1. INTRODUCCIÓN
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no específico de
infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva nos permite
asegurar que este virus sea el agente causal.
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que
demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta
está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello
se conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la
hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y
elreceptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce
como neutralización vírica.
Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el
genoma viral capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto
formar
puentes entre los glóbulos para constituir una red. Este fenómeno conocido como
Hemaglutinación fue primeramente descrito para el análisis del virus Influenza. En
este caso la proteína hemaglutinante (hemaglutinina) en la superficie del virión es
una glicoproteína que en adición de la Neuraminidasa se proyecta en la envoltura
viral. El virión se unirá a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que
lleve
los receptores complementarios que en este caso son moléculas de Acido
NAcetilNeuramínico.
El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los
Paramyxovirus; es un patógeno primario de aves en quienes produce infecciones
respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a
parálisis y muerte; en el humano puede ocasionalmente producir conjuntivitis
autolimitada.
Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar

2. aglutinación, por lo que la Hemaglutinación no es un indicador sensible de la
presencia de pequeñas cantidaes de viriones pero por su simplicidad constituye un
ensayo conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones.
INHIBICION DE LA HEMOAGLUTINACION
(I.H.A)
MARCO TEORICO
DEFINICION:
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que
demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta
está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello
se
conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la
hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y
el
receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce
como neutralización vírica.
Caracteristicas:

3. Pruebas altamente específicas y sensibles.
Se pueden adaptar fácilmente a laboratorios de escasa infraestructura por el
bajo costo de los reactivos.
Son simples y rápidas.
Hay dos métodos para realizar la IHA, en uno se realizan diluciones decrecientes
de virus y se enfrentan a cantidades constantes de suero (alfa) y diluciones
decrecientes de suero que se enfrentan a cantidades constantes de virus (beta). El
método beta es el más comunmente utilizado
Las pruebas de IHA constituyen métodos de diagnóstico e investigación sencillos y
útiles en la:
a.
Identificación de virus.
b.
Determinación de la relación antigénica entre virus aislados.
c.
Identificación
y
cuantificación
Antígeno
Anticuerpos
Ag-Ac
viral
específicos
aglutininas
de
anticuerpos
contra
virus.
bloquean Inhibición de
HA
FUNDAMENTO :
La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera
Primera fase: Reconocimiento Ag-Ac.

4. OBJETIVOS:
1. El alumno desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para
determinar el título de un suero problema.
2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar la
prueba de IHA.

5. MATERIALES:
Muestras Biologicas
-Globulos rojos de pollo
-Suero o plasma del pollo
-Solución SSF.
- Tubos de ensayo
� Pocillos.
� Micropipetas de volúmen variable de 0.5- 1000 μl.
� Puntillas para micropipeta.
�
Vacuna
‘’TRI
AVIAR´´
(
casther,v.bronquitis,Gumbero)
.
� Alcohol y algodón.
PROCEDIMIENTOS:
RESULTADO DE LA PRÁCTICA DE HA:
Dilución 1/16 de la vacuna viral = 4 UHA
viriones
atenuados,
cepa
New

6. CALCULOS PARA DILUCION DE LA VACUNA
Volumen suficiente para realizar IHA= 7500ul
C1.V1 = C2.V2
100. V1 = 1/16.7500
V1= 468 ul
Ssff
7500- 468 = 7032 ul +
Antígeno viral
468 ul
------------Volumen final
7500 de dilución con 4UHA
DILUCIÓN DE GR DE POLLO AL 1%
Metodología
Lavar los glóbulos rojos de pollo (de 3 a 4 ciclos de lavado) de la misma forma
como se preparó para la HA, partir del último lavado preparar la solución de los
GR al 1%
C1.V1 = C2.V2
100. V1 = 1%. 12000
V1= 120ul

7. Ssff
12000-120 = 11880 ul +
Globulos rojos
120 ul
------------Volumen final
12000 ul
 PREPARACION DE GLOBULOS ROJOS AL 1 % CANTIDAD SUFICIENTE
Centrifugar a 4200 rpm
obtención
Plasma
GR
POLLO
Paquete globular
Plasma
Alícuota de sangre y agregar
Cl/Na hasta las ¾ partes del tubo
Paquete globular separar una

8. Obtención de glóbulos
rojos lavados al 100 %
Homogenizar por inversión y centrifugar a 3400 rpm d
Decantar y agregar nuevamente cl/ Na , centrifugar
Realizar este procedimiento por tres veces
 RECONSTRUIR LA VACUNA
TRIAVIAR Y DILUIR 1/16 para obtener
4UHA
Según los cálculos mencionados como se indica anterior
 HACER DILUCIONES AL DOBLE DEL SUERO PROBLEMA, DESDE 1/2
HASTA 1/256 INCLUIR UN POZO CONTROL QUE NO CONTENDRÁ
ANTISUERO NI VIRUS. EL PROCESO SE DESCRIBE A CONTINUACIÓN
1_dispensar 75 ul de SSFF a todos pozos del 1 al 9 de la microplaca.

9. 2_dispensar en el pozo Nº1 (75 ul del suero problema) y mezclar por aspersión y
dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:2. Transferir 75 ul de
ésta
dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente Repetir sucesivamente este
procedimiento hasta el pozo No. 8 que corresponderá a la dilución 1/256.
Desechar del pozo Nº8 (75 ul es el exceso),dejar reposar por 10 minutos con la
finalidad de que interactúen el antígeno viral con el anticuerpo
.
NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución del suero al pozo
No. 9 que sirve como control.
3_ dispensar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antígeno
viral
en un volumen de 75 ul

10. Agitar la microplaca para que reaccionen los sustratos y dejar en reposo durante
10
min.
4_ Agregar 75 ul de la suspensión de glóbulos rojos a todos y cada uno de los
pozos, incluido el control Agitar y dejar a temperatura ambiente hasta haya
sedimentado.
5_ Determinar el título del antisuero identificando la última dilución que presenta IHA.
PATRONES DE SEIDIMENTACION
IHA (POSITIVA) IHA (NEGATIVA)

11. CONCLUSIONES
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no
específico de infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva
nos permite asegurar que este virus sea el agente causal.
En la práctica realizada no se logro observar con éxito los resultados correctos,
debido a factores interferentes por lo que no se observo con eficacia la
aglutinación beta que era lo que se buscaba , por el contrario se llego a observar
resultados ilógicos a lo que se esperaba.