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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL
Practica N°1:
Uso del Espectrofotómetro UV-Vis - Nano Drop One C del Laboratorio de
Biología Molecular y Biotecnología - UNAM / ILO
Curso:
BIOTECNOLOGIA
Docente:
Dr. Herbert Hernan Soto Gonzales
Presentado por:
Atencio Flores, Rafael Sebastian
Bouroncle Villanueva, Angela Paola
Walcona Llano, Juan Danny
ILO-PERÚ
2023
INTRODUCCIÓN
En la Universidad Nacional de Moquegua, Filial Ilo, contamos con laboratorios dirigidos a
diferentestipos deuso e investigaciones, uno deellos es el laboratorio deBiotecnología a cargo
del docente Hebert Soto Gonzales. Uno de los tantos equipos de tecnología de primera gama
es el Espectrofotómetro Nanodrop One C.
Este equipo de tecnología avanzada, cuenta una gran precisión de la medición y la
identificación de contaminantes. Cuantifica y califica las muestras de ADN, ARN y proteínas
en segundos con solo 1-2 µL, y obtenga datos espectrales completos.
Respecto a la calidad de muestra, está implementada con los espectrofotómetros UV-Vis
Thermo Scientific ™ NanoDrop ™ One Microvolume.
Algunas características de dicho instrumento son: Espectrofotómetro UV-Vis de
microvolumen de espectro completo con posición de cubeta (agitación, termostato de 37 ° C,
cinética), Medida rango 0.4 - 27500ng / µL dsDNA, Rango de medición de longitud de onda
190nm-850nm, Sensor de integridad de columna.
Una vez reconocido el instrumento, se pasó a realizar análisis de cierto tiempo de ADN de un
hongo, el cual sirvió de ejempló para saber cual era la lectura exacta de la muestra, y nos
permitió conseguir la data esperada, con una lectura precisa.
OBJETIVOS
• Conocer el funcionamiento del Espectrofotómetro Nanodrop One C.
• Reconocer de que partes está compuesto.
• Saber cuáles son los análisis que puede realizar.
• Poner en práctica lo aprendido en el laboratorio de biotecnología.
• Saber cuál es el margen de exactitud y error en la lectura de una muestra.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTO
Micropipetas; instrumento
de laboratorio empleado para
absorber y transferir
pequeños volúmenes de
líquidos y permitir su manejo
en las distintas técnicas
científicas, estas tienen
diferentes capacidades y se se
pueden regular para que varíe
Tubo de microcentrífuga;
Pequeño contenedor
cilindrico de plástico con un
fondo cónico con capacidades
diferentes, en este caso era de
1,5 ml
Espectrofotómetro
El espectrofotómetro UV-Vis
NanoDrop One C es una
herramienta de laboratorio
utilizada para medir la
absorbancia de la luz
ultravioleta y visible por parte
de muestras líquidas. Es
especialmente útil para
cuantificar la concentración
de ácidos nucleicos (ADN y
ARN) y proteínas, así como
para determinar la pureza de
las muestras
Puntas de Pipeta de 10 μL;
están equipadas con un filtro
que protege sus pipetas de
aerosoles
Muestra de ADN; El ADN
fue de una muestra de hongo
de mar
Papel Tisú; es un papel fino
absorbente hecho de pulpa de
celulosa. Se destaca por su
bajo gramaje y por poseer
una textura consistente en
micro-arrugas que le confiere
suavidad y capacidad de
absorción
Micropipeta especial para
el espectrofotómetro; Es una
micropipeta que vino incluido
con el espectrómetro
anteriormente mencionado, el
cual es de uso exclusivo.
Puntas de Pipeta de 20 μL; están equipadas con un filtro que
protege sus pipetas de aerosoles
PROCEDIMIENTO
Primer paso
En primer lugar, se explicaron las normas de bioseguridad que se tomarían en cuenta durante
la duración del laboratorio, seguido de ello se realizó una demostración práctica por parte del
especialista para conocer un adecuado manejo de los múltiples instrumentos usados.
Segundo paso
Para la preparación dela muestra se alista múltiples embaces rotulados con un tapa fija evitando
tocar la superficie interna. Cada embace fue rotulado con el insumo que iba a contener antes
de iniciar.
