El documento describe las tecnologías de RT-qPCR. La RT-qPCR permite la cuantificación cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos en tiempo real. La técnica implica la extracción de RNA, transcripción reversa a cDNA, y amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real para medir los niveles de expresión génica. La RT-qPCR ofrece mayor sensibilidad y rango dinámico que otras técnicas como la PCR convencional.
Este documento describe las ventajas y aplicaciones de la PCR en tiempo real. Permite la detección y cuantificación de ADN o ARN en cada ciclo de reacción a través del uso de reporteros fluorescentes. Esto ofrece una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con la PCR estándar. La PCR en tiempo real se ha convertido en una herramienta importante para aplicaciones de diagnóstico clínico, investigación biomédica y estudios de expresión génica.
La quimioluminiscencia es un método de detección basado en la emisión de luz producida por una reacción química. Se utiliza para determinar la presencia de analitos como anticuerpos y antígenos en muestras mediante el uso de micropartículas recubiertas y un conjugado marcado que producen una señal luminosa cuantificable. El documento describe los principios y aplicaciones de la quimioluminiscencia para pruebas infecciosas como VIH, hepatitis y sífilis.
Porfafolio de evidencias Laboratorio de BacteriologiaEmmanuelVaro
Práctica 1 Introducción al trabajo de laboratorio en bacteriología
Práctica 2 Aplicación de los criterios de Cowan y Steel para la
identificación de bacterias
Práctica 3 Caracterización de bacterias no fermentadoras
Práctica 4 Caracterización del género Pseudomonas
Práctica 5 Caracterización de bacterias de los géneros
Haemophilus y Brucella
Práctica 6 Caracterización de bacterias de los géneros
Neisseria y Moraxella
Práctica 7 Caracterización de enterobacterias: lactosas positivas
Práctica 8 Caracterización de enterobacterias: lactosas negativas
Práctica 9 Caracterización del género Vibrio
Práctica 10 Caracterización de bacterias de los géneros
Streptococcus y Enterococcus
Práctica 11 Caracterización de bacterias del género Staphylococcus
Práctica 12 Caracterización de Bacilos Grampositivos: Bacillus
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
Twitter.com/@bryanpriegop
Este documento presenta un resumen del seminario sobre la técnica de RTqPCR realizado en 2012. Describe las diferentes etapas de un experimento de RTqPCR, incluyendo la definición de la técnica, la terminología asociada, el flujo de trabajo con etapas como el diseño experimental, la preparación y extracción de muestras, la transcripción reversa, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y la validación y análisis de los resultados. El documento proporciona información fundamental sobre esta importante técnica de biolog
El documento describe la inmunofluorescencia, una técnica de biología molecular que utiliza anticuerpos marcados con moléculas fluorescentes para detectar antígenos o anticuerpos. Explica los tipos de inmunofluorescencia directa e indirecta y sus aplicaciones como el diagnóstico de enfermedades, detección de virus y observación de biopsias.
Este documento trata sobre urocultivos y su interpretación. Resume los métodos para obtener muestras de orina, predecir resultados de urocultivos usando microscopía y pruebas bioquímicas, e interpretar los cultivos cuantitativos de acuerdo a los recuentos bacterianos y tipo de muestra. Además, explica criterios para distinguir entre bacteriuria significativa y contaminación.
El documento trata sobre el sistema inmune y los inmunoensayos. Explica conceptos clave como antígeno, anticuerpo, respuesta inmune, clases de inmunoglobulinas y su importancia clínica. También describe el principio de los inmunoensayos, las fases de la reacción antígeno-anticuerpo y los factores que inciden en ella. Finalmente, detalla las aplicaciones clínicas de los inmunoensayos en el diagnóstico de enfermedades.
Este documento describe las ventajas y aplicaciones de la PCR en tiempo real. Permite la detección y cuantificación de ADN o ARN en cada ciclo de reacción a través del uso de reporteros fluorescentes. Esto ofrece una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con la PCR estándar. La PCR en tiempo real se ha convertido en una herramienta importante para aplicaciones de diagnóstico clínico, investigación biomédica y estudios de expresión génica.
La quimioluminiscencia es un método de detección basado en la emisión de luz producida por una reacción química. Se utiliza para determinar la presencia de analitos como anticuerpos y antígenos en muestras mediante el uso de micropartículas recubiertas y un conjugado marcado que producen una señal luminosa cuantificable. El documento describe los principios y aplicaciones de la quimioluminiscencia para pruebas infecciosas como VIH, hepatitis y sífilis.
Porfafolio de evidencias Laboratorio de BacteriologiaEmmanuelVaro
Práctica 1 Introducción al trabajo de laboratorio en bacteriología
Práctica 2 Aplicación de los criterios de Cowan y Steel para la
identificación de bacterias
Práctica 3 Caracterización de bacterias no fermentadoras
Práctica 4 Caracterización del género Pseudomonas
Práctica 5 Caracterización de bacterias de los géneros
Haemophilus y Brucella
Práctica 6 Caracterización de bacterias de los géneros
Neisseria y Moraxella
Práctica 7 Caracterización de enterobacterias: lactosas positivas
Práctica 8 Caracterización de enterobacterias: lactosas negativas
Práctica 9 Caracterización del género Vibrio
Práctica 10 Caracterización de bacterias de los géneros
Streptococcus y Enterococcus
Práctica 11 Caracterización de bacterias del género Staphylococcus
Práctica 12 Caracterización de Bacilos Grampositivos: Bacillus
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
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Este documento presenta un resumen del seminario sobre la técnica de RTqPCR realizado en 2012. Describe las diferentes etapas de un experimento de RTqPCR, incluyendo la definición de la técnica, la terminología asociada, el flujo de trabajo con etapas como el diseño experimental, la preparación y extracción de muestras, la transcripción reversa, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y la validación y análisis de los resultados. El documento proporciona información fundamental sobre esta importante técnica de biolog
El documento describe la inmunofluorescencia, una técnica de biología molecular que utiliza anticuerpos marcados con moléculas fluorescentes para detectar antígenos o anticuerpos. Explica los tipos de inmunofluorescencia directa e indirecta y sus aplicaciones como el diagnóstico de enfermedades, detección de virus y observación de biopsias.
Este documento trata sobre urocultivos y su interpretación. Resume los métodos para obtener muestras de orina, predecir resultados de urocultivos usando microscopía y pruebas bioquímicas, e interpretar los cultivos cuantitativos de acuerdo a los recuentos bacterianos y tipo de muestra. Además, explica criterios para distinguir entre bacteriuria significativa y contaminación.
