1. Identificación del origen de replicación bidireccional de DNA
en los cromosomas de mamiferos
Objetivo
Distinguir entre los dos mecanismos de replicación en cromosomas de mamíferos buscando un OBR
Mecanismo de la horquilla de replicación: la síntesis de DNA en la hebra líder es continua, la DNA polimerasa no necesita la
DNA primasa para que cree un primer.
Mecanismo de la separación de hebras: las hebras se separan en grandes extensiones y la síntesis se da en muchos sitios.
Aparece una mezcla de fragmentos de okazaki y hebras continuas en ambos lados. No hay transición de síntesis continua a
discontinua en ningún sitio en particular.
Resultados
Los fragmentos de okazaki en cromosomas de mamíferos se originan predominantemente, sino exclusivamente en la hebra
retrasada.
Estrategia experimental
Sincronización de células en el borde de pasaje de G1/S
Se realizo una depresión con isoleucina que inhibió la activación de las
quinasas dependientes de ciclinas las cuales están encargadas de la
regulación del ciclo celular en el pasaje de G1/S.
Se agregó afidil colina para inhibir la DNA polimerasa, todas las células
llegan a la fase S pero no pueden comenzar a sintetizar el DNA.
Permeabilización de la membrana
Se permeabilizó la membrana con NP40 (detergente no ionico) que genera pequeños huecos en la membrana para permitir la
entrada de los dNTP’s marcados con 32P y BrudUTP . Una alternativa a esta técnica es explotar la membrana y utilizar solo los
núcleos.
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2. Identificación de fragmentos de okazaki
Experimento PULSE y CHASE
1st. Se activa el ciclo de reproducción de las células y se las Precipitación de α-32P dATP’s
expone a α-32P dATP’s por 1,5 minutos. PULSE 6
precipitado/TCA
¿Cómo se si se están incorporando? Para corroborar, se
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precipita el DNA con sales, acido TCA a diferentes pH, los
32P
dNTP’s no precipitan y mido la precipitancion de α-32P
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dATP’s que se va con el DNA
2º. Se diluye la solución con dNTP’S sin marcar y se precipita 0
con TCA CHASE
Resultados
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Se realiza para ver si hay fragmentos de okazaki ya que estos se separan por masa relativa en condiciones desnaturalizantes (urea).
Se puede apreciar en el carril de PULSE la presencia de fragmentos cortos de okazaki que en la calle de CHASE se reintegraron.
Electroelución de fragmentos de okazaki y DNA de alto PM
Se realiza para verificar la cantidad de fragmentos de okazaki. Para esto, los geles
de corrida se cortan en fracciones iguales y se meten en el controlador de
centelleo:
Se puede observar que el área gris corresponde a DNA de alto PM y luego de esta
área aparecen los fragmentos de okazaki.
Inmunoprecipitación de DNA naciente con anticuerpos anti-BrDU
Se realiza para descartar el DNA parental no marcado que puede interferir con la hibridación siguiente, para esto:
1. Se utiliza un AC anti-5BrU que se une a los dNTP’s marcados
2. Se usa un segundo anticuerpo AC, anti la parte constante del primero, unido a la bolita de sefarosa.
3. Se realiza una centrifugación diferencial donde precipitan los dNTPS’s marcados.
Distribución de los fragmentos de okazaki en el gen DHFR
Se realiza para buscar la secuencia específica del OBR, se sabe que esta se encuentra cerca del gen DHFR el cual está clonado.
cH2, cSC26, c11-45, cPA36 son segmentos
de DNA insertos en el cósmido y se sabe su
lugar pos superposición.
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3. ¿Cómo se hace esto?
1º. Se debe comprobar si en CHOK1 también se da que el OBR se encuentra cerca del gen DHFR, para esto se marcan los
fragmentos de okazaki en la fase S y se hibridan con un cósmido que posee secuencias que se extienden en la región
genómica que tiene el gen DHFR.
Los fragmentos de okazaki que no son atrapados por
los cósmidos, corresponden a otro gen
La mayor hibridación fue en cSC26 por lo que se
concluyo que este cósmido posee la secucia genómica del
OBR porque los fragmentos de okazaki se generan al
inico de la replicación y por lo tanto tendrán secuencias
homólogas al OBR
2º. Se debe comprobar en qué hebra se encuentran los fragmentos de okazaki (en la adelantada o en la retrasada) para esto se
usa un vector de clonado, el fago M13 (ssDNA) ya que en su forma replicativa es similar a un plásmido.
DNA de CHOK1
E E B
5’ 3’
3’ 5’
Se corta con enzimas de restricción como E, B y se lo pone en contacto con el vector al cual se le introdujo previamente un sitio
poli-linker. Se obtienen las dos orientaciones en diferentes fagos, se los pone en tubos separados y se realiza un DOT BLOT
(confirma la presencia o ausencia de una biomolécula).
MCS
M13
Esta transición entre presencia y ausencia de
fragmentos de okazaki define el OBR entre C y
D
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