Seminario: Variación en el número de copias de los componentes genéticos humanos C4A y C4B, como factores de riesgo a diversas enfermedades
•
2 recomendaciones•1,169 vistas
Seminario ofrecido en la UPR-Arecibo sobre la investigación realizada, en colabotación con el Dr. Dorak (Universidad Internacional Florida). La misma se llevó a cabo el 2 de agosto de 2011.
Más contenido relacionado
Destacado
Destacado (13)
Similar a Seminario: Variación en el número de copias de los componentes genéticos humanos C4A y C4B, como factores de riesgo a diversas enfermedades
Similar a Seminario: Variación en el número de copias de los componentes genéticos humanos C4A y C4B, como factores de riesgo a diversas enfermedades (20)
Último
Último (20)
Seminario: Variación en el número de copias de los componentes genéticos humanos C4A y C4B, como factores de riesgo a diversas enfermedades
- 1. Variación en el numero de copias de los componentes genéticos humanos C4A y C4B, como factores de riesgo a diversas enfermedades. Michelle Marie Torres Santos BIOL-3909-L10
- 3. Complejo Mayor de Histocompatibilidad • Es una familia de genes ubicados en el brazo corto del cromosoma 6 cuyos productos están implicados en la presentación de antígenos a los linfocitos T • En humanos, los 3,6 Mbp de la región MHC del cromosoma 6 contiene 140 genes. • Es la región más densa en genes y más polimórfica del genoma de los mamíferos. • Sector del genoma que contiene los genes que determinan la compatibilidad de tejidos entre individuos
- 4. Antígeno de Leucocito Humano (HLA) Cooke & Hill: Genetics of susceptibility to human infectious diseases Nature Reviews Genetics 2001;2:967-977 (www)
- 5. Modulo RCCX • Está localizado en el área central del mapa del complejo HLA. • RCCX: – RP (STK19) – C4 (Componente 4) – CYP21 (21-hidroxilasa) – TNX (Tenascina X)
- 6. Modulo RCCX
- 7. Componente 4 del Complemento • Se divide en dos isomorfos: C4A y C4B – C4A: • Es uno de los mas fuertes factores de riegos genéticos asociados con enfermedades autoinmunes. – C4B: • Aumenta la susceptibilidad a infecciones virales o bacterianas.
- 8. Importancias Médicas de los genes complementarios • C4A: – SLE – Esclerosis sistémica – Enfermedad de Graves • C4B: – Infartos miocárdicos – “Stroke” – Meningitis bacterial – Bacteriemia
- 10. Real Time- Polimerase Chain Reaction • qPCR- PCR cuantitativo. • Basada en el PCR convencional. • Ampliar y cuantificar una molécula de DNA blanco. • Dos métodos de qPCR: – Colorantes no específicos que se intercalan en cualquier doble hélice del ADN. – Sondas de ADN específicas para una secuencia que consisten de oligonucleótidos rotulados con reporteros fluorescentes que permiten la detección solo luego de la hibridación de la sonda y blanco de DNA complementario
- 11. Real Time- Polimerase Chain Reaction
- 12. Instrumento de q-PCR • Termociclador • Fuente de luz • Cámara • Computadora
- 13. Otros Términos • 10-fold dilution 10n1n100p10p1p – Triplicados • Valor Ct = Ciclo Umbral (Cycle Threshold) • Genes Normalizadores o de Referencia RNaseP y TERT • TaqMan: proviene de Thermus aquaticus – Tres pasos:
- 14. Metodología
- 15. Metodología 3) Se analizaron la línea de células de referencia de IHW para determinar los polimorfismos de los genes del HLA. • Se analizaron 101 muestras. • Se compararon con artículos científicos anteriores, para reforzar nuestros resultados. 4) Repeticiones
- 16. Cell Line Pannel
- 18. Dilución
- 20. Validaciones TaqMan CNV Assay C4A 40.00 35.00 30.00 25.00 Ct 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Slope = -3.407 Log dilution Efficiency = 96.6% y-intercept = 40.0 r2 = 1.00
- 21. Validaciones TaqMan CNV Assay C4B 40.00 35.00 30.00 25.00 Ct 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Slope = -3.202 Log dilution Efficiency = 105.3% y-intercept = 39.2 r2 = 0.995
- 22. Validaciones TaqMan CNV Assay RNAP 40.00 35.00 30.00 25.00 Ct 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Slope = -3.480 Log dilution Efficiency = 93.8% y-intercept = 41.1 r2 = 0.99
- 23. Validaciones TaqMan CNV Assay TERT 40.00 35.00 30.00 25.00 Ct 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Slope = -3.517 Log dilution Efficiency = 92.5% y-intercept = 40.9 r2 = 0.998
- 24. TaqMan CNV Assay for C4A and C4B Genes
- 25. Ejemplos de los CNV’s de C4A Bimodular C4A = RNAP Trimodular 3 C4A = 2 RNAP
- 27. Tabla de la variación en numero de copias
- 30. Conclusión qPCR es practico, reproducible, especifico, efectivo para la detección del numero de copias de los genes C4A y C4B y puede ser utilizado rutinariamente. Es fácil de realizar, requiere poca cantidad de ADN y no depende de su calidad.Métodos alternos conllevan a poca fiabilidad de los resultados, consumo de tiempo y ambigüedades. Se confirma que no se ha encontrado concretamente una relación directa entre la deficiencia de los componentes C4A y C4B y los polimorfismos en su vecindad, que ocasionan una enfermedad en específico.
