Los microarreglos de DNA son conjuntos ordenados de genes en una pequeña superficie que permiten analizar la expresión de múltiples genes. Los microarreglos se imprimen usando robots que depositan muestras de DNA en una superficie. Luego, el RNA se extrae de las muestras, se marca con fluoróforos y se hibrida en el microarreglo, el cual es leído para cuantificar la expresión génica. Los microarreglos pueden usarse para comparar la expresión génica entre muestras normales y enfer

1. MICROARREGLOS DE DNA
BIOLOGIA MOLECULAR
DRA. MA. DE LA LUZ MIRANDA BELTRÁN
Mayra Janeth Hernández González
Octavio Yair Robles Meléndez
Fernando Daniel Rosas Reyes
UNIVERSIDAD DE
GUADALAJARA
CU LAGOS

2. ¿QUE SON LOS MICROARREGLOS?
 Es un conjunto ordenado
de genes en una pequeña
superficie (10,000
muestras por cm2). Los
microarreglos de DNA son
una nueva herramienta de
la biología molecular y las
ciencias genómicas.

3. SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
 La secuenciación sistemática de los genomas
completos y los avances en la síntesis
artificial de DNA, ya sea por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), o la síntesis
química de desoxioligonucleotidos,
actualmente es posible obtener en el
laboratorio el genoma completo de un
organismo, generando cada uno de los
marcos de lectura abierta completos o
fragmentos de cada uno de ellos.

4. SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
 Actualmente se pueden
adquirir las colecciones
completas de los genes
de varios organismos
como: Humano,
Arabidopsis thaliana,
Saccharomyces
cerevisiae y E. coli.

5. SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
Arabidopsis thaliana E. coli.

6. IMPRESIÓN DE MICROARREGLOS
 En la actualidad existen varios tipos de
impresores para los microarreglos y los
podemos separar en dos clases principales:
 Los de contacto
 Los piezoeléctricos
Estos últimos son tecnologías muy recientes y no
abundaremos en ellos

7. IMPRESORES DE CONTACTO
 Son los más económicos; su uso es
relativamente sencillo y no se requiere una gran
infraestructura para fabricar microarreglos de
DNA con estos equipos.
 Básicamente se trata de un brazo robótico con
movimiento en los ejes X, Y y Z y su
característica más importante es, poderse
desplazar en cualquiera de estas direcciones con
una resolución de una décima de milímetro

8. Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto. En este tipo de
robot la superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las
laminillas (b), se desplaza en las direcciones X y Y, mientras que la cabeza
con los aplicadores (d) sube y baja, depositando las muestras , siguiendo el
eje Z.

9. Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto. En este tipo de robot
la superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las
laminillas (b) es fija, mientras que la cabeza con los aplicadores (d) es un
brazo mecánico con movimiento en las tres direcciones (X, Y y Z).

10. IMPRESORES DE CONTACTO
 Los robots impresores de contacto cuentan
con una cabeza en la que se pueden colocar
de 1 a 48 aplicadores.

11. APLICADORES DE CONTACTO
 Los aplicadores, son
pequeñas agujas con una
ranura en la punta similar a
la punta de una pluma
fuente y al igual que en
ésta, la muestra se toma y
se deposita por
capilaridad. Los
aplicadores más comunes
tienen una capacidad de
0.25 μl y pueden hacer al
menos 100 aplicaciones,
es decir 0.0025 μl por
aplicación.

12. ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION
DE LOS MICROARREGLOS
 De la biblioteca genómica que se desea imprimir
se debe tener la mayor cantidad de información de
cada gen y esta información tiene que estar
ordenada en una base de datos;
 El DNA que se va a imprimir, debe tener la misma
calidad que se requiere cuando se va a
secuenciar;
 La cantidad de DNA de cada muestra debe ser la
misma y en una solución con un contenido
especifico de sales.
 Controlar la humedad y la temperatura

13. ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION
DE LOS MICROARREGLOS
 Una vez impresas las laminillas, el DNA
debe ser fijado a la superficie. Esto se
puede lograr horneando los microarreglos
a 80°C por cuatro horas o con un
entrecruzador de luz ultravioleta.
Adicionalmente se delimita la región donde
se encuentra el microarreglo y se identifica
cada laminilla, ya sea con un código de
barras o un numero se serie.

