conceptos básicos sobre diversas pruebas empleadas en el laboratorio veterinario para diagnostico en patología clinica.

1.  Integrantes:
 Magda Garzón
 Verónica Obando
 Edwin Tapia
 Bladimir Pantoja
 Fernando Portillo
 Julio Rubio
Profesor: Carlos Alberto Chávez
Universidad de Nariño

2.  Técnica de laboratorio que permite mediante
la formación de reacciones inmunológicas
provocadas en el suero sanguíneo (pruebas
serológicas) determinar la aparición de
anticuerpos, frente al agente infectante.
http://serologiade.blogspot.com.co/

3.  Es un examen de sangre que se utiliza para
detectar la presencia de anticuerpos contra
un microorganismo. En los análisis
serológicos se buscan anticuerpos específicos
producidos por el sistema.
http://www.suizavet.com/toma-de-muestras.php

4.  Las respuestas inmunitarias contra la mayoría
de los antigenos inducen la producción
especifica de anticuerpos y linfocitos T
efectores.
 Este reconocimiento entre el antigeno –
anticuerpo o linfocito sienta las bases del
diagnostico inmunológico.

5. La medición de las interacciones Antigeno-
Anticuerpo con fines diagnósticos.
Se realizan en 2 vías:
 Utilización de anticuerpos específicos
para detectar el antigeno.(diagnostico
directo)
 Utilización de antigenos específicos para
detectar anticuerpos. (diagnostico
indirecto)

6.  La reacción entre el Ag y el Ac es de
naturaleza física y química.
 La fuerzas que los mantienen unidos, son de
tipo no covalente, como la atracción
electrostática, los puentes de hidrógeno y las
fuerzas de Van der Waals.

8.  • Es la fuerza de
unión entre el Ac con
su Ag
 • Determina la
atracción entre ellos.
 • Esa fuerza es la
suma de las fuerzas
de los enlaces que
intervienen en la
unión.

9.  Es una medida de la fuerza de
unión y estabilidad del
complejo: Ag multivalente – Ac
multivalente.
 • Ac multivalentes: Tienen
más de un punto de unión
para Antígenos.
 • Ag multivalentes: Tienen
varios determinantes
antigénicos (más de un punto
de unión para los Ac).
 • La fuerza de unión es mayor
que la suma de las afinidades
de cada uno de los puntos de
unión

10.  • Si un anticuerpo reacciona solo con un Ag:
Es muy específico.
 • Si un Ac reacciona con varios Ag: Tiene una
especificidad baja. Se habla de REACTIVIDAD
CRUZADA.
 • Esto ocurre porque varios antígenos tienen
uno o más determinantes antigénicos iguales
o similares, capaces por tanto de unirse al
mismo Ac.

11.  Muestra: suero.
Se debe obtener en forma aséptica.
No usar anticoagulante.
Dejar coagular la sangre en forma inclinada.
No refrigerar hasta que el coagulo se haya
retraído.
Transportar en refrigeración.
Almacenar el suero en congelación.

12. La cantidad de sangre que se obtendrá
depende de la especie animal:
Bovinos 10 ml.
Equinos 10 ml.
Cerdos 5 ml.
Ovinos y caprinos 5 ml.
Pollos 1 ml.
Gallinas 2 ml.
Perros y gatos 2 – 3 ml.

13.  ANTIGENOS.
Constituidos por el microorganismo o parásito.
1. Antigenos crudos: presentan el inconveniente
de dar reacciones heteroespecificas.
2. Antigenos puros.
3. Antigenos altamente purificados:
Anticuerpos monoclonales.
Gérmenes recombinantes.

14.  Los sueros deben estar en buenas condiciones no
hemolisados.
 El suero debe agitarse suavemente, pues los
anticuerpos sedimentan.
 Los antigenos deberán conservarse en
refrigeración.
 Realizar controles de calidad a los antigenos,
periódicamente.
 Monitorear la temperatura del laboratorio (18 – 26
grados centigrados)

15.  El tiempo de incubación debe controlarse
con precisión.
 No se debe mantener los reactivos a
temperatura ambiente mas de lo necesario.
 Manejar los materiales que se usaron como
si fueran infecciosos.
 Utilizar controles positivos y negativos.
 No se debe hacer modificaciones al
protocolo de la prueba recomendado.

16.  Utilizar pequeñas cantidades de reactivos.
 Sensibles y especificas.
 Reproducible.(Ínter laboratorios)
 Antigenos inactivados.
 Sencilla.
 Equipo y reactivos accesibles, económicos.

17. 1. Pruebas de unión primaria.
Miden la cantidad de inmunocomplejos
(unión antigeno-anticuerpo), utilizando
radioisótopos, colorantes fluorescentes o
enzimas.
 ELISA
 Inmunofluorescencia.

18.  Los complejos se agregan y originan
fenómenos perceptibles visualmente. Son
reacciones no reversibles.
 Dependen en gran medida del estado físico
del antigeno, de la temperatura, de los
electrolitos presentes en la reacción, de la
afinidad y avidez en la interacción
antigeno-anticuerpo, proporción entre
ambos, tipo de inmunoglobulina presente.

19. 2. Pruebas de unión secundaria:
La reacción antigeno – anticuerpo va
seguida de una segunda reaccion.
Si el antigeno es soluble la reacción que se
da es de precipitación.
Si el antigeno es particulado (suspensión) la
reacción es de aglutinación.

20.  Son de menor sensibilidad que las primarias,
pero mas clásicas.

21.  Aglutinación: en placa, en tubo.
 Precipitación: Inmunodifusion en agar,
inmunoelectroforesis
 Hemoaglutinación.
 Inhibición de la hemoaglutinación.
 Fijación de complemento.
 Neutralización y Seroneutralizacion
realizadas in vitro.

22.  Pruebas de unión terciaria.
Evalúan la capacidad de los anticuerpos de
neutralizar la capacidad biológica de un
antigeno ( virus, toxinas).
Identificación de toxinas.
Identificación de virus
Medir la actividad de un anticuerpo para
neutralizar a un microorganismo.
Pruebas de protección (anticuerpos)

23.  Se basan en la medición de las
manifestaciones biológicas que el sistema
inmune desarrolla frente a un antígeno en el
animal, incluyendo la evaluación del efecto
protector real de los anticuerpos o su
capacidad de neutralizar la acción biológica
del antígeno.

24.  Identificación de problemas de salud.
 Determinación de la distribución de una
enfermedad.
 Determinación de la incidencia y prevalencia de
una enