las muestras, mezclamos dos gramos de muestra de suelo junto a
250 ml de agua destilada para comenzar la inoculación de la muestra.
- Rotulamos los tubos de ensayo con: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 y -8 para identificar el grado
de dilución de la muestra.
CONTEO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS (09-05-2022)
PROCEDIMIENTO
- Sacar las placas Petri del incubador para observar el crecimiento de las bacterias
inoculadas tres días anteriores a ese.
- Conteo de bacterias mediante el equipo especializado para el conteo de colonias. Anexo
1
- Se descartarán las placas cuyas bacterias no se han formado, dejando así las placas
cuyas colonias están presentes para empezar a trabajar con estas. Anexo 2
- Con las placas seleccionadas, llevarlas a la cámara de flujo laminar para posteriormente
aislar las bacterias en una zona esterilizada. Anexo 3
- Retiramos los mondadientes del vaso precipitado 100 ml previamente esterilizados por
medio de la autoclave. Esta acción se realizará dentro de la cámara de flujo laminar
para evitar futura contaminación con respecto a los cultivos.
- Aislamos las colonias de bacterias cuyas estén más separadas para evitar el contacto
entre colonias y procedemos a trasladar dicha colonia a una nueva placa Petri con Agar
Nutriente. Anexo 4
- Llevaremos las nuevas placas Petri al incubador para observar el nuevo crecimiento
de las colonias seleccionadas de las cuatro zonas seleccionadas.

10. DATOS Y OBSERVACIONES
NORMAS DE SEGURIDAD
1. Usar siempre mandil blanco de algodón debidamente cerrado.
2. No ingerir alimentos en el laboratorio.
3. Identificar y conocer la ubicación de los elementos de seguridad del laboratorio, tales
como extintor, botiquín, salida de emergencia, lavaojos, duchas de seguridad, alarmas,
etc.
4. El Acceso al laboratorio estará limitado, de acuerdo con el aforo del ambiente y sólo
para el grupo de estudiantes inscritos en el curso o clase.
5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza del área de trabajo.
6. Después de las experiencias en laboratorio, se debe lavar cuidadosamente las manos
7. No inhalar, probar u oler productos químicos.
8. Leer, entender y no alterar las etiquetas de los envases.
9. En caso de derramar Líquidos en la mesa o suelo avisar inmediatamente al docente,
considerando las características fisicoquímicas del Líquido.
10. No se debe bromear en el laboratorio, esta actitud puede generar grandes accidentes.
11. No utilizar equipos o elementos químicos sin haber recibido, previamente, una
capacitación de sus características,
12. No se debe pipetear con la boca, utilizar una bombilla de succión.
13. En caso de experimentar con vapores o gases se realizarán bajo la Campana de
seguridad para extracción de gases.
14. Cuando se hagan experiencias con materiales inflamables (con punto de ebullición
inferior a 61°C) se debe designar a responsables en el uso de extintores.
15. Está prohibido verter los líquidos corrosivos o alcalinos en los desagües.
16. El material de vidrio roto no se debe disponer en el basurero común, envolverlo y
ubicarlo en los recipientes para tal fin.
17. El alumno estará obligado a utilizar los Equipos de Protección Personal (EPP) y seguir
al pie de la letra las indicaciones dadas por el profesor acerca de cómo preparar
reactivos y cómo llevar a cabo la práctica.

11. DATOS
En el trabajo práctico, luego del procedimiento de preparación de cultivo, esperamos que
estén se reproduzcan: para nuestros resultados fueron:
RIO ALGARROBAL Y RÍO OSMORE
TOMA UNIDAD
FORMADORA DE
COLONIAS
OBSERVACION
ES
FOTO
-1 4 Una bacteria con
mayor proporción
(expansora)
-2 2 Colonias
pequeñas
-3 -
-4 -
-5 -
-6 -
-7 501 Variedades de
colonias de
diferentes tamaños.
-8 -

