Este documento describe un experimento sobre la iluminación de Köhler en microscopía óptica. Explica los conceptos teóricos clave como el condensador, los diafragmas de apertura y campo, y las pupilas y ventanas. También describe el montaje experimental utilizado, que incluye lentes, diafragmas y una bombilla como fuente de luz. El objetivo del experimento era determinar cuál de los diafragmas era el de apertura y cuál el de campo mediante el cálculo de los ángulos que subtendían desde la fuente de luz.

1. Instituto de F´ısica, Universidad de Antioquia
Informe pr´actica de Microscop´ıa:
Iluminador de Kh¨oler
Alejandro Correa L´opeza*
, V´ıctor Moreno-Mar´ına**
.
aUniversidad de Antioquia.
24 octubre de 2012
Resumen
La microscop´ıa es el conjunto de t´ecnicas y m´etodos destinados a hacer visible los
objetos de estudio que, por su peque˜nez, est´an fuera del rango de resoluci´on del ojo
humano. Si bien el microscopio es el elemento centra de la microscop´ıa, para producir
las im´agenes adecuadas se requiere adem´as de todo un conjunto de m´etodos y t´ecnicas
afines pero extr´ınsecas al aparato. Algunas de ellas son t´ecnicas de preparaci´on y
manejo de los objetos de estudio, t´ecnica de salida, procesamiento, interpretaci´on
y registro de im´agenes, etc. Exceptuando t´ecnicas especiales como las utilizadas en
microscopio de fuerza at´omica, microscopio de iones en campo y microscopio de efecto
t´unel, la microscop´ıa generalmente implica la difracci´on, reflexi´on o refracci´on de
alg´un tipo de radiaci´on incidente en el sujeto de estudio.
Palabras Claves: Microscopio, diafragmas de apertura y de campo, pupilas de
entrada y de salida, ventanas de entrada y de salida, objeto, imagen, aumento.
*
alejoco25@gmail.com
**
vmorenomarin@gmail.com
1

2. Laboratorio de ´Optica ´Optica Geom´etrica: el Microscopio
1. Introducci´on
En microscop´ıa ´optica, la iluminaci´on es el
mecanismo mediante el cual se hace incidir luz
sobre el plano del esp´ecimen en observaci´on.
Para la microscop´ıa ´optica de transmisi´on, la
iluminaci´on puede lograrse por mecanismos que
van desde la obtenci´on de un campo iluminado
de manera homog´enea, o por la proyecci´on de
una imagen de la fuente de luz sobre la mues-
tra. Otro m´etodo conocido como iluminaci´on de
campo oscuro consiste en obtener iluminaci´on
indirecta sobre el plano de la muestra median-
te la obstrucci´on del camino ´optico entre la
fuente luz y el plano de la muestra. La influencia
del factor iluminaci´on en microscop´ıa ´optica es
subestimada frecuentemente por el usuario del
microscopio, sobretodo el papel del condensador
en la resoluci´on de las im´agenes obtenidas en el
microscopio, debido a que existe una creencia
popularizada por Zernicke de que la resoluci´on
de las im´agenes es independiente de la correc-
ci´on introducida por el condensador. Anterior-
mente, el m´etodo de iluminaci´on de preferencia
era el de iluminaci´on cr´ıtica el cual consiste en
proyectar una imagen n´ıtida de la fuente sobre
el plano de la muestra con mayor intensidad so-
bre el centro del campo. Este m´etodo permite
obtener el mayor brillo posible a partir de la
fuente de iluminaci´on empleada, sin embargo el
m´etodo posee la desventaja de proporcionar una
iluminaci´on dispareja sobre el campo. En el a˜no
1893, Aughust K¨ohler del instituto Carl Zeiss
introdujo un m´etodo de iluminaci´on que lleva
su nombre. El m´etodo de K¨ohler, adem´as de
brindar el mayor brillo posible a partir de la
fuente de iluminaci´on, soluciona el problema de
la homogeneidad de la misma sobre el campo,
pues, en lugar de proyectar una imagen de la
fuente sobre el plano de la muestra, proyecta la
imagen del diafragma de apertura del conden-
sador. As´ı, se obtiene una iluminaci´on brillante,
homog´enea y con alto grado de coherencia sobre
el un campo. Por sus caracter´ısticas la ilumi-
naci´on K¨ohler tambi´en es conocida como ilumi-
naci´on coherente, y constituye uno de los m´eto-
dos de iluminaci´on m´as utilizado en microscop´ıa
´optica.