El documento trata sobre el sistema inmune y los inmunoensayos. Explica conceptos clave como antígeno, anticuerpo, respuesta inmune, clases de inmunoglobulinas y su importancia clínica. También describe el principio de los inmunoensayos, las fases de la reacción antígeno-anticuerpo y los factores que inciden en ella. Finalmente, detalla las aplicaciones clínicas de los inmunoensayos en el diagnóstico de enfermedades.
Este documento trata sobre la resistencia antimicrobiana y el papel del laboratorio de microbiología. Brevemente describe los mecanismos de resistencia de los microorganismos, el uso indiscriminado de antibióticos y los tratamientos prolongados. También cubre temas como la selección de antibióticos, los diferentes tipos de antibióticos y cómo actúan, así como los mecanismos de resistencia a los antibióticos beta-lactámicos. Finalmente, explica el papel del laboratorio de microbiología en la identificación de patógenos
La Western Blot es una técnica que identifica proteínas del VIH mediante electroforesis y anticuerpos específicos. Se separan las proteínas del VIH y se transfieren a una membrana, donde anticuerpos revelan bandas coloreadas correspondientes a proteínas como p17, p24 y de envoltura. Los patrones de bandas permiten diagnosticar la infección por VIH de forma sensible aunque a veces los resultados son indeterminados debido a factores como la seroconversión.
La inmunofluorescencia es una técnica que utiliza anticuerpos unidos a sustancias fluorescentes para detectar moléculas específicas y se aplica en diagnósticos médicos e investigación. Existen dos tipos: inmunofluorescencia directa que detecta antígenos en un paso, e inmunofluorescencia indirecta que detecta anticuerpos circulantes en dos etapas. Presenta ventajas como resultados rápidos y detección de microorganismos específicos, pero también limitaciones como la necesidad de personal especializado y costos elevados.
La qPCR es una técnica que permite detectar y cuantificar ADN de forma cuantitativa y en tiempo real mediante el uso de reporteros fluorescentes. Se utiliza para detectar granulovirus en diferentes muestras como larvas, suelo y bioplaguicidas con el objetivo de desarrollar bioplaguicidas para el control biológico de plagas agrícolas. La metodología consiste en diseñar cebadores específicos para el gen de la granulina altamente conservado en granulovirus y utilizar una sonda Taqman para la
Este documento describe los métodos de amplificación de ácidos nucleicos, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Explica las etapas de la PCR, incluida la preparación de los reactivos, los ciclos térmicos de desnaturalización, alineamiento y extensión, y los métodos posteriores como la electroforesis. Finalmente, destaca las ventajas de la PCR para aplicaciones como el diagnóstico molecular, la ingeniería genética y la medicina legal.
La inmunocromatografía es una técnica bioquímica utilizada en inmunología para detectar la presencia de anticuerpos o antígenos en una muestra mediante la fijación de un antígeno o anticuerpo a una fase sólida y la detección del conjugado de un anticuerpo unido a una enzima que produce un cambio de color en presencia del sustrato.
Este documento describe las características generales, el metabolismo, las manifestaciones clínicas, el diagnóstico y el tratamiento de Gardnerella vaginalis. Es una bacteria anaerobia facultativa, Gram variable, que causa vaginosis bacteriana y se caracteriza por producir un olor desagradable y un flujo vaginal abundante y grisáceo. El diagnóstico se realiza mediante el examen del exudado vaginal y la detección de un pH alto, células clave y olor a pescado. Se trata generalmente con metronidazol o cl
Este documento describe varias enterobacterias como E. coli, Shigella, Salmonella y Klebsiella. Detalla las características y pruebas bioquímicas de identificación de E. coli, incluyendo sus diferentes cepas patógenas como EPEC, ETEC, EAEC, ECAD y EHEC. También cubre brevemente a E. albertii, una especie recién descrita aislada en heces diarreicas.
Este documento describe la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real). Explica que la PCR en tiempo real permite detectar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos usando reporteros fluorescentes. También describe los diferentes sistemas de detección utilizados como sondas de hidrólisis, sondas de hibridación y sondas de horquilla. Finalmente, menciona algunas aplicaciones de la PCR en tiempo real como diagnóstico molecular, investigación clínica y monitoreo de patógenos.
Este documento describe las pruebas inmunológicas rápidas basadas en inmunocromatografía para determinar la detección de antígenos o anticuerpos. El proceso involucra la acumulación de la muestra en partículas de oro conjugadas con antígenos o anticuerpos, los cuales se adhieren a zonas específicas de una membrana de nitrocelulosa. Si se encuentra el antígeno, ocurrirá una reacción antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos utilizados pueden ser policlonales
La inmunodifusión de Ouchterlony es una técnica desarrollada por el médico sueco Ouchterlony para identificar y cuantificar antígenos e inmunoglobulinas mediante la difusión de estas sustancias en un gel de agar y la formación de líneas de precipitación cuando el antígeno y el anticuerpo se encuentran. Esta técnica se ha utilizado ampliamente en inmunología clínica para medir proteínas como las inmunoglobulinas y ha permitido avanzar significativamente en el desarrollo de la inmun
ELISA es una técnica de inmunoensayo que utiliza anticuerpos o antígenos inmovilizados y enzimas unidas para detectar sustancias como anticuerpos o antígenos. Proporciona resultados cuantitativos rápidos y objetivos sobre el estado inmune o diagnóstico de una enfermedad. Existen varios tipos de ELISA que se utilizan comúnmente para detectar una variedad de patógenos y condiciones médicas.
Los microorganismos de Mycoplasma y Ureaplasma son las bacterias más pequeñas de vida libre. Carecen de pared celular y tienen esteróles en su membrana celular. Algunas especies como Mycoplasma pneumoniae y Ureaplasma urealyticum son patógenos humanos que causan infecciones respiratorias y urogenitales. Su patogénesis involucra factores de adherencia, producción de toxinas metabólicas y activación del sistema inmune del huésped.
Este documento presenta una lista de diferentes métodos inmunológicos, incluyendo técnicas de precipitación en gel como inmunodifusión simple, inmunodifusión doble, inmunoelectroforesis, inmunoelectroforesis simple, inmunoelectroforesis doble y contrainmunoelectroforesis. También describe técnicas como aglutinación, complemento, neutralización, inmunofluorescencia, radioinmunoensayo, técnicas inmunoenzimáticas y más. Explica brevemente el fundamento
Este documento describe varias pruebas serológicas utilizadas para diagnosticar infecciones febriles, incluyendo la reacción de Widal para fiebre tifoidea, la reacción de Huddleson para brucelosis, y la reacción de Weil-Felix para rickettsiosis. Explica los principios, interpretación y limitaciones de cada prueba, así como consideraciones importantes para su realización como el uso de sueros de control y la importancia de un contexto clínico.