15. OBTENCION DE RNA
 El aislamiento del RNA para su utilización en
microarreglos, se deben tener en cuenta los
siguientes aspectos:
 Obtenerlo lo más concentrado posible;
 Que la banda ribosomal grande sea al menos dos
veces mas que la banda pequeña (este relación nos
permite tener una idea de la integridad del mRNA);
 Se requieren al menos 30μg de RNA total para
realizar un experimento;
 No se requiere aislar el RNA mensajero y puede no
ser importante la presencia de DNA genómico.

16. OBTENCION DE RNA
Fotografía de RNA total de levadura, corrido en un gel
desnaturalizante de agarosa 1%.

17. MARCADO DE RNA
 Para el marcado del RNA se utiliza la síntesis invitro de
cDNA de cadena sencilla.
 Se coloca el RNA total junto con un deoxioligonucleótido
poli T y un conjunto de hexámeros al azar, permitiendo
que reconozcan sus sitios en el RNA mensajero.
 Posteriormente se agregan los deoxinucleótidos A, C, G
y T, mas una proporción de deoxinucleótido T marcado
con una molécula fluorescente.
 A la mezcla se agrega transcriptasa inversa que sintetiza
el cDNA a partir del mRNA, incorporando el
deoxinucleótido T marcado en dos reacciones estándar.
 Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar el
deoxinucleótido fluorescente no incorporado al cDNA y
se tiene la sonda marcada, lista para probarla en un
microarreglo.

18. MARCADORES FLUORECENTES
 dUTP-Cy3
 dUTP-Cy5
 dUTP-alexa3
 dUTP-alexa5
 También se pueden obtener los mismos
fluoróforos unidos a dCTP)

19. MARCADO DE RNA
Gel de electroforesis en el que se corrieron
RNA total y RNA mensajero, marcados con
los fluoróforos descritos.
Sondas marcadas con los fluoróforos Cy3 rojo y Cy5 verde, corridas en un gel
desnaturalizante de poliacrilamida de 12.5%.

20. LECTURA DE MICROARREGLOS

21. LECTURA DE MICROARREGLOS
En los lectores con
cámaras digitales se
registra la imagen
fluorescente como si
se tomara una
fotografía común.

22. LECTURA DE MICROARREGLOS
 Lectores confocales hacen la
reconstrucción de la imagen
utilizando los principios de la
microscopía confocal, que
consiste en la utilización de
fotomultiplicadores para
registrar la señal
 Permiten obtener una imagen
de muy alta resolución

23. LECTURA DE MICROARREGLOS
 En dos tipos de lectores se utiliza un láser para
excitar las moléculas fluorescentes unidas al
cDNA y poder obtener la imagen de cada una de
las muestras contenidas en el microarreglo.
 Este procedimiento se hace para cada uno de los
fluoróforos obteniéndose dos imágenes
 Para la obtención de estas imágenes se debe
ajustar la intensidad del láser y la sensibilidad de
la cámara o de los fotomultiplicadores, de tal
forma que ambas imágenes den valores
semejantes de fluorescencia total.

24. LECTURA DE MICROARREGLOS

25. LECTURA DE MICROARREGLOS

26. LECTURA DE MICROARREGLOS
 Para este experimento se marcó la muestra
experimental en rojo y la control en verde, todos
aquellos puntos que se ven rojos o tonalidades
anaranjadas, pueden ser interpretados como
genes que aumentaron su expresión.
 Los puntos verdes o tonalidades entre el amarillo y
el verde serán aquellos genes que disminuyeron
su expresión. Y finalmente los puntos amarillos
representan a los genes que en ambas
condiciones se expresan de igual forma.