12. TIERRA DE MOQUEGUA Y EL ALGARROBAL
TOMA UNIDAD
FORMADORA DE
COLONIAS
OBSERVACION
ES
FOTO
-1 204 Variedad de
colonias
-2 9 Colonias
pequeñas
-3 8 Colonias de
diferentes tamaños
-4 -
-5 -
-6 -
-7 -
-8 -
DISCUSIONES
● En el primer grupo con muestreos de río del algarrobal y el río Osmore, realizamos los
pasos correspondientes para el cultivo y aislamiento de microorganismos, el resultado
pudimos observar que a las submuestras del -1 al -8, las dos primeras y la séptimo se
obtuvo el crecimiento de microorganismos en el cultivo, específicamente:

13. ○ En la primera toma se encontró 4 bacterias con colonias muy grandes, se
mostraban como una gran mancha con tonalidades blancas a cremas.
○ En la segunda toma se encontró dos colinas con proporciones pequeñas se
visualizaba como pequeñas manchas y puntitos diminutos.

14. ○ En la séptima toma se encontró gran proporción de colonia, específicamente se
encontró 501 microorganismos, de forma de manchas blanquecinas, con
separación, esta muestra de cultivo es irregular con las anteriores muestras, por
lo que suponemos que puede ser por diferentes factores, como la concentración
del cultivo tenga más nutrientes, o posiblemente una contaminación externa, al
igual un microorganismo con características de sobrepoblación.
● En el segundo grupo con muestreos en tierras con ubicación de Moquegua y el
Algarrobal, realizamos los pasos correspondientes para el cultivo y aislamiento de
microorganismos, el resultado pudimos observar que a las submuestras del -1 al -3, las
tres primeras por continuidad de procedimiento se obtuvo el crecimiento de
microorganismos en el cultivo, específicamente:
○ En la primera submuestra, encontramos 204 de variedad de colonias en ellas,
detallamos que por ser la primera submuestra consideramos que en ella debe
mayor crecimiento que en las posteriores.

15. ○ En la segunda submuestra se hallaron 9 colonias pequeñas, con manchas de
proporción diferente a las vecinas, unas más grandes que otras.
○ En la tercera submuestra se encontró 8 colonias de diferentes tamaños, de
colores blanquecinos, consideramos que este procedimiento cumple con los
posibles resultados, es decir por la toma de muestra esta es de menor resultado
en comparación de las primeras muestras.
● El procedimiento fue según lo esperado, en la segunda muestra se obtuvo resultados
consecutivos al muestreo, es decir en la primera hay mayor proporción de colonias y
van disminuyendo al pasar las submuestras, sin embargo en nuestros resultados de la
primera muestra ubicados en los ríos del algarrobal y Osmore, específicamente en la
séptima submuestras se encontró 501 colonias, que no va seguido a los pasos
correspondientes, por lo que podemos deducir de un microorganismos con diferentes
características en su cultivo o posiblemente de una contaminación exterior.

16. CONCLUSIONES
● Se logró conocer e identificar con éxito la diferente infraestructura de los laboratorios
de la EPIAM, los cuales tienen los equipos necesarios para desarrollar de manera
confiable las prácticas.
● El aislamiento, selección, conservación y mantenimiento de cepas microbianas se
desarrolló de manera correcta con la ayuda del buen manejo de los equipos de
laboratorio y preparación del medio de cultivo
● Se logró desarrollar el punto de partida de nuestro proyecto denominado
“DESARROLLO DE UN BIOINSECTICIDA PARA EL CONTROL BIOLÓGICO
DE SIMULIDOS HEMATOFAGOS Simulium escomeli EN LA PROVINCIA DE
ILO” en el cual necesitábamos el cultivo y aislamiento de bacterias

17. ANEXOS
Figura 1Materiales de vidrio
Figura 2 Pesado de Caldo nutriente

18. Figura 3 Conteo de colonias en
placas inoculadas
Figura 4 Presencia de UFC en
muestra de suelo
Figura 5 Colonias formadas en tres
de ocho placas Petri
Figura 6 Aislamiento de colonias en nueva
placa Petri con cultivo