Este documento describe un estudio sobre la proteína cisteína proteasa 3 (AcCP3) de Acanthamoeba castellanii. Se expresa y purifica la proteína recombinante rAcCP3 y se determina su capacidad para degradar proteínas del huésped mediante SDS-PAGE y zimografía. También se analiza la expresión génica de AcCPs mediante qRT-PCR y se evalúa la citotoxicidad de los trofozoitos en células epiteliales de la córnea humana mediante microscopía. Los resultados ayud

1. Melissa Rodriguez
Samuel Salgado Uribe
Tercer semestre de medicina
universidad pontificia bolivariana

2. Acanthamoeba castellanii
● What is it?: free-living amoeba, that have two forms
○ trophozoite: good environment
○ cyst: bad environment, and is a cause of disease
● what does it produce?: infections
○ Acanthamoeba keratitis in humans
○ granulomatous amoebic encephaliti

3. cysteine protease 3
cysteine proteases (AcCPs) belonging to the cathepsin L-family Many protozoa use CPs for nutrient
uptake, host infection, tissue invasion and environmental adaptation

4. general purpose
This study examines pathogenic Acanthamoeba cysteine proteases (AcCPs)
belonging to the cathepsin L-family and explores the mechanism of AcCP3
interaction with host cells.

5. Expresión, purificación y replegamiento de proteína Ac CP3 recombinante
● Fundamento de la prueba
Permite la purificación por afinidad de proteínas de un amplio rango de pesos moleculares, promueve la
solubilización de proteínas con tendencia a formar cuerpos de inclusión y no interfiere con el plegamiento
normal de las proteínas, preservando su actividad biológica.
● ¿Para qué se hizo?
se quería obtener una enzima recombinada, la r Ac CP3 para obtener el péptido maduro con actividad hidrolítica

6. SDS-PAGE.
● Fundamento de la prueba
○ es una electroforesis especializada en separar las proteínas por peso molecular
● ¿Para qué la hicieron?
○ para separar la proteína rAcCP3
○ determinar la actividad de degradación de rAcCP3 en el colágeno albúmina y hemoglobina
○ es la técnica de entrada para el western-blot

7. Ensayos de transferencia Western
● .Fundamento de la prueba
○ Es una prueba que se basa en la identificación de la reacción antigeno-anitcuerpo por medio
de electroforesis en gel a proteínas y posteriormente se identifican por medio de un
anticuerpo.
● ¿Para qué la hicieron?
○ se usaron para mirar los estados de activación de Raf, Erk y p53 en las HCEC

8. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
● Fundamento de la prueba
○ aumentan de número un segmento específico de
DNA usando la DNA polimerasa.
● ¿Por qué la hicieron?
○ analizar el nivel de expresión de AcCPs

9. resultados (SDS-PAGE)
Replegamiento de r Ac CP3 y degradación
de proteínas del huésped
(SDS-PAGE)

10. zimografía
● Los carriles 1 y 4 son trofozoítos salvajes
● Carril 2 demostró inhibición con la enzima
PMSF
● Carril 3 no demostró inhibición la enzima
EDTA
● Los carriles de 5-8 demostraron inhibición
con el NEM dependiendo de la
concentración
● El carril 9 tenía trofozoítos con ARNip de
control negativo que no presentó
inhibición

11. western blot
La actina se usa como control de prueba
porque está presente en todas las líneas
celulares

12. Microscopía
● HCEC
● las flechas marcan los huecos de las
células muertas
● Entre el 2 y el 3 no hubo mayor diferencia
en la citotoxicidad de los trofozoítos.
● entre 3 y 4 hubo disminución de la
citotoxicidad de los trofozoítos

13. discussion
Sajid M, Mckerrow JH “They are also an important
virulence factor for
parasites”
Mazur T, Hadas E Long-term sterile passage
culture of Acanthamoeba
trophozoites in vitro may
reduce the toxicity of the
trophozoites
Chusattayanond AD, Et al Acanthamoeba-induced host
cell apoptosis is associated
with mitochondrial
overexpression of pro-
apoptotic proteins

14. conclusions
● the different techniques of molecular biology help to understand and analyse
how the Acanthamoeba castellanii interacts and reacts with our body
● the study of the functioning of the Acanthamoeba castellanii can help to
develop effective medical treatments
● With the study of the Acanthamoeba castellanii it helps us to invent a way in
which we could prevent the infection of this parasite and how to avoid that
extreme consequence

15. Queratitis
¿Qué es?
● Enrojecimiento ocular
● Dolor ocular
● Exceso de lágrimas u otra
secreción ocular
● Dificultad para abrir el párpado a
causa de dolor o irritación
● Visión borrosa
● Visión disminuida
Síntomas
La queratitis
infecciosa puede
producirse por
bacterias, virus,
hongos y parásitos
Es una inflamación
de la córnea (el
tejido transparente y
con forma de domo
que se encuentra en
el frente del ojo y
cubre la pupila y el
iris
La queratitis no
infecciosa puede
producirse por una
lesión
relativamente
menor, por el uso
de lentes de
contacto durante
períodos largos o
por la presencia de
cuerpos extraños
en el ojo.

16. mapa conceptual meli