2. Marco Te´orico
A continuaci´on se expondr´an los conceptos
b´asicos de la ´Optica Geom´etrica que se uti-
lizaron en esta experiencia de laboratorio.
2.1. Condensador
En microscop´ıa ´optica, un condensador es un
sistema de lentes que concentra los haces de luz
por debajo de la muestra que se desea observar
[2].
2.2. Diafragma de Apertura y Di-
afragma de Campo
El diafragma de apertura (D.A.) es el diafrag-
ma que limita la cantidad de rayos emergentes
de un punto axial en el objeto. Usualmente se
identifica por su cercan´ıa a las lentes. Este di-
afragma limita el brillo de la imagen. Por otro
lado, el diafragma de campo (D.C.) es el diafrag-
ma que limita la cantidad de luz que ingresa al
campo, usualmente se ubica cerca del plano de
observaci´on limitando la porci´on del objeto que
puede verse a trav´es del sistema.
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3. Instituto de F´ısica Universidad de Antioquia
2.3. Pupilas y Ventanas
Cuando se utilizan diafragmas tipo iris en un
montaje ´optico, estos deben ir centrados a largo
del eje ´optico del sistema. Si bien f´ısicamente
los diafragmas limitan el ancho de los rayos
que cruzan determinada secci´on transversal de
´area del sistema ´optico, es preciso considerar
que a cada diafragma corresponde una imagen
que tambi´en influye en el comportamiento del
montaje y nos permite obtener m´as informa-
ci´on sobre el adecuado funcionamiento del mis-
mo. Aqu´ı introducimos los conceptos de pupila
de entrada y pupila de salida. Para un sistema
simple compuesto por una lente y un diafrag-
ma, al diafragma le corresponde una pupila de
entrada y una de salida, sin embargo cuando el
sistema es compuesto existe un criterio asociado
al ´angulo subtendido por el radio del diafragma.
Las pupilas pueden ubicarse en cualquier parte
del eje del sistema, excepto que ellas no pueden
coincidir con el objeto o la imagen [2].
2.3.1. Pupila de entrada
Es la imagen del diafragma de apertura forma-
da por todas las lentes que le preceden, vista
desde el punto de vista del objeto. En presencia
de varios diafragmas y lentes la pupila de entra-
da del sistema ser´a la que subtienda el menor
´angulo desde el punto de vista del objeto.
2.3.2. Pupila de salida
Es la imagen del diafragma de campo formada
por todas las lentes que le siguen, vista desde
el punto de vista de la imagen. En presencia de
varios diafragmas y lentes la pupila de salida del
sistema ser´a la que subtienda el menor ´angulo
desde el punto de vista de la imagen.
2.4. Determinaci´on de los Dia-
fragmas de Apertura y de
Campo
Establezcamos las reglas que se han de seguir
para determinar cu´al diafragma es el de abertu-
ra y cu´al es el de campo.
1. Se construyen todas las im´agenes que se
pueden tener de los diafragmas desde un
punto objeto sobre el eje ´optico (punto ax-
ial), esto es, las im´agenes que de los di-
afragmas forman los elementos ´opticos que
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4. Laboratorio de ´Optica ´Optica Geom´etrica: el Microscopio
preceden a cada uno de ellos. Por elemen-
tos que le anteceden se entienden los ele-
mentos ´opticos que se hallan entre el pun-
to objeto axial y el diafragma bajo consi-
deraci´on. La imagen que interesa es la que
forma el diafragma en el campo objeto.
2. La Pupila de Entrada corresponde a la im-
agen del diafragma que subtiende el menor
´angulo desde el punto axial. El diafragma,
del cual es imagen, se denomina Diafrag-
ma de Abertura.