Asegurarse de quitar todo elemento extraño cerca del NanoDrop, además de limpiar con papel
especial para que no afecte los resultados.
Tercer paso
Conecte los interruptores para encender el NanoDrop, seguido aprende el botón de encendido.
Una ves inicializado la panta siga cuidadosamente las instrucciones del manual y del panel
táctil para un uso adecuado y correcto.
Cuarto paso
Previamente al análisis de cualquiera muestra, es indispensable calibrar el espectrofotómetro
con un estándar o blanco, en la mayoría de casos se usa agua como referencia, dicho
procedimiento se detalla minuciosamente en las instrucciones de uso del instrumento.
Quinto paso
Para iniciar con el análisis de la muestra es necesario limpiar la zona de la cubeta con un papel
especial para NanoDrop o pañuelo evitando que emitan pelusas en la superficie.
Con la micro pipeta succione una cantidad necesaria (2 𝜇𝐿 de muestra) y añádala con un
cuidado minucioso en el pedestal de la superficie. Evite en todo momento que se formen
burbujas en la micropipeta y esta obstruya la muestra.
Sexto paso
Deje caer con menor fuerza la parte superior del pedestal, seguidamente seleccione las
múltiples opciones a escoger según los datos requeridos
Haz clic en "Iniciar" o el botón correspondiente para medir la absorbancia.
Séptimo paso
Al concluir las opciones a analizar, el espectrofotómetro NanoDrop arrojara cantidades de
absorbancia de la muestra en diferentes longitudes de onda.
En el caso de ADN y ARN, la cantidad de absorbancia es medida a 260 nm, mientras que la
pureza se evalúa comparando las absorbancias a 260 nm y 280 nm. Una relación A260/A280
de alrededor de 1.8 indica una pureza adecuada para ácidos nucleicos.
En el caso de las proteínas, la absorbancia se mide generalmente a 280 nm.
Octavo paso
Para concluir con la prueba, debe limpiar cuidadosamente con agua desionizaday luego secarla
para luego proceder a apagar el instrumento.
Apaga el espectrofotómetro según las instrucciones del manual.
En el caso de tener alguna duda o consulta siempre es recomendable recurrir al manual de uso
para evitar un uso erroneo del instrumento, ya que para cada modelo del equipo existen
diferentes instrucciones de uso.
Muestra
30
Muestra
29
RESULTADOS
Como podemos observar en la tabla tenemos 10 análisis de muestra, de las cuales 5
pertenecen al ADN del hongo y los otro 5 a una muestra en blanco. Siendo estos los
siguientes
Muestra de ADN
# ng/ µL A260/A280 A260/A230
2 1.4 1.22 2.10
3 1.5 1.35 2.49
4 No Hubo muestra
5 24.9 1.65 0.77
6 7.7 1.67 0.80
7 2.1 1.95 1.12
• En este análisis se tuvieron que analizar todas las muestras de los para usarlos en el
espectrómetro, sin embargo, algunas muestras se agotaron (quedaban menos de lo que
se necesita) y al final solo se analizó 5 muestras.
• Como primer punto la absorbancia de la muestra ronda cerca a los 1.8 lo cual nos
indica que existe una adecuada pureza para ácidos nucleicos.
• Y ng/µL de la muestra tiene un promedio de:
1.4+1.5+24.9+7.7+2.1
5
= 7.52 ng/µL
• Teniendo como máximo valor 24.9 ng/µL
• Teniendo como valor mínimo 1.4 ng/µL
En los casos anteriores se puede ver una gran diferencia que se alejan del promedio, esto se
debe a que la muestra de ADN fue disminuyendo en cada frasco. Pero eso solo significa en la
cantidad de ácidos nucleicos que existe en el volumen mas no que sean diferentes.