- 34. Resumen • La deficiencia en los componentes 4 del sistema de complementos es un factor de riesgo o marcador proximal del factor de riesgo a diversas enfermedades. • Hay tres formas comunes de numero de copias del RCCX: – Trimodular – Bimodular – Monomodular • Aun no se ha demostrado que hayan relaciones directas entre un SNP y la deficiencia de uno de los isomorfos del gen C4. • qPCR es el método de identificación de la deficiencia de C4A y C4B mas efectivo, preciso, fácil y reproducible.
Notas del editor
- En cuanto a los seres humanos, el descubrimiento del MHC humano, se le llamó HLA (Human leukocyteantigen).Se determina con este nombre porque en algunos de sus experimentos se determinó que los pacientes que rechazan los trasplantes de riñón presentan elevadas concentraciones de anticuerpos en el suero dirigidos hacia los Leucocitos del donante. Este suero reacciona en contra de células de individuos con expresión de alelos diferentes y se dice que contiene anticuerpos dirigidos contra al trasplante que el cuerpo determina como antígenos. Se supuso que, al igual que en los ratones estos eran genes polimórficos, que variaban de un individuo a otro. Por lo tanto, se estudiaron a familias completas en busca de armar el mapa del locus del HLA.Los primeros genes que se descubrieron, fueronexclusivamente por pruebas serológicas. Estos fueron HLA-A, HLA-B y HLA-C. Luego a través de técnicas de “Reacción leucocitaria mixta” (MLR) se vio que, los leucocitos del receptor reaccionaban frente a los leucocitos del donante, y se descubrió un gen adyacente al locus del HLA, por lo que se denomino HLA-D, luego se identifico a la molécula de este gen y se la bautizo HLA-DR (HLA-D related ). Finalmente se descubrieron dos genes más y se los llamaron HLA-DQ y HLA-DP, y asi sucesivamente.Así los genes identificados en el rechazo a injertos en los ratones y los identificados serológicamente en humanos (HLA-A, HLA-B, HLA-C) se los agrupa bajo el nombre de genes de clase I.Los genes de la respuesta inmunitaria de los ratones y los genes humanos detectados por MLR (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR) se conocen como genes de clase II.Todos estos genes, se encuentran ubicados en el brazo corto del cromosoma 6 y son importantes en la respuesta inmunológica, pero que no tienen nada que ver con los genes del HLA, se agrupan en la clase III.En esta clase III, es donde se encuentran los genes de mi interés. Como podemos observar se encuentran varios componentes complementarios, los cuales han sido estudiados extensamente por sus productos y relación de importancia médica.