Este documento trata sobre la genética viral. Explica los procesos de modificación genética viral como las mutaciones y la recombinación. Define mutaciones y describe sus causas y tipos. Luego describe la recombinación viral y sus diferentes formas. Finalmente, explica las interacciones entre productos de genes virales como la mezcla de fenotipos y la complementación.
La práctica consiste en realizar pruebas de floculación para determinar VDRL e inmunocromatografía para determinar HCG, HIV, Dengue, Cocaína, Marihuana, Malaria y COVID-19. Las pruebas de VDRL, HCG, Cocaína y Marihuana se basan en principios inmunológicos, mientras que para confirmar resultados se recomiendan pruebas como Western Blot para HIV, PCR para COVID-19 y gota gruesa para Malaria.
La técnica de Western blot permite transferir proteínas de un gel de electroforesis a una membrana para su detección mediante anticuerpos. Las proteínas se separan primero por tamaño a través de electroforesis en gel y luego se transfieren a una membrana para ser marcadas con anticuerpos específicos y así identificar proteínas particulares en una muestra. El Western blot ofrece alta sensibilidad pero también tiene algunas desventajas como costos elevados y variabilidad en los resultados.
Este documento describe un examen serológico para detectar anticuerpos contra el parásito Toxoplasma gondii. El examen cuantifica los niveles de anticuerpos IgG mediante la técnica ELISA. Los resultados se utilizan para determinar si una persona está infectada o no con el parásito, lo que es importante para mujeres embarazadas y personas con VIH.
Este documento describe las técnicas de PCR y electroforesis utilizadas en el estudio molecular del ADN. La PCR permite amplificar fragmentos específicos de ADN mediante la acción de una ADN polimerasa termoestable y cebadores. La electroforesis separa los fragmentos amplificados por tamaño a través de un campo eléctrico, permitiendo su detección e identificación. La PCR en tiempo real permite cuantificar copias iniciales de ADN mediante la detección de productos amplificados durante cada ciclo.
Este documento presenta una tesis sobre los efectos de la exposición al arsénico sobre la eficacia analgésica de antiinflamatorios no selectivos y selectivos COX-2 en un modelo experimental de dolor. Los resultados mostraron que el arsénico exacerba la conducta nociceptiva y la expresión del gen COX-2 en el tejido inflamado. El pretratamiento con diclofenaco o parecoxib inhibió este efecto del arsénico. El diclofenaco fue más efectivo en la antinocicepción causada por la formalina
Este documento trata sobre la resistencia antimicrobiana y el papel del laboratorio de microbiología. Brevemente describe los mecanismos de resistencia de los microorganismos, el uso indiscriminado de antibióticos y los tratamientos prolongados. También cubre temas como la selección de antibióticos, los diferentes tipos de antibióticos y cómo actúan, así como los mecanismos de resistencia a los antibióticos beta-lactámicos. Finalmente, explica el papel del laboratorio de microbiología en la identificación de patógenos
La Western Blot es una técnica que identifica proteínas del VIH mediante electroforesis y anticuerpos específicos. Se separan las proteínas del VIH y se transfieren a una membrana, donde anticuerpos revelan bandas coloreadas correspondientes a proteínas como p17, p24 y de envoltura. Los patrones de bandas permiten diagnosticar la infección por VIH de forma sensible aunque a veces los resultados son indeterminados debido a factores como la seroconversión.
La inmunofluorescencia es una técnica que utiliza anticuerpos unidos a sustancias fluorescentes para detectar moléculas específicas y se aplica en diagnósticos médicos e investigación. Existen dos tipos: inmunofluorescencia directa que detecta antígenos en un paso, e inmunofluorescencia indirecta que detecta anticuerpos circulantes en dos etapas. Presenta ventajas como resultados rápidos y detección de microorganismos específicos, pero también limitaciones como la necesidad de personal especializado y costos elevados.
La qPCR es una técnica que permite detectar y cuantificar ADN de forma cuantitativa y en tiempo real mediante el uso de reporteros fluorescentes. Se utiliza para detectar granulovirus en diferentes muestras como larvas, suelo y bioplaguicidas con el objetivo de desarrollar bioplaguicidas para el control biológico de plagas agrícolas. La metodología consiste en diseñar cebadores específicos para el gen de la granulina altamente conservado en granulovirus y utilizar una sonda Taqman para la
Este documento describe los métodos de amplificación de ácidos nucleicos, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Explica las etapas de la PCR, incluida la preparación de los reactivos, los ciclos térmicos de desnaturalización, alineamiento y extensión, y los métodos posteriores como la electroforesis. Finalmente, destaca las ventajas de la PCR para aplicaciones como el diagnóstico molecular, la ingeniería genética y la medicina legal.
La inmunocromatografía es una técnica bioquímica utilizada en inmunología para detectar la presencia de anticuerpos o antígenos en una muestra mediante la fijación de un antígeno o anticuerpo a una fase sólida y la detección del conjugado de un anticuerpo unido a una enzima que produce un cambio de color en presencia del sustrato.
Este documento describe las características generales, el metabolismo, las manifestaciones clínicas, el diagnóstico y el tratamiento de Gardnerella vaginalis. Es una bacteria anaerobia facultativa, Gram variable, que causa vaginosis bacteriana y se caracteriza por producir un olor desagradable y un flujo vaginal abundante y grisáceo. El diagnóstico se realiza mediante el examen del exudado vaginal y la detección de un pH alto, células clave y olor a pescado. Se trata generalmente con metronidazol o cl
Este documento describe varias enterobacterias como E. coli, Shigella, Salmonella y Klebsiella. Detalla las características y pruebas bioquímicas de identificación de E. coli, incluyendo sus diferentes cepas patógenas como EPEC, ETEC, EAEC, ECAD y EHEC. También cubre brevemente a E. albertii, una especie recién descrita aislada en heces diarreicas.
Este documento describe la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real). Explica que la PCR en tiempo real permite detectar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos usando reporteros fluorescentes. También describe los diferentes sistemas de detección utilizados como sondas de hidrólisis, sondas de hibridación y sondas de horquilla. Finalmente, menciona algunas aplicaciones de la PCR en tiempo real como diagnóstico molecular, investigación clínica y monitoreo de patógenos.