3. La Ventana de Entrada ser´a la imagen del
diafragma que subtiende el menor ´angu-
lo a partir del centro de la Pupila de En-
trada. El diafragma del cual es imagen se
denomina Diafragma de Campo.
Las im´agenes de los diafragmas de Abertura y
de Campo formadas por los elementos ´opticos
que le suceden (que est´an entre el diafragma y
el espacio imagen) se denominan Pupila de Sa-
lida y Ventana de Salida, respectivamente. En
un instrumento ´optico formador de im´agenes se
suele construir de modo que la Ventana de Sal-
ida coincida con el plano imagen del sistema.
As´ı ocurre, por ejemplo, en el ojo y en la c´amara
fotogr´afica. El an´alisis puede iniciarse en el es-
pacio imagen a partir del punto imagen axial. Es
evidente e importante saber que un diafragma,
sea de apertura o de campo, en un instrumento
´optico, depende de la posici´on relativa del obje-
to con respecto al instrumento [2, 3]
Todo lo anterior viene ilustrado en la secuen-
cia que se presenta en la figura anterior para un
t´ıpico instrumento ´optico (ojo, c´amara fotogr´afi-
ca o CCD). La figura (a) muestra un esquema
del instrumento. En la figura (b) se presentan
los diafragmas o im´agenes de ellos, tal y como
se ven desde el punto objeto axial; igualmente
se indican la pupila y la ventana de entrada.
La figura (c) muestra como son vistos, desde el
punto imagen, los diafragmas; adem´as, cu´al es
la pupila de salida y la ventana de salida [4].
2.5. Microscopio de campo os-
curo
El microscopio de campo oscuro utiliza un haz
enfocado de luz muy intensa en forma de un
cono hueco concentrado sobre el esp´ecimen.
El objeto iluminado dispersa la luz y se hace
as´ı visible contra el fondo oscuro que tiene de-
tr´as, como las part´ıculas de polvo iluminadas
por un rayo de sol que se cuela en una habitaci´on
cerrada. Por ello las porciones transparentes del
esp´ecimen quedan oscuras, mientras que las su-
perficies y part´ıculas se ven brillantes, por la
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5. Instituto de F´ısica Universidad de Antioquia
luz que reciben y dispersan en todas las direc-
ciones, incluida la del eje ´optico que conecta el
esp´ecimen con la pupila del observador. Esta
forma de iluminaci´on se utiliza para analizar ele-
mentos biol´ogicos transparentes y sin pigmen-
tar, invisibles con iluminaci´on normal, sin fijar
la muestra, es decir, sin matarla. Tambi´en es
bastante utilizado en la observaci´on de muestras
metalogr´aficas para la observaci´on de detalles
en superficies con alta reflectancia. El objetivo
recibe la luz dispersa o refractada por las estruc-
turas del esp´ecimen. Para lograrlo, el microsco-
pio de campo oscuro est´a equipado con un con-
densador especial que ilumina la muestra con luz
fuerte indirecta. En consecuencia el campo visu-
al se observa detr´as de la muestra como un fondo
oscuro sobre el cual aparecen peque˜nas part´ıcu-
las brillantes de la muestra que reflejan parte
de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar
a las part´ıculas de polvo que se ven en el haz
de luz emanado de un proyector de diapositivas
en una habitaci´on oscura. La luz reflejada por
las part´ıculas de polvo llegan hasta la retina del
ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa per-
mite incluso distinguir part´ıculas m´as peque˜nas
que el poder separador del sistema ´optico usado
por transparencia [1].
3. Aspecto Experimental
3.1. Instrumentos
Para la realizaci´on de esta experiencia, se hizo
uso de los siguientes instrumentos ´opticos:
Bombilla como fuente de luz.
Lentes convergentes de 5 cm y 10 cm de
longitud focal.
Diafragmas tipo iris.
Jinetas y soportes.
Banco ´optico.