- RP: Gen que simplemente coincide con pertenecer a la vecindad del grupo central del HLA clase III. En un principio era conocida como RP pero en el 2008 se modifico su nombre a STK19 (serine/threoninekinasa 19). Este gen codifica para serine/threoninekinase la cual es una enzima que se localiza predominantemente en el núcleo. Su función especifica es desconocida, pero según estudios es posible que tenga que ver con la fosforilización de las proteínas envueltas en la regulación transcripcional. - S-serina - T- threonine - K- kinase 19CYP21: -CY- cytochrome -P- de P-450 -21- de 21-hidroxilasaCYP21 = 21-hidroxilaza: enzima del Citocromo P450. Sus proteínas están mono-oxigenadas, lo cual cataliza muchas reacciones envueltas en el metabolismo de drogas y síntesis de colesterol, esteroides y otros lípidos. Se encuentra en el retículo endoplásmico y cataliza la hidroxilación de esteroides en la posición 21 (Añade -OH). Su actividad es requerida para la biosíntesis de las hormonas esteroides: aldosterona y cortisol. - Un defecto en CYP21 causa una perturbación en el desarrollo de la enzima. Esta deficiencia ocasiona Hiperplasia adrenal congénita, lo que indica que la persona no puede producir hormonas esteroides como la aldosterona y cortisol; y producen demasiado androgeno.TNX: -TNX- Tenascina X Tenascina es una familia que contiene tenascina: C (tendones, cartílagos y huesos), R (sistema nervioso), X (tejido conectivo suelto) y W (se encuentra en los riñones y formación de los huesos)El gen TN-X produce una glicoproteína expresada en los tejidos conectivos incluyendo la piel, articulaciones y músculos. Sus proteínas tienen como una de sus funciones la maduración de la matriz durante la curación de una herida. La deficiencia de este gen ocasiona el síndrome Ehlers-Danlos tipo 3, que se conoce como hipermovilidad, donde se altera la estructura producción o el proceso del colágeno o las proteínas que interactúan con el colágeno, ocasionando que la densidad del colágeno sea reducida y las fibras elásticas sean fragmentadas.C4:Componente 4 del sistema de complementos, el cual se divide en dos C4A y C4B y como bien dice mi tema tiene asociaciones con diversas enfermedades dependiendo del isotopo y en el numero de copia que tenga.
- Aquí se muestra las variaciones modulares en los humanos de los complementos C4 en el modulo RCCX.Bimodular: Es el numero de copias del gen mas común, aproximadamente un 70% del cromosomas 6 en los humanos contiene este arreglo de un C4A y un C4B. Esta numero de copias también puede darse como 2 C4A o 2 C4B, lo cual es menos normal y conllevaría las consecuencias de la deficiencia de uno de los genes.
- Se diferencian solo en 5 nucleótidos.Aunque ambos son isoformosproducen proteínas completamente distintas las cuales tienen diferentes funciones y provocan enfermedades que no tienen relación en ningún aspecto.C4A (acídica): La primera enfermedad autoinmune que sedescubrió en el 1974 y fueSLE. Un 75% de los sujetos humanos con SLE están completamente deficientes de C4A. Otra enfermedad con la que se le asocia es con Diabetes tipo 1 (la que es dependiente de insulina). Todas las enfermedades son autoinmunes debido a que este gen produce proteínas C4A que tiene una función vital en unirse efectivamente a un grupo de aminoácidos de un substrato de una proteína o un complejo inmune, ayudando de esa manera la formación del complejo inmune que promueve la autoinmunidad.{Su asociación con diabetes tipo I y no con la II: La deficiencia deC4A es asociada solo con la diabetes tipo 1 probablemente porque siempre se encuentra como factor de riesgo en el haplotipo de diabetes. Por lo tanto, es probable que no sea una asociación casual pero si una asociación por correlación. (puede se un marcador cercano (o como en ingles se le conoce un “proxy marker” de un marcador del riesgo real).}C4B (básica): Una persona que tiene deficiencia del gen C4B se ha asociado con enfermedades favorecidas por la susceptibilidad a bacterias y virus como la bacteriemia, esta deficiencia de igual modo se encuentra significativamente presente en los pacientes con autismo y ha comprobado que estas personas tienen menor expectativa de vida. La proteína que produce tiene un rol central en la activación de la ruta clásica del sistema de complementos, es el producto de mayor activación y la subunidad esencial de las enzimas C3 convertasa y C5 convertasa. Estas uniones de proteínas con enzimas ayudan o complementan a la habilidad de los anticuerpos y celulasfagociticas a eliminar patogenos de un organismo o celula. Esto es lo que llamamos nuestro sistema inmune innato y de tener deficiencia en cualquiera de estos componentes vamos a ocasionar una anormalidad en la cadena de este sistema complementario y dependiendo del complemento en especifico es que vamos a poder ver las asociaciones con las distintas enfermedades.