Este documento describe las pruebas inmunológicas rápidas basadas en inmunocromatografía para determinar la detección de antígenos o anticuerpos. El proceso involucra la acumulación de la muestra en partículas de oro conjugadas con antígenos o anticuerpos, los cuales se adhieren a zonas específicas de una membrana de nitrocelulosa. Si se encuentra el antígeno, ocurrirá una reacción antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos utilizados pueden ser policlonales
La inmunodifusión de Ouchterlony es una técnica desarrollada por el médico sueco Ouchterlony para identificar y cuantificar antígenos e inmunoglobulinas mediante la difusión de estas sustancias en un gel de agar y la formación de líneas de precipitación cuando el antígeno y el anticuerpo se encuentran. Esta técnica se ha utilizado ampliamente en inmunología clínica para medir proteínas como las inmunoglobulinas y ha permitido avanzar significativamente en el desarrollo de la inmun
ELISA es una técnica de inmunoensayo que utiliza anticuerpos o antígenos inmovilizados y enzimas unidas para detectar sustancias como anticuerpos o antígenos. Proporciona resultados cuantitativos rápidos y objetivos sobre el estado inmune o diagnóstico de una enfermedad. Existen varios tipos de ELISA que se utilizan comúnmente para detectar una variedad de patógenos y condiciones médicas.
Los microorganismos de Mycoplasma y Ureaplasma son las bacterias más pequeñas de vida libre. Carecen de pared celular y tienen esteróles en su membrana celular. Algunas especies como Mycoplasma pneumoniae y Ureaplasma urealyticum son patógenos humanos que causan infecciones respiratorias y urogenitales. Su patogénesis involucra factores de adherencia, producción de toxinas metabólicas y activación del sistema inmune del huésped.
Este documento presenta una lista de diferentes métodos inmunológicos, incluyendo técnicas de precipitación en gel como inmunodifusión simple, inmunodifusión doble, inmunoelectroforesis, inmunoelectroforesis simple, inmunoelectroforesis doble y contrainmunoelectroforesis. También describe técnicas como aglutinación, complemento, neutralización, inmunofluorescencia, radioinmunoensayo, técnicas inmunoenzimáticas y más. Explica brevemente el fundamento
Este documento describe varias pruebas serológicas utilizadas para diagnosticar infecciones febriles, incluyendo la reacción de Widal para fiebre tifoidea, la reacción de Huddleson para brucelosis, y la reacción de Weil-Felix para rickettsiosis. Explica los principios, interpretación y limitaciones de cada prueba, así como consideraciones importantes para su realización como el uso de sueros de control y la importancia de un contexto clínico.
Este documento trata sobre la genética viral. Explica los procesos de modificación genética viral como las mutaciones y la recombinación. Define mutaciones y describe sus causas y tipos. Luego describe la recombinación viral y sus diferentes formas. Finalmente, explica las interacciones entre productos de genes virales como la mezcla de fenotipos y la complementación.
La práctica consiste en realizar pruebas de floculación para determinar VDRL e inmunocromatografía para determinar HCG, HIV, Dengue, Cocaína, Marihuana, Malaria y COVID-19. Las pruebas de VDRL, HCG, Cocaína y Marihuana se basan en principios inmunológicos, mientras que para confirmar resultados se recomiendan pruebas como Western Blot para HIV, PCR para COVID-19 y gota gruesa para Malaria.
La técnica de Western blot permite transferir proteínas de un gel de electroforesis a una membrana para su detección mediante anticuerpos. Las proteínas se separan primero por tamaño a través de electroforesis en gel y luego se transfieren a una membrana para ser marcadas con anticuerpos específicos y así identificar proteínas particulares en una muestra. El Western blot ofrece alta sensibilidad pero también tiene algunas desventajas como costos elevados y variabilidad en los resultados.
Este documento describe un examen serológico para detectar anticuerpos contra el parásito Toxoplasma gondii. El examen cuantifica los niveles de anticuerpos IgG mediante la técnica ELISA. Los resultados se utilizan para determinar si una persona está infectada o no con el parásito, lo que es importante para mujeres embarazadas y personas con VIH.
Este documento describe las técnicas de PCR y electroforesis utilizadas en el estudio molecular del ADN. La PCR permite amplificar fragmentos específicos de ADN mediante la acción de una ADN polimerasa termoestable y cebadores. La electroforesis separa los fragmentos amplificados por tamaño a través de un campo eléctrico, permitiendo su detección e identificación. La PCR en tiempo real permite cuantificar copias iniciales de ADN mediante la detección de productos amplificados durante cada ciclo.
Este documento presenta una tesis sobre los efectos de la exposición al arsénico sobre la eficacia analgésica de antiinflamatorios no selectivos y selectivos COX-2 en un modelo experimental de dolor. Los resultados mostraron que el arsénico exacerba la conducta nociceptiva y la expresión del gen COX-2 en el tejido inflamado. El pretratamiento con diclofenaco o parecoxib inhibió este efecto del arsénico. El diclofenaco fue más efectivo en la antinocicepción causada por la formalina
El documento proporciona información sobre la biología molecular, los ácidos nucleicos ADN y ARN. Explica que los ácidos nucleicos están compuestos de cadenas de nucleótidos que contienen azúcares, fosfatos y bases nitrogenadas. Describe la estructura de doble hélice del ADN y cómo las bases se unen mediante puentes de hidrógeno, así como los tres tipos principales de ARN: ARNm, ARNt y ARNr.
El documento describe los principales conceptos de la biología molecular, incluyendo que el ADN contiene la información genética que se transmite a través de las generaciones, y que se expresa mediante la transcripción del ADN en ARNm y la traducción del ARNm en proteínas. Explica procesos como la transcripción, la maduración del ARNm, y la traducción del código genético universal para sintetizar proteínas a partir del ARNm.
Multiplex PCR allows for the amplification of multiple DNA templates in a single reaction by using multiple primer pairs. This technique has the potential to reduce time and costs compared to performing individual PCR reactions. Optimization is required to prevent cross-hybridization between primers and ensure even amplification of all templates. The document discusses the advantages and disadvantages of multiplex PCR as well as optimization of reaction components, primer design parameters, applications, and references.