# ng/ µL A260/A280 A260/A230
1 -0.7 10.24 1.14
2 1.4 1.22 2.10
3 No hubo muestra
4 1.5 1.35 2.49
5 24.9 1.65 0.77
6 7.7 1.67 0.80
7 2.1 1.95 1.12
8 -0.4 0.89 0.25
9 -0.2 1.27 0.18
10 -0.1 -1.12 0.08
11 0.4 0.82 -0.93
Muestras en Blanco
# ng/ µL A260/A280 A260/A230
1 -0.7 10.24 1.14
8 -0.4 0.89 0.25
9 -0.2 1.27 0.18
10 -0.1 -1.12 0.08
11 0.4 0.82 -0.93
Para las muestras en blanco se utiliza normalmente agua desionizada, el cual nos debe dar
con un ng/µL rondando el 0, el cual nos indica que no hay presencia de ácidos nucleicos
CONCLUSIONES
• Es muy importante conocer el uso adecuado de la instrumentación en el laboratorio de
biotecnología, porque ante un inadecuado manejo de algún intrumento la veracidad de
los resultados será muy poco fiable.
• Es enriquecedor conocerlas multiples mecanismo e instrumentos para el analisis de las
variadas muestras obtenidas.
• El instrumento Thermo Scientifi “NanoDrop” One, es un espectrofotómetro UV-
Visible compacto y autónomo diselado para el analisis de microvolumenes de acidos
nucleicos y una amplia variedad de proteínas purificadas.
• Para concluir con el informe, podemos decir que hay una variación en la cantidad de
Ácido Nucleicos en las muestras, esto debido a la distribución que del ADN que se
hizo inicialmente.
• En cambio, en la Absorbancia A260/A280 no hay una gran variación y estos rondan
por el 1.8, el cual nos indica la pureza del ADN de la muestra, y si esta está
contaminada con otras sustancias.
• Y como punto final podemos decir que el ADN de la muestra analizada no presenta
una cantidad significativa de contaminantes.
BIBLIOGRAFIA
• Artedinamico. (n.d.). Espectrofotómetro NanoDrop One C. Retrieved September 15,
2023, from https://www.equiposylaboratorio.com/portal/productos/espectrofotometro-
nanodrop-one-c (N.d.). Fishersci.Es. Retrieved September 15, 2023, from
https://www.fishersci.es/shop/products/nanodrop-one-onec-microvolume-uv-
spectrophotometer/p-6524184
• https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/3091-NanoDrop-One-
User-Guide-v1.3-sw-SPANISH.pdf
ANEXOS
Figura N°1: proceso de manejo del
espectrofotómetro
Figura N°2: Muestras del ADN en
microcentrifuga
Figura N°3: Se retira 2 μL de muestra
Figura N°4: Se coloca la muestra de
1-2 μL
Figura N°5: Cuadro de datos obtenido
por el espectrómetro UV-Vis Nano Drop
One C

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  • 1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL Practica N°1: Uso del Espectrofotómetro UV-Vis - Nano Drop One C del Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología - UNAM / ILO Curso: BIOTECNOLOGIA Docente: Dr. Herbert Hernan Soto Gonzales Presentado por: Atencio Flores, Rafael Sebastian Bouroncle Villanueva, Angela Paola Walcona Llano, Juan Danny ILO-PERÚ 2023
  • 2. INTRODUCCIÓN En la Universidad Nacional de Moquegua, Filial Ilo, contamos con laboratorios dirigidos a diferentestipos deuso e investigaciones, uno deellos es el laboratorio deBiotecnología a cargo del docente Hebert Soto Gonzales. Uno de los tantos equipos de tecnología de primera gama es el Espectrofotómetro Nanodrop One C. Este equipo de tecnología avanzada, cuenta una gran precisión de la medición y la identificación de contaminantes. Cuantifica y califica las muestras de ADN, ARN y proteínas en segundos con solo 1-2 µL, y obtenga datos espectrales completos. Respecto a la calidad de muestra, está implementada con los espectrofotómetros UV-Vis Thermo Scientific ™ NanoDrop ™ One Microvolume. Algunas características de dicho instrumento son: Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen de espectro completo con posición de cubeta (agitación, termostato de 37 ° C, cinética), Medida rango 0.4 - 27500ng / µL dsDNA, Rango de medición de longitud de onda 190nm-850nm, Sensor de integridad de columna. Una vez reconocido el instrumento, se pasó a realizar análisis de cierto tiempo de ADN de un hongo, el cual sirvió de ejempló para saber cual era la lectura exacta de la muestra, y nos permitió conseguir la data esperada, con una lectura precisa.