- SLE = “systemic lupus erythematosus” o Lupus Sistémico EritematosoEsclerosis sistematica: Se puede determinar como un proceso de cicatrización de heridas no controlado. Enfermedad del tejido conectivo que se caracteriza por engrosamiento y fibrosis de la piel y que compromete a órganos internos como el tracto gastrointestinal, pulmón, corazón y riñón. Depósito ininterrumpido de matriz extracelular, en especial fibras de colageno que mantienen una rigidez y engrosamiento de la piel, puede ocurrir en la íntima de los vasos sanguíneosy en el fluido intersticialde la piel por fibroblastos activados. Un “stroke” es el termino general para indicar un accidente cerebrovascular, donde se desarrolla rápidamente la perdida de las funciones cerebrales por la perturbación en el flujo sanguíneo hacia el cerebro. Esto puede deberse a isquemia (falta de flujo de sangre), un bloqueo (como una trombosis o embolia arterial) o una hemorragia (donde se pierde sangre y por ende disminuye el flujo sanguíneo). Como resultado las áreas afectadas del cerebro no funcionan y puede resultar en una inmovilidad de uno o mas miembros del cuerpo, inhabilidad de entender o formular una conversación o hasta solo ver por un lado del campo visual.
- Diferencia en el qPCR al PCR convencional: -Permite ver las medidas de fluorescencia de las amplificaciones del ADN durante el PCR, a tiempo real, de cada uno de los ciclos del PCR. -La data es analizada por un software de una computadora. -Determina la presencia y abundancia de una secuencia de DNA en particular. - Un solo nanogramo de ADN es suficiente para obtener resultados.Sonda: fragmento de AND pequeño utilizado como herramienta para detectar un pedazo de AND complementario a el que se desea y se une por medio de hibridación -Combinación de dos cadenas de nucleótidos anti paralelas, se unen con puentes de hidrogeno.Oligonucleótido: polímero de ácidos nucleicos corto.
- Como había mencionado le qPCR esta basado en el PCR convencional, por lo tanto conlleva los mismos tres pasos que al comienzo del PCR convencional: 1) Desnaturalización: La separacion de la doble helice de ADN por temperaturas alrededor de 94 a 98 grados Celsius. 2) Alineamiento (“Annealing”): La union de los cebadores o “primers” con las cadenas de ADN separadas. Esto ocurre de 50 a 65 grados Celsius, lo cual es una temperatura mas baja que la temperatura optima para DNA polimerasa. 3) Elongación: alargamiento de las cadenas utilizando un “primer” que estable al calor (Taq Polimerasa {Termusaquaticus}). Esto ocurre sobre los 70 grados Celsius**Las temperaturas pueden variar dependiendo de los “primer” que se utilizen**
- Termociclador para los cambios en temperaturas, necesarios para poder desnaturalizar, alinear y alargarlascadenas, cicloporciclo de maneraque se dupliquenconstantemente.Fuente de Luz para la exitacion de lassondas (probes) fluorescentes. La fuente de luzaplicadaesuna simple lampara de halogenoque se transmiteporuno de los cincofiltros de exitacionsobre la muestracompleta.Unacamaraqueestegrabando y tomando los resultados de cadaciclo. La camara se encuentraposicionadadebajo de la muestragrabando la flourescencia.Unacomputadora para manejar la maquina, almacenar y visualizar los resultados.La maquinaque se utilizó en el laboratoriodondetuve la oportunidad de llevar a caboesteprocesofueBioRad CFX96
- 10-folddilution: se hace para validación. Se organizan los datos en Excel para realizar diversos cómputos estadísticos de manera que se pueda comprobar la precisión no solo de la maquina, sino del técnico de laboratorio encargado de realizar las muestras y es necesario para proseguir con los resultados y tener con que apoyarlos.Ct : refleja el numero del ciclo en el cual la fluorescencia generada en la reacción cruza el limite o umbral. Refleja el punto durante la reacción donde el suficiente numero de amplicones se han acumulado. -Amplicones: es el pedazo de AND formado como producto ya sea natural o artificial de un evento de amplificación.El mismo esta relacionado con la cantidad inicial de ADN. Si ocurre una amplificación luego del valor Ct 40 se considera que no hubo amplificación, ya que demuestra que casi no contenía ADN al comienzo de la reacción.Hay dos métodos de cuantificar: 1) Cuantificación absoluta: en la cual se llega al numero exacto de moléculas del ADN blanco. Esto se hace mediante comparación con otras moléculas de ADN donde ya se le conoce su tamaño. 