Principales helmintiasis en caninos y felinosJohana Solis
Este documento presenta información sobre diferentes helmintiasis que afectan a caninos y felinos. Describe las especies de Ancylostoma, Toxocara canis, Toxocara cati, Spirocerca lupi y Uncinaria stenocephala que causan estas enfermedades. Incluye detalles sobre su clasificación taxonómica, ciclo de vida, mecanismos de transmisión, signos clínicos, diagnóstico, prevención y control. El documento provee una guía completa sobre estas parasitosis comunes en mascot
El documento describe la fiebre porcina clásica, una enfermedad viral aguda que afecta a los cerdos domésticos y salvajes. Se transmite principalmente a través del contacto directo e indirecto. Los signos clínicos varían desde agudos hasta crónicos o asintomáticos dependiendo de la cepa viral. El diagnóstico se realiza mediante pruebas serológicas, aislamiento viral e identificación de antígenos o ARN viral. No existe tratamiento ni vacuna disponible comercialmente en México.
Este documento describe los métodos para aislar ácidos nucleicos como el ADN de las células. Explica que los ácidos nucleicos se encuentran no solo en el núcleo celular, sino también en el citoplasma, mitocondrias y cloroplastos. Luego detalla métodos físicos y químicos para lisar las células y eliminar proteínas, utilizando enzimas y solventes orgánicos como fenol y cloroformo, para aislar y concentrar el ADN puro al final mediante precipitación con sales y alcohol.
Este documento presenta un resumen de tres capítulos sobre genética bacteriana. Explica conceptos básicos como el nucleoide, plásmidos y elementos transponibles en bacterias. Describe los principios de la genética bacteriana como la replicación del ADN, transcripción, traducción y regulación génica. También define mutaciones y variaciones bacterianas, y explica los tipos de mutaciones y cómo ocurren espontáneamente al azar.
El documento proporciona información sobre el virus de la influenza. Explica que la influenza es una enfermedad aguda causada por el virus de la influenza que afecta principalmente las vías respiratorias. Describe la estructura, replicación y subtipos del virus, así como su epidemiología, síntomas, diagnóstico y tratamiento. Además, analiza la prevención de la influenza a través de la vacunación.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tiene múltiples aplicaciones como la huella digital genética para identificación, pruebas de paternidad, detección de enfermedades hereditarias, comparación de expresión génica, clonamiento de genes, mutagénesis dirigida, análisis de ADN antiguo, y genotipificación de polimorfismos para estudios poblacionales y de enfermedades. La PCR permite amplificar segmentos específicos de ADN o ARN para su posterior análisis.
El documento describe el rol de enfermería en el programa de VIH/SIDA en un hospital de Lima. La enfermera brinda atención integral a pacientes, incluyendo evaluaciones, educación sobre adherencia al tratamiento y prevención, y coordinación con el equipo multidisciplinario. El impacto en niños con VIH incluye problemas de salud, psicológicos, sociales y económicos. La intervención de enfermería se enfoca en el cuidado compasivo, educación a pacientes y familiares, y coordinación con otros servicios de apoyo
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.
La mayoría de los parásitos que afectan los pulmones son helmintos o gusanos invertebrados. Los cestodos Echinococcus granulosus y los nemátodos Ascaris lumbricoides y Strongyloides stercoralis pueden migrar a los pulmones y causar síntomas respiratorios como tos, expectoración y disnea. El diagnóstico se basa en el examen de muestras respiratorias o fecales para detectar huevos u otros signos del parásito, mientras que la radiografía de tórax puede mostrar infil
Influenza is caused by RNA viruses of the Orthomyxoviridae family that infect the respiratory tract. There are three main types of influenza viruses - A, B, and C. Influenza A is further divided into subtypes based on two surface proteins and can undergo antigenic drift or shift. Influenza spreads through respiratory droplets from coughing or sneezing. Symptoms include fever, cough, sore throat and fatigue. Vaccination and antiviral drugs can help prevent and treat influenza.
Este documento describe el diagnóstico de la leptospirosis mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Explica los fundamentos y pasos de la PCR, incluyendo la amplificación de secuencias específicas de ADN. También describe los métodos de diagnóstico microbiológico de la leptospirosis, como el cultivo, inmunofluorescencia e hibridación de ácidos nucleicos. La PCR permite diagnosticar la leptospirosis de forma más rápida que los métodos tradicionales.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite amplificar pequeñas cantidades de ADN de manera masiva. Fue desarrollada por Kary Mullis en 1985 y ha revolucionado la biología molecular al permitir la producción rápida de grandes cantidades de una secuencia de ADN específica. La PCR en tiempo real utiliza sondas fluorescentes para cuantificar el ADN amplificado durante cada ciclo, proporcionando una medición cinética del proceso. Tiene numerosas aplicaciones en investigación, diagnóstico cl
Este documento describe la prueba de diagnóstico molecular llamada PCR en tiempo real o GeneXpert para la detección de Mycobacterium tuberculosis y la resistencia a rifampicina. Explica la metodología, principios, especificaciones técnicas, evaluación de desempeño, gestión del mantenimiento y controles de calidad de la prueba GeneXpert.
La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica que permite amplificar una secuencia de ADN de manera específica y exponencial. Requiere ADN molde, cebadores, dNTPs, ADN polimerasa y un termociclador. La PCR se utiliza en aplicaciones como diagnóstico médico, estudios de evolución y filiación, investigación forense e identificación de genes. Ofrece alta sensibilidad y especificidad, y permite obtener resultados rápidamente a partir de una amplia variedad de muestras bioló
Rt pcr (retro-PCR o PCR con retrotranscriptasa)Agustín Torres
La RT-PCR es una variante de la PCR que utiliza mRNA en lugar de DNA como molde para la amplificación. El proceso implica una retrotranscripción del mRNA a cDNA seguida de la amplificación por PCR estándar. La RT-PCR se usa principalmente para el estudio de retrovirus y la detección de expresión génica.
Seminario: Variación en el número de copias de los componentes genéticos hum...Michelle Santos
Seminario ofrecido en la UPR-Arecibo sobre la investigación realizada, en colabotación con el Dr. Dorak (Universidad Internacional Florida). La misma se llevó a cabo el 2 de agosto de 2011.
Este documento describe un curso sobre tecnologías de alto rendimiento en genómica que se llevará a cabo del 28 de noviembre al 5 de diciembre. El curso cubrirá técnicas como microarrays, RT-qPCR, secuenciación masiva y análisis de resultados de estas técnicas. Los temas incluyen tipos de microarrays, cómo se fabrican, calidad y cantidad de RNA de partida, y procedimientos de microarrays.