  • 3. OBJETIVOS • Conocer el funcionamiento del Espectrofotómetro Nanodrop One C. • Reconocer de que partes está compuesto. • Saber cuáles son los análisis que puede realizar. • Poner en práctica lo aprendido en el laboratorio de biotecnología. • Saber cuál es el margen de exactitud y error en la lectura de una muestra. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO Micropipetas; instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas, estas tienen diferentes capacidades y se se pueden regular para que varíe Tubo de microcentrífuga; Pequeño contenedor cilindrico de plástico con un fondo cónico con capacidades diferentes, en este caso era de 1,5 ml Espectrofotómetro El espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop One C es una herramienta de laboratorio utilizada para medir la absorbancia de la luz ultravioleta y visible por parte de muestras líquidas. Es especialmente útil para cuantificar la concentración de ácidos nucleicos (ADN y ARN) y proteínas, así como para determinar la pureza de las muestras Puntas de Pipeta de 10 μL; están equipadas con un filtro que protege sus pipetas de aerosoles Muestra de ADN; El ADN fue de una muestra de hongo de mar Papel Tisú; es un papel fino absorbente hecho de pulpa de celulosa. Se destaca por su bajo gramaje y por poseer una textura consistente en micro-arrugas que le confiere suavidad y capacidad de absorción
  • 4. Micropipeta especial para el espectrofotómetro; Es una micropipeta que vino incluido con el espectrómetro anteriormente mencionado, el cual es de uso exclusivo. Puntas de Pipeta de 20 μL; están equipadas con un filtro que protege sus pipetas de aerosoles PROCEDIMIENTO Primer paso En primer lugar, se explicaron las normas de bioseguridad que se tomarían en cuenta durante la duración del laboratorio, seguido de ello se realizó una demostración práctica por parte del especialista para conocer un adecuado manejo de los múltiples instrumentos usados. Segundo paso Para la preparación dela muestra se alista múltiples embaces rotulados con un tapa fija evitando tocar la superficie interna. Cada embace fue rotulado con el insumo que iba a contener antes de iniciar. Asegurarse de quitar todo elemento extraño cerca del NanoDrop, además de limpiar con papel especial para que no afecte los resultados.
  • 5. Tercer paso Conecte los interruptores para encender el NanoDrop, seguido aprende el botón de encendido. Una ves inicializado la panta siga cuidadosamente las instrucciones del manual y del panel táctil para un uso adecuado y correcto. Cuarto paso Previamente al análisis de cualquiera muestra, es indispensable calibrar el espectrofotómetro con un estándar o blanco, en la mayoría de casos se usa agua como referencia, dicho procedimiento se detalla minuciosamente en las instrucciones de uso del instrumento. Quinto paso Para iniciar con el análisis de la muestra es necesario limpiar la zona de la cubeta con un papel especial para NanoDrop o pañuelo evitando que emitan pelusas en la superficie. Con la micro pipeta succione una cantidad necesaria (2 𝜇𝐿 de muestra) y añádala con un cuidado minucioso en el pedestal de la superficie. Evite en todo momento que se formen burbujas en la micropipeta y esta obstruya la muestra. Sexto paso Deje caer con menor fuerza la parte superior del pedestal, seguidamente seleccione las múltiples opciones a escoger según los datos requeridos Haz clic en "Iniciar" o el botón correspondiente para medir la absorbancia. Séptimo paso Al concluir las opciones a analizar, el espectrofotómetro NanoDrop arrojara cantidades de absorbancia de la muestra en diferentes longitudes de onda. En el caso de ADN y ARN, la cantidad de absorbancia es medida a 260 nm, mientras que la pureza se evalúa comparando las absorbancias a 260 nm y 280 nm. Una relación A260/A280 de alrededor de 1.8 indica una pureza adecuada para ácidos nucleicos. En el caso de las proteínas, la absorbancia se mide generalmente a 280 nm. Octavo paso Para concluir con la prueba, debe limpiar cuidadosamente con agua desionizaday luego secarla para luego proceder a apagar el instrumento. Apaga el espectrofotómetro según las instrucciones del manual. En el caso de tener alguna duda o consulta siempre es recomendable recurrir al manual de uso para evitar un uso erroneo del instrumento, ya que para cada modelo del equipo existen diferentes instrucciones de uso.