2) Cuantificación Relativa: es basada en los genes de referencia internos los cuales por diferencias en el valor Ct se puede determinar la expresión del ADN deseado.Genes Normalizadores o de referencia: son aquellos en el cual se le conoce cuantas copias se encuentran por genoma haploide o diploide. -RNaseP: Ribonucleasa P -TERT: Telomerasa Transcriptasa Reversa **Ambos se encuentran en dos copias por genoma diploide**Sonda TaqMan: una sonda especifica doblemente rotulada diseñada para unirse a una secuencia blanco. Contiene un reportero fluorescente que es un tinte en el terminal 5’.polimerasa Taq: Es una DNA polimerasa resistente al calor, proviene del microorganismo TermusaquaticusEs una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente. Fue descubierta en una fuente del Parque Nacional Yellowstone, en Wyoming, EU. Es Gram-negativa, aerobica y heterótrofa. Su temperatura optima es de entre 50 – 80 grados celsius, resistes gracias a sus enzimas. Su vida media a 95 grados Celsius es de 40 minutos.Tres pasos de TaqMan: 1) Desnaturalizacion: se separan las cadenas de ADN 2) Se pega el “probe” o la senda de TaqMan, se hibridiza 3)Viene Taq polimerasa y alarga la cadena y desintegra el terminal 5’ liberando el reportero de fluorescencia lo cual lo captura la camara y se obtienen los valores.
- Estas se encontrabancomercialmentedisponible en la linea de celulaspredeterminadas. Por lo tanto no lascultivamosnosotrosmismos en el laboratorio, lo quehicimosfuecomprar el ADN extraido. Este panel de linea de celulasconsistia de muestras de HLA homozigoto. Este panel pertenecia al IHW (International Histocompatibility Workshop)17 microlitros de mastermix y 3 microlitros de ADN para obtenermejorpresicion de los resultados.
- 1) 95- 2 min2) 95- 5 seg. - desnaturalización3) 61- 5seg. – alineamiento y elongación *Paso 2 y 3 50 veces
- FaseExponencial:
- El rango del porciento de eficiencia ideal es de 90-110%La pendientedebeestardentro del rango de: -3.1 a -3.6 Siendo -3.32 El valor con unaeficiencia de 100%EL intercepto en y mientras mas cercano a 40 mejor.Por ultimo la r al cuadradodebeestarcerca de 1.n=numero de observacionesRxi= numero de valores de xRyi= numero de valores de y
- -3.36
- -3.36
- -3.36
- -3.36
- Lassendas o “probes” se rotularoncomo FAM (el azul), mientrasque los genes de referencia se rotularoncomo HEX (el verde)En esteejemplopodemosverquetodos los genes tienen 2 copiasporgenomadiploide.
- Estos son dos ejemplos mas, diferentes, donde en el primero se puedever lo que les explique al cominzoque era un bimodular. Podemosvercomo el valor Ct del gen de referencia, quecomo les habiadicho, existecomo 2 copiasporgenomadiploide, esigual al valor Ct del C4AAhora, abajo hay un ejemplo del trimodular, donde se sabequees asi de igual forma comparando los valores Ct.
- Además de identificar el numero de copias de C4A y C4B, mencioné que genotipamos algunos polimorfismos para identificar si había relaciones entre un SNP y la eliminación del componente complementario 4A o 4B. Se basa en el análisis por diferencias en el ciclo umbral o por el punto final de fluorescencia para cada alelo. Los resultados se muestran por intensidad de fluorescencia.
- Cualquier método alterno para la cuantificación de la variación en el numero de copias requiere el procedimiento normal de PCR seguido por una gel electroforesis donde se dividen por peso las diferentes proteínas, lo cual no es de alta resolución, no es muy preciso, sus resultados no son numéricos, tiene poca sensitividad, entro otras cosas que ya lo colocan en desventaja, sin mencionar el tiempo que toma y no se pueden saber los resultados hasta que culmine su trayecto completo. Luego le siguen diferentes técnicas como por ejemplo: - Southernblot: luego de la gel electroforesis se hace una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridacion de la sonda. Luego el exceso de sonda es lavado con un buffer para que la membrana pueda ser obsdervada por rayos x, autoradiografia o por el desarrollo de color en la membrana si se utiliza un metodo de deteccioncromogenico