El documento describe el uso de la técnica de Line Probe Assay (LPA) o hibridación en tiras con sondas para el diagnóstico de la tuberculosis. El LPA permite detectar mutaciones asociadas a la resistencia a medicamentos antituberculosos a través de la unión de amplicones a sondas específicas. Se requiere una infraestructura adecuada y controles estrictos para minimizar el riesgo de contaminación cruzada durante el proceso.
Este documento describe la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus aplicaciones. La PCR permite amplificar de forma selectiva secuencias específicas de ADN mediante la repetición cíclica de procesos de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión. Esto resulta en la generación exponencial de copias del fragmento de ADN delimitado por los cebadores. La PCR tiene numerosas aplicaciones en medicina, como la detección de patógenos y el diagnóstico molecular.
La técnica de PCR en tiempo real permite amplificar y cuantificar moléculas de ADN o ADNc de manera rápida y precisa para acceder a datos sobre la expresión genética celular. Utiliza marcadores fluorescentes y la transcriptasa inversa para generar ADNc a partir de ARN, superando las limitaciones de la PCR convencional. La optimización de factores como los reactivos, concentraciones de iniciadores y muestras es crucial para obtener resultados específicos, sensibles y reproducibles. Esta técnica tiene amplias aplicaciones en investigación c
El documento describe la técnica de PCR cuantitativa (qPCR), incluyendo sus fundamentos, materiales, etapas y aplicaciones. La qPCR permite cuantificar ADN además de detectarlo y amplificarlo mediante el uso de fluorocromos y un termociclador que mide la fluorescencia después de cada ciclo. Esta técnica se utiliza comúnmente para detección de patógenos, análisis genético y detección de mutaciones.
Biología molecular aplicada a inmunohematologíaTrishdeish
El documento presenta una introducción a las técnicas moleculares aplicadas a la inmunohematología, incluyendo sus utilidades para pacientes politransfundidos, con glóbulos rojos recubiertos de inmunoglobulinas, y para la resolución de discrepancias. Luego describe técnicas como PCR convencional, PCR alelo específico, PCR-RFLP, PCR multiplex, secuenciación, PCR en tiempo real y microarrays. Finalmente, concluye que estas técnicas facilitan la resolución de problemas serológicos y que se busca
1. La técnica de PCR en tiempo real permite la detección y cuantificación del virus de la psorosis de los cítricos mediante la medición de la fluorescencia emitida durante la amplificación del ARN viral.
2. Se implementó un protocolo de RT-PCR en tiempo real para detectar el virus en hojas de naranja afectadas por psorosis en el estado de Nuevo León, México.
3. Los resultados permitirán determinar la concentración viral presente en las muestras y monitorear la enfermedad.
RT-PCR es una variante de la PCR que utiliza una sustancia marcada con fluoruro para medir la fluorescencia después de cada ciclo de amplificación sin necesidad de usar agarosa. Consiste en calentar y enfriar las muestras en un termociclador en ciclos de 25-40 grados para separar, alinear y polimerizar el ADN en tres etapas usando moldes, cebadores, dNTPs, tampón de reacción y polimerasa. Puede ser cuantitativa usando fluorocromos o sondas moleculares para medir
1. La PCR en tiempo real es una técnica de amplificación y cuantificación de ADN y ARNm que utiliza sondas y fluorocromos para monitorear la amplificación en cada ciclo.
2. Existen diferentes tipos de sondas como Taqman, Molecular Beacons y FRET que se unen específicamente a la secuencia blanco y emiten fluorescencia durante la amplificación.
3. El análisis e interpretación de las curvas de amplificación generadas permite establecer parámetros como el umbral, el Ct y la efici
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método para obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN partiendo de una sola copia. Se basa en la capacidad de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN usando ciclos de altas y bajas temperaturas que separan y vuelven a unir las hebras de ADN nuevas. Requiere dNTPs, cebadores, iones, buffer y ADN polimerasa. Se usa ampliamente en medicina, investigación, paleontología y agronomía
Este documento describe los procesos centrales de la biología molecular como la replicación, transcripción y traducción. Resume los mecanismos de la transcripción en procariotas y eucariotas, incluyendo la estructura y función de las RNA polimerasas, los promotores y factores de transcripción. También describe el procesamiento de los mRNA eucariotas.
High throughput technologies in Genomics - Tecnologías de alto rendimiento en genómica.
Session 1: Microarrays
Course held at Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), in Barcelona, Catalonia, Spain, on October 5th, 2011.
Similar a Course VHIR-UCTS-UEB - Session 2 - RTqPCR (20)
This document provides an introduction to metagenomics. It defines metagenomics as the study of microbial communities directly in their natural environments using modern genomics techniques. The document outlines the historical context and basic purpose of metagenomics. It describes some of the applications of metagenomics, such as understanding the human microbiome, bioremediation, bioenergy production, and smart farming. Finally, it introduces some basic concepts in metagenomics analysis including binning, OTUs, alpha and beta diversity measurements, and challenges around estimating diversity from samples.
Course: Bioinformatics for Biomedical Research (2014).
Session: 4.2- Introduction to Functional Analysis with IPA.
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This document provides an introduction to bioinformatics. It defines bioinformatics as the interdisciplinary field that develops methods for storing, organizing, and analyzing vast amounts of biological data generated by new technologies. It discusses the explosive growth of genomic and protein data. It also describes the roles and skills of bioinformaticians, including knowledge of biology, computer science, and quantitative disciplines. Finally, it outlines where bioinformatics is typically conducted, such as specialized centers and universities, and how it is usually done through online and open source solutions.
Course: Bioinformatics for Biomedical Research (2014).
Session: 1.3- Genome Browsing, Genomic Data Mining and Genome Data Visualization with Ensembl, Biomart and IGV.
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1) The document discusses using the Tiki Wiki CMS system to manage information flows at the Statistics and Bioinformatics Unit at Vall d'Hebron Institut de Recerca.
2) Key features of Tiki that are highlighted include wiki pages, structures and permissions to manage documentation, trackers for databases, and calendars for planning. It also allows connecting R to the web through plugins.
3) Examples provided include using Tiki to create task trackers, study databases, and an interactive heatmap tool powered by R. The system allows automating workflows and sharing results in a customizable centralized system.
This document discusses real-time quantitative PCR (RT-qPCR) data analysis. It outlines topics including normalization, absolute and relative quantification methods, and data analysis pipelines. For normalization, it describes correcting for systematic variation between samples through methods like using housekeeping genes or internal calibrators. It also explains that absolute quantification uses a standard curve of known copy numbers, while relative quantification compares target and reference gene expression ratios, such as through the delta-delta Ct method. The document provides examples of calculating fold changes between samples or tissues.
