PCR!

1. PCR
Marcela Cárdenas Tueme
1500792

2. Amplifica pequeñas cantidades de
PCR ADN entre cientos de miles y millones
de
veces

3. Determinación
de paternidad
Ciencia forense:
Estudios de
identificación
expresión
de restos
genética
biológicos.
PCR
Secuenciación
Diagnóstico de directa de
enfermedades secuencias
amplificadas
Seguimiento de
la efectividad
Detección de
de tratamiento
mutaciones
de
enfermedades

4. Metodología básica
Extracción de ácidos nucleicos:
• Procesamiento de la muestra Preparación de la “MASTER” de PCR:
• Extracción de ácidos nucleicos • Primers
• Precipitación de los ácidos nucleicos • Polimerasa
• dNTPs
• Buffer de amplificación
Comprobación de la extracción
DNA diana
Amplificación por medio de PCR Detección e interpretación:
• Desnaturalización • Análisis electroforético
• Alineamiento • Análisis secundario de restricción o
• Elongación hibridación

5. dNTP • Concentraciones entre 20 y 200µM
(sustratos para polimerizar al nuevo resultan en un balance óptimo entre
DNA) rendimiento, especificidad y
C •
fidelidad.
Los cuatro dNTP deben ser usados
en concentraciones equivalentes.
o Primers • Tamaño ideal: 18-30 nucleótidos de
R longitud.
m •
•
Extremo 3’: Debe ser una G o una C
Tm: 50-65% °C
e • Contenido GC: 40-60%
p d • Autocomplementariedad: Debe de
ser evitada, para evitar los dímeros
a de primer.
o e • 100% de apareamiento con el molde.
c Polimerasa • Un rango de concentración para
n polimerasa es entre 1 y 2.5 unidades
por 100 µL de reacción.
c Concentración Magnesio • El alineamiento de los primers, la
e l temperatura de disociación de las
i cadenas, tanto del templado como
del producto de PCR, la especificidad
n a del producto, la formación de
ó dímeros de primer y la actividad y
t •
fidelidad de la enzima.
La Taq polimerasa requiere magnesio
n libre en la unión con el templado, los
e •
primers y los dNTPs.
Los PCR deben contener 0.5 a 2.5
mM de magnesio sobre el total de la
s Buffer para PCR
concentración de dNTP.
• Buffer recomendado para PCR es de
10-50 mM de Tris-HCl
• 50 mM de KCl, tween 20 o laureth 12

6. PCR
• Desnaturalización del
DNA
Desnaturalización • 95°C por 30 segundos
• 97°C por 15 segundos
• Hibridación de los primers.
• La temperatura de
Alineamiento alineamiento óptima es
5°C por debajo de la Tm de
los primers.
•La polimerasa inserta los nucleótidos
complementarios.
•El tiempo de extensión depende de la
longitud y la [] de la secuencia blanco.
Extensión •Tiempo de extensión de 1 minuto es
suficiente para productos de hasta 2 kb
de longitud.

7. Número de Ciclos
• Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo.
• Repetir el ciclo varias veces permite obtener
un experimento de amplificación. Millones de
copias del fragmento de interés.
• Demasiados ciclos incrementan la cantidad y
complejidad de productos no específicos; sin
embargo pocos ciclos dan como resultado un
bajo rendimiento del producto.

8. Número de Cantidad de
ciclos DNA
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
Relación entre cantidad de DNA 8
9
256
512
y el número de ciclos 10 1024
11 2048
12 4096
13 8192
14 16384
15 32768
16 65536
17 131072
18 262144
19 524288
20 1048576

9. PCR anidada
• Es un tipo de PCR en la que el producto de una
amplificación es utilizado como molde para realizar
una segunda amplificación.
• Se utilizan cebadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada.
• Cuando se tiene el primer amplicón, se unen los
cebadores y se amplifica de nuevo, dentro del
amplicón inicial.
• Ventaja  brinda alta sensibilidad y especificidad. Así,
evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los
cebadores.
• Desventaja  no nos permite cuantificar la muestra.

10. PCR in situ
• Consiste en una reacción de PCR en células,
donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificación.
• En la técnica de PCR in situ se realiza una
primera amplificación de DNA blanco y luego
detección mediante hibridación in
situ con sondas de DNA/RNA.
• De esta manera pueden detectarse cantidades
pequeñísimas de genoma.

11. PCR múltiple
• PCR en la cual se amplifica simultáneamente
más de una secuencia.
• Se combinan dos o más pares de cebadores en
un mismo tubo, para amplificar
simultáneamente varios segmentos de DNA.
• Ventajas  información sobre varios locus en
una sola reacción, menor cantidad de molde
para el análisis, menor cantidad de reactivos,
rápida construcción de bases de datos.

12. Q-PCR
• Es utilizada para amplificar y simultáneamente
cuantificar de forma absoluta el producto de la
amplificación de DNA.
• Utiliza los mismos reactivos que un PCR normal, se le
adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo.
• Se usa un termociclador que albergue sensores para
medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a
la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa
de generación de uno o más productos específicos.
• Se puede dividir en las técnicas basadas
en fluorocromos no específicos y en las técnicas
basadas en sondas específicas.

13. Q-PCR, técnicas de fluorocromos
• En las técnicas basadas en
fluorocromos el DNA, se une
al fluorocromo (SYBR Green)
produciendo fluorescencia
que es medida por el
termociclador apto para PCR
en tiempo real.
• Ventaja  Utiliza cebadores
normales para su realización.
Es mucho más económica
que la que usa sondas
específicas.

14. Q-PCR, técnicas de sondas
• Utilizan una sonda unida a
dos fluorocromos que
hibrida en la zona
intermedia entre el cebador
forward y el reverse.
• Si la sonda está intacta,
presenta una transferencia
energética de fluorescencia
por resonancia (FRET). Sin
embargo si la sonda está
dañada no.
• Esto permite monitorizar el
cambio del patrón
de fluorescencia y deducir el
nivel de amplificación del
gen.