3.2. Montaje y Procedimiento
En la figura (3.2) tenemos que L1 es la lente con
longitud focal de 5 cm; D1 es el diafragma 1; D2
el diafragma 2 y L2 es la lente con longitud fo-
cal de 10 cm. Ubicamos sobre el banco ´optico las
lentes y los diafragmas tal y como lo muestra la
figura (3.2), de tal forma que la imagen de la
bombilla por la primera lente se formar´a en el
mismo plano del diafragma D2, y que sobre la
pantalla la segunda lente formar´a la imagen de
la primera.
Con los diafragmas dispuestos en su m´axima
abertura, D1 = 3×10−2
m y D2 = 2,89×10−2
m,
y con base en la teor´ıa, se procedi´o a averiguar
cu´al de los elementos del montaje corresponde al
diafragma abertura, cu´al al diafragma de cam-
po, y cu´ales son las pupilas y ventanas. Para
hallar el diafragma de abertura calculamos los
´angulos subtendidos desde la bombilla, desde la
lente desde las im´agenes de los diafragmas D1 y
D2 y desde la lente L2.
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6. Laboratorio de ´Optica ´Optica Geom´etrica: el Microscopio
Los ´angulos subtendidos fueron:
´Angulo subtendido desde la bombil-
la a la lente L1: tan θ1 = CO/CA,
donde el cateto opuesto era la mitad del
di´ametro de la lente, es decir, 1,5 × 10−2
m, y el cateto adyacente era la distancia
a la bombilla, es decir, 7 × 10−2
m. As´ı,
tan θ1 ≈ θ1 = 0,214 .
´Angulo subtendido desde la bombil-
la a la imagen de D1: Para calcular la
posici´on de la imagen correspondiente a
D1 y su respectivo aumento, hacemos uso
de las ecuaciones
1
p
−
1
q
=
1
f
; M =
q
p
, (1)
donde q es la distancia imagen, p es la
distancia objeto y f es la longitud fo-
cal de la lente [5]. Con p = 6,5 × 10−2
m y f = 5 × 10−2
m encontramos que
q = −4,6 × 10−4
m. Es decir, la imagen
se forma al lado derecho de la imagen.
Luego, el aumento M ser´a M = −4,6 ×
10−4
/6,5×10−2
= 7,07×10−3
, lo cual sig-
nifica que si el di´ametro de D1 era 3×10−3
m, su imagen qued´o con un di´ametro de
D1 = 2 × 10−4
m. As´ı obtenemos los
siguientes datos: CO = 1 × 10−4
m y
CA = 7×10−2
−4,6×10−4
= 6,9×10−2
m
porque obtenemos que tan θ2 ≈ θ2 = 0,08.
´Angulo subtendido desde la bombil-
la a la imagen de D2: Como el diafrag-
ma D2 fue ubicado de forma tal que en
ese mismo plano estuviera la imagen de la
bombilla debido a la lente L1, y por la re-
versibilidad ´optica, la imagen de D2 esta
en el mismo plano del objeto; es decir, θ3
tiende a infinito.
´Angulo subtendido desde la bombil-
la a la imagen de L2: Dicha imagen est´a,
de manera similar que se calcul´o para D1,
a 0,83×10−2
m de la bombilla. El aumen-
to fue 0,0315, y puesto que el di´ametro
de ambas lentes era de 6, 3 × 10−2
m, en-
tonces el di´ametro de la imagen fue de
0,2 × 10−2
m. As´ı, CO = 0,1 × 10−2
m
y CA = 0,83 × 10−2
m. Por lo tanto
tan θ4 ≈ θ4 = 0, 12.
De los anteriores c´alculos vemos que el diafrag-
ma D1 es el que subtiende el menor ´angulo,
luego se denomina diafragma de apertura y por
tanto su imagen debido a L1 es la pupila de en-
trada, ya calculada, y su imagen debido a L2 es
la denominada pupila de salida. Realizando los
c´alculos respectivos, se mostr´o que la pupila de
salida se encontr´o a 20 cm de la lente L2 con
M = 1.