  • 6. Muestra 30 Muestra 29 RESULTADOS Como podemos observar en la tabla tenemos 10 análisis de muestra, de las cuales 5 pertenecen al ADN del hongo y los otro 5 a una muestra en blanco. Siendo estos los siguientes Muestra de ADN # ng/ µL A260/A280 A260/A230 2 1.4 1.22 2.10 3 1.5 1.35 2.49 4 No Hubo muestra 5 24.9 1.65 0.77 6 7.7 1.67 0.80 7 2.1 1.95 1.12 • En este análisis se tuvieron que analizar todas las muestras de los para usarlos en el espectrómetro, sin embargo, algunas muestras se agotaron (quedaban menos de lo que se necesita) y al final solo se analizó 5 muestras. • Como primer punto la absorbancia de la muestra ronda cerca a los 1.8 lo cual nos indica que existe una adecuada pureza para ácidos nucleicos. • Y ng/µL de la muestra tiene un promedio de: 1.4+1.5+24.9+7.7+2.1 5 = 7.52 ng/µL • Teniendo como máximo valor 24.9 ng/µL • Teniendo como valor mínimo 1.4 ng/µL En los casos anteriores se puede ver una gran diferencia que se alejan del promedio, esto se debe a que la muestra de ADN fue disminuyendo en cada frasco. Pero eso solo significa en la cantidad de ácidos nucleicos que existe en el volumen mas no que sean diferentes. # ng/ µL A260/A280 A260/A230 1 -0.7 10.24 1.14 2 1.4 1.22 2.10 3 No hubo muestra 4 1.5 1.35 2.49 5 24.9 1.65 0.77 6 7.7 1.67 0.80 7 2.1 1.95 1.12 8 -0.4 0.89 0.25 9 -0.2 1.27 0.18 10 -0.1 -1.12 0.08 11 0.4 0.82 -0.93
  • 7. Muestras en Blanco # ng/ µL A260/A280 A260/A230 1 -0.7 10.24 1.14 8 -0.4 0.89 0.25 9 -0.2 1.27 0.18 10 -0.1 -1.12 0.08 11 0.4 0.82 -0.93 Para las muestras en blanco se utiliza normalmente agua desionizada, el cual nos debe dar con un ng/µL rondando el 0, el cual nos indica que no hay presencia de ácidos nucleicos
  • 8. CONCLUSIONES • Es muy importante conocer el uso adecuado de la instrumentación en el laboratorio de biotecnología, porque ante un inadecuado manejo de algún intrumento la veracidad de los resultados será muy poco fiable. • Es enriquecedor conocerlas multiples mecanismo e instrumentos para el analisis de las variadas muestras obtenidas. • El instrumento Thermo Scientifi “NanoDrop” One, es un espectrofotómetro UV- Visible compacto y autónomo diselado para el analisis de microvolumenes de acidos nucleicos y una amplia variedad de proteínas purificadas. • Para concluir con el informe, podemos decir que hay una variación en la cantidad de Ácido Nucleicos en las muestras, esto debido a la distribución que del ADN que se hizo inicialmente. • En cambio, en la Absorbancia A260/A280 no hay una gran variación y estos rondan por el 1.8, el cual nos indica la pureza del ADN de la muestra, y si esta está contaminada con otras sustancias. • Y como punto final podemos decir que el ADN de la muestra analizada no presenta una cantidad significativa de contaminantes.
  • 9. BIBLIOGRAFIA • Artedinamico. (n.d.). Espectrofotómetro NanoDrop One C. Retrieved September 15, 2023, from https://www.equiposylaboratorio.com/portal/productos/espectrofotometro- nanodrop-one-c (N.d.). Fishersci.Es. Retrieved September 15, 2023, from https://www.fishersci.es/shop/products/nanodrop-one-onec-microvolume-uv- spectrophotometer/p-6524184 • https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/3091-NanoDrop-One- User-Guide-v1.3-sw-SPANISH.pdf
  • 10. ANEXOS Figura N°1: proceso de manejo del espectrofotómetro Figura N°2: Muestras del ADN en microcentrifuga
  • 11. Figura N°3: Se retira 2 μL de muestra Figura N°4: Se coloca la muestra de 1-2 μL
  • 12. Figura N°5: Cuadro de datos obtenido por el espectrómetro UV-Vis Nano Drop One C