El resumen analiza los principios básicos del diseño experimental y el proceso de análisis de datos de microarrays. Explica que un buen diseño experimental sigue principios como la aleatorización, la replicación y el bloqueo para minimizar errores sistemáticos y maximizar la precisión. También describe los diferentes tipos de estudios de microarrays, como la comparación de clases y el descubrimiento de clases, así como las herramientas disponibles para el análisis.
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This document provides an introduction and overview of next-generation sequencing (NGS) data analysis. It discusses the bioinformatics challenges posed by large NGS datasets, including the need for powerful computing infrastructure and data storage. The document outlines common NGS data analysis workflows and applications, such as quality control, metagenomics, de novo assembly, amplicon analysis and variant detection. It also compares different NGS platforms and provides examples of software tools used in NGS data analysis.
Este documento describe un curso sobre tecnologías de secuenciación de nueva generación. El curso cubre las tecnologías 454 de Roche, comparaciones con otros sistemas de secuenciación masiva paralela, y aplicaciones como el estudio de quasiespecies virales, secuenciación de genomas de novo, metagenómica, RNA-seq, y análisis de exomas y mutaciones en leucemia mediante arrays de captura de secuencia. El curso también cubre el análisis de datos de secuenciación masiva paralela.
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Course VHIR-UCTS-UEB - Session 2 - RTqPCR
1. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIA 1. 5 de Octubre
Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez)
RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)
2. Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
3. Definición de la Técnica
PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR
Termociclador
Cebadores Ácido nucléico con sistema de detección
Taq
polimerasa
A G CU
T
Nucleótidos
Tampón de
reacción
UNG
(opcional) ROX
Sonda Agentes intercalantes
R Q
http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr
4. ROX como referente pasivo
ROX=6-carboxy-X-rhodamine
+ ROX - ROX
Desv St= ± 0.306
Desv St= ± 0.059
Δ Rn
Ciclos Ciclos
Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado
para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.
5. Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
6. Terminología asociada a qPCR
Escala semi-logarítmica
al Plató
Line
Log Fluorescence
l
cia
en
pon
Rn
Threshold
Ex
Baseline
Ct value= 15.5
Cycle Number
7. RT-qPCR vs PCR Convencional
PCR Convencional RT-qPCR
Semi-cuantitativa: Cualitativa y cuantitativa.
Rango dinámico pequeño ›2 logs
Baja Precisión; baja resolución y poco Cuantificación Absoluta
A tiempo real
Sensible.
(fase exponencial) Cuantificación Relativa
Manipulación post-PCR .
Baja Resolución
No-automatización A tiempo final Plus/Minus
Elevado rango dinámico de detección
(fase plató) Discriminación Alélica
Discriminación basada sólo en tamaño Capaz de detectar cambios 2-fold.
No requiere procesado post-PCR
Los resultados no están expresados en
números.
El BrET no es muy cuantitativo
8. Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
9. Diseñando un experimento de qPCR
Aplicación
Método de Normalización
Química de detección:
Sondas específicas marcadas con fluorocromos
Agentes Intercalantes
Fluorocromos unidos a primers
Reactivos:
Core kit vs Master Mix
dNTPs/dUTPs y UNG enzyme
ROX como referente pasivo
Termociclador:
Formato
Número de canales de detección
Software de análisis
Duración del programa
Precio y flexibilidad de la oferta
10. Aplicaciones RTqPCR
3´oligo
5´oligo
Proteína
Tejido Target
mRNA
miRNA
Célula RNA ncRNA
Eucariota siRNA
saRNA
CNA
Análisis en Células Stem Validación Microarrays
Análisis en célula Única
DNA
Bacteria SNP
CNV
Mutaciones
Micoplasma
Patógenos en la comida Virus Análisis Metilación
11. Estrategias de Normalización qPCR
Normalización respecto a la masa total de RNA exraído
(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)
Normalización respecto al volumen/masa de la muestra
( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)
Normalización respecto al número de células
( moléculas/célula)
Normalización respecto a un gen endógeno no regulable
(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)
Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3)
geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology)
BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004)
Normfinder
Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology)
Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. Review
BMC Bioinformatics 2009, 10:110
12. Plataforma de RTqPCR en la UCTS
7000 SDS 7900HT Fast SDS LightCycler 480
Tiras de 8 Tubos
Formato
Microfluidicas Placas-384 White Plates-384
Placas-96
(Arrays de baja densidad)
Ref. Pasivo ROX Ninguno
ROX
Formato 384-p: FAM, TAMRA, Filtros/canales detección:
Química FAM, TAMRA, VIC, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.
JOE, NED, SYBR, ROX 500, 533, 568, 610, 640, 670 nm
Formato LDA: FAM, VIC, ROX.
mode 9600 Emulation/Standard Fast
9600 Emulation /Standard
Fast
Softwares V1.2.3f2 con RQ study SDS 2.4.1
RQ Manager 1.2 SW 1.5
Primer Express 2.0
13. La UCTS dispone de los siguientes reactivos:
Química: SYBRGreen SondasTaqMann SondasTaqMann
UNG: Sí Sí
Mode: 9600 Emulation/Standard Fast
14. Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
15. Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
DNA
Producto
Muestra
Amplificado
RNA cDNA
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
16. Preparación Material de partida
DNA
Producto
Muestra
Amplificado
RNA cDNA
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
Tipo de muestra
Método Extracción
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
17. Preparación Material de partida
DNA
Producto
Muestra
Amplificado
RNA cDNA
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
RNA total/mRNA/DNA
Calidad & Cantidad
Almacenamiento (-80ºC)
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
18. Evaluación del RNA
RNA Q &Q
Pureza (ausencia Integridad Cantidad
de contaminación por • Existen dif. métodos de
DNA y Proteínas y • rRNA ( 28S:18S=2:1) cuantificación.
ausencia de inhibidores) • Número RIN (› 5) • Generan difs. resultados.
• ODA260/A280=1.8-2.0 • Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica •Hay que cuantificar muestras
elevada integridad; ›5 degradado) comparables entre sí con el
• OD A260/A230=2 mismo método de cuantificación.
• SPUD assay (Nolan, 2006)
Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126–139 Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005)
PERFECTO BUENO MALO
10.0 9.2 8.1 7.2 6.0 5.0 4.4 4.0
2:1
Gel Desnt.