Para hallar el diafragma de campo, nos ubi-
camos sobre la pupila de entrada y calculamos
hacia ambos lados, observando cu´al objeto sub-
tiende el ´angulo menor. Procediendo de igual
forma que para hallar el diafragma apertura,
encontramos que θD2 = 0,134, θL1 = 0,46 y
θL2 = 0,15. As´ı, el diafragma D2 corresponde al
diafragma de campo. Con el diafragma de cam-
po determinado, procedimos a hallar las ven-
tanas de entrada y salida. La ventana de entra-
da coincidi´o en el plano de la bombilla, con un
tama˜no de 1,2×10−2
m de di´ametro. La ventana
de salida, es decir, la imagen de D2 debido a L2,
se encontr´o a 0,9 m de L2 , con un di´ametro de
0,3 m.
Experimentalmente vimos que, efectivamente,
D1 era el encargado del tama˜no de la pupila de
salida, tal y como se esperaba ya que es el dia-
fragma de apertura. Observamos tambi´en que
D2 era el encargado de aumentar o disminuir
la intensidad, es decir corresponde al diafrag-
ma de campo. A 0,2 m de la lente L2 encon-
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7. Instituto de F´ısica Universidad de Antioquia
tramos la imagen de D1 , y vimos que, efecti-
vamente, el di´ametro de la pupila era exacta-
mente el di´ametro del diafragma tal y como lo
predicen los c´alculos realizados. Todo este mis-
mo montaje se repiti´o para una nueva posici´on
del diafragma D1, el cual se ubic´o m´as cerca a la
lente L1. Tal hecho se representa en la siguiente
figura.
De nuevo, D1 sigue siendo el diafragma de
abertura y D2 el diafragma de campo. Tanto
la ventana de entrada como la de salida per-
manecieron iguales. La diferencia radica en que
las pupilas cambiaron de ubicaci´on y tama˜no,
en especial, la pupila de salida; empleando la
ecuaci´on (1), deber´ıa estar a 6, 7 × 10−2
m de la
lente L2 en el lado opuesto a ´esta, y su aumen-
to ser´a 0,68, a diferencia del montaje anterior
donde el aumento era 1. Experimentalmente ob-
servamos, nuevamente, que D1 limit´o el tama˜no
de la pupila de salida; D2 la intensidad, y en
efecto, a 16,8 × 10−2
m encontramos la imagen
de D1 donde apreciamos que esta vez la pupila
de salida fue m´as peque˜na que el di´ametro del
diafragma abertura. A continuaci´on, mostramos
el trazado de los rayos para este ´ultimo montaje.
4. Conclusiones
1. El diafragma en un sistema ´optico que ha-
ga las veces de DA, va a limitar el tama˜no
del haz que sale de dicho sistema.
2. El diafragma en un sistema ´optico que ha-
ga las veces de DC, va a limitar la inten-
sidad del haz que sale de dicho sistema.
3. El movimiento del DA en un sistema ´opti-
co que permanece est´atico, altera ´unica-
mente el tama˜no de las pupilas tanto de
entrada como de salida, siempre y cuando
dicho movimiento no sea tal que el ´angulo
subtendido desde el objeto a dicho diafrag-
ma sea mayor que el mismo ´angulo pero
para otro objeto.
Referencias
[1] Dark field microscopy. (2013, 19 de Febrero).
En Wikipedia, the Free Enciclopedia. Recu-
perado el 3 de Marzo de 2013 a las 16:30
de http://en.wikipedia.org/wiki/Dark_
field_microscopy.
[2] Condensador. En Wikipedia, the Free En-
ciclopedia. http://es.wikipedia.org/
wiki/Condensador.
[3] Hecht, Eugene. Optics. 4 ed., San Francisco,
Pearson Education, 2002, p. 171-173.
[4] Guti´errez, Antoni. ´Optica Instrumental,
Barcelona, Ediciones UPC, 1996, p. 53-60.
[5] Jenkins, F., White, H. Fundamentos de
´Optica, Madrid, Aguilar S. A. de Ediciones,
1964, p. 102-109.
[6] Alzate, H´ector. F´ısica de las Ondas,
Medell´ın, Editorial Ude@, 2005, p. 222.
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8. Laboratorio de ´Optica ´Optica Geom´etrica: el Microscopio
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