27. LECTURA DE MICROARREGLOS
Cámara de hibridización para microarreglos

28. LECTURA DE MICROARREGLOS
Fluorescencia para un microarreglo hibridizado con una sonda marcada
con dUTP-Cy3 (rojo) y una sonda marcada con dUTP-Cy5 (verde).

29. LECTURA DE MICROARREGLO
Combinación
de
microarreglo

30. CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
 Para la obtención de los valores cuantitativos
de cada una de las señales de fluorescencia
contenidas en el microarreglo, se requiere
del análisis de las imágenes y de programas
de computo

31. CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS

32. CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
 Se debe considerar la aplicación de un
filtro para depurar la imagen de pequeñas
imperfecciones o señales no deseadas que
pudieran encontrarse entre las muestras.
 Posteriormente se genera una retícula en
la que se definen las áreas que se van a
cuantificar

33. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
En el cuadro dentro del circulo amarillo,
está la zona para obtener la densidad
real, entre el
circulo amarillo y el azul está la zona no
considerada y entre él circulo azul y el
rojo la zona
para determinar la señal de fondo.
Cuantificación de la señal de
un microarreglo, definición y
ajuste de la retícula.

34. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
 Definidos estos parámetros el programa
calcula la densidad de los pixeles en cada
área definida, dando como resultado una
tabla con las coordenadas, los valores de
densidad, fondo y señal para cada una de
las muestras en el microarreglo

35. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
Las primeras cuatro columnas corresponden a las coordenadas de cada gen en el
microarreglo y estas coordenadas nos permiten relacionar ambas tablas

36. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS

37. EJEMPLO DEL USO DE LOS
MICROARREGLOS DE DNA
 Estudio con microarreglos de cáncer cérvico uterino. De una paciente
con diagnóstico de cáncer cérvico uterino se obtuvo un fragmento de
biopsia fresca y sin incluir en parafina. También se consiguió una
muestra de la misma región de tejido de una paciente sana (de cadáver)
manteniendo las mismas condiciones para ambas muestras.
 De las muestras se aisló el RNA total y se marco (comúnmente se
marca la sonda control con el fluoróforo Cy5 y la experimental con Cy3).
Ambas sondas marcadas, se juntaron y se hibridizó un microarreglo con
10,000 de los genes mejor identificaos en el humano.
 De la lectura de este microarreglo se obtuvieron las imágenes y se
cuantificó la señal de fluorescencia para cada sonda. Con los datos
obtenidos se obtuvo la grafica de fluorescencia, donde se puede
comprobar que los valores de fluorescencia son simétricos, lo que
significa que tanto la reacción de marcado así como la hibridización y la
lectura del microarreglos son correctos.

39. IMAGEN OBTENIDA DE MICROARREGLO
Fragmento del microarreglo hibridizado, en donde vemos la señal de
fluorescencia de Cy3 (rojo) para el RNA de la biopsia del paciente
enfermo (C); la señal de fluorescencia de Cy5 (verde) para el RNA sin
cáncer (N) y la combinación de ambas imágenes para ver la relación
(C/N). A estas imágenes se hizo el procedimiento previamente
descrito para obtener los valores numéricos.

40. TABLA OBTENIDA DE MICROARREGLO
Grafica del logaritmo de la señal “N” eje X contra la señal “C” eje Y. Se
observa que ambas señales se ajustan a una recta con un coeficiente de
0.9986, lo que indica un buen marcado, hibridización y lectura

41. CONCLUSIÓN
 Un microarreglo es una distribución ordenada de
genes en una pequeña superficie, y mediante con
hibridación con el ADN problema se puede
obtener respuesta instantánea de la actividad o la
expresión de múltiples genes en un solo análisis.
 La intensidad de la fluorescencia es directamente
proporcional al nivel de expresión del gen.
 La interpretación de los marcajes indicara un
patrón de colores, así cada punto en el soporte del
microarreglo se asocia con el gen localizado
según su color

42. GRACIAS POR SU ATENCION