Agarosa Agilent Bioanalyzer
19. Reacción de Transcripción Reversa (RT)
Producto
Muestra RNA cDNA Amplifcado
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
One-Step vs Two Step
CDNA Priming
Pérfil Térmico
Consideraciones Experimentales
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
20. One Step RT-PCR vs Two Step RT-PCR
One-Step RT-PCR Requiere una única mezcla de reacción ya que RT y PCR ocurren en el mismo
tubo.
AmpErase UNG no se puede usar.
Única enzima (ej. PolimerasaTth) RNA-y-DNA dependiente.
Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación.
No es posible la optimización por separado de ambas reacciones.
Requiere primer RT específico de secuencia.
Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa.
Acumulación de dímeros de primers.
RT qPCR
RNA cDNA Producto Amplif.
Two-Step RT-PCR Requiere dos mezclas de reacción (reacción RT y
reacción PCR).
Más flexible (El cDNA se puede guardar y ser usado
RNA
RT
cDNA
más tarde).
Permite la optimización por separado de ambas
reacciones.
qPCR
cDNA Producto Amplif. Permite el uso de primer RT específico de secuencia,
random primers o oligo(dT).
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
22. Consideraciones Experimentales de la RT
En general, usar el RNA total como molde para la RT.
Dado que la eficiencia de RT depende del gen diana y de la enzima de RT, es muy
importante usar siempre el mismo enzima RT, los mismos primers para la síntesis
de cDNA y las mismas condiciones experimentales si se quieren comparar
resultados entre sí.
Hacer réplicas
Incluir siempre control no-RT
Añadir la misma cantidad de RNA total en cada reacción.
Siempre que sea posible, montar las reacciones de RT de todas las muestras al
mismo tiempo para evitar la variación entre tandas.
Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes tandas, incluir una muestra
control positiva de referencia en todas las tandas.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
23. qPCR
Producto
Muestra RNA cDNA Amplifcado
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
Elección en el software del ensayo a realizar
Perfil Térmico
Consideraciones Experimentales
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
24. Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
25. Con Curva Stándard
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
Absolute Quantification Standard Curve (AQ)
(Standard Curve)
26. Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
29. Perfil térmico clásico qPCR
Perfil térmico que incluye paso de Activación UNG
1.- Activación UNG
2.- Activación Taq y desnaturalización UNG
3.- Desnaturalización del dsDNA
4.- Anillamiento y extensión primers
30. Consideraciones qPCR
Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra
calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la
variabilidad inter-ensayo.
Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas
difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados
biológicos.
Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más
distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación
cruzada.
Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA.
Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación
de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas,
es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta
10 horas.
Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y
huellas en la parte superior del cobertor/tapa.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad
31. Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
32. Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
DNA Producto
Amplificado
Muestra RNA cDNA
Preparación
Muestra
Extracción
Ác. Nucléicos
Transcripción
Reversa (RT)
PCR a tiempo Real Análisis
(qPCR )
de datos
Calidad del
Ensayo
Métodos de
Cuantificación
Estadística
33. Calidad del Ensayo
Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)
Controles qPCR
NEGATIVOS
NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación
NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas
No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico
POSITIVOS
Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar.
Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos
Spiking Control Detecta presencia de inhibidores
Curva de Disociación (SYBR Green)
Curva Estándar
Linealidad de los datos
Distancia entre las curvas de amplificación
Eficiencia de amplificación
34. Calidad del Ensayo
Curva Estándard: Eficiencia Convertir E en
Pendiente Amplificación Porcentaje
(E= 10-1/slope) %E= (E-1)100%
R2 ›0.98 o r › 0.99 -3,0 2,2 115
-3,1 2,1 110
Slope= -3.73
-3,2 2,1 105
-3,3 2,0 101
-3,32 2,0 100 OK
-3,4 2,0 97
-3,6 1,9 90
-3,7 1,9 86
-4 1,8 78
2n=Factor de dilución
Factor
n=LG(Factor Dil.)/LG(2)
Dilución
2 1,00
5 2,32
10 3,32
35. Métodos de Cuantificación
Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa
Cantidad de ácido nucléico (número de Cantidad relativa de ácido nucléico
copias, µg) por cantidad de muestra de una muestra A
dada (por célula, por µg de RNA total) respecto a una muestra B
Ejemplo: Niveles de expresión génica
Ejemplo: medida carga viral
en Tumor vs Tejido normal.
A.- Cuantificación Relativa con Curva Stándard:
Qty gen problema
Muestra Problema =
Qty gen EC
106 105 104 103 102 10
Qty gen problema
Calibradora =
Qty gen EC
B.- Método Pfaffl:
(Egen diana) dCT, gen diana (calibradora – muestra problema)
RQ =
(Egen EC)
Ct
dCT, gen EC (calibradora – muestra problema)
C.- Método (Livak) Doble Delta CT:
dCT = CT(gen diana) – CT(gen EC)
ddCT = dCT(muestra problema) – dCT (calibradora)
Log (Num de copias)
RQ= 2–ddCT
36. Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC
Slope
(Ct gen Target – Ct gen Endógeno) R2
Y = 0.0471x + 3.0178
R2 = 0.2315
ΔCt=
Log Diluciones
37. RTqPCR en tela de juicio
Routine lab method’s accuracy called into
question
NATURE MEDICINE VOL 16,page 349 APRIL 2010
Catherine Shaffer
Ejemplos:
1) Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel disease
V Uhlmann et al. Mol Pathol 2002;55:84–90
Estudio que causó una polémica en 1998 al sugerir un vínculo entre la vacuna triple vírica y el autismo.
RT-qPCR and molecular diagnostics: no evidence for measles virus in the GI tract of autistic
children.
S.A. Bustin. Eur Pharm Rev Dig 1 (2008) 11-16.
2) The mRNA of the Arabidopsis Gene FT Moves from Leaf to Shoot Apex and Induces
flowering.
Huang et al. Science 309 September 2005: 1694-1696
“Breakthrough of the Year 2005”, the runners-up. Science 310:1880-1885
Retraction of Hung et al., Science 309 (5741) 1694-1696.
H. Bohlenius et al. Sience 316 April 2007:367.
40. Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
41. Direcciones de interés relacionadas con qPCR
http://qpcr.gene-quantification.info/
http://genex.gene-quantification.info/
http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.html
qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)
http://www.eurogentec.com
http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html
42. Seminario RTqPCR
18 de Octubre en VHIR
Prof. Michael Kubista
Está entre los pioneros que desarrollaron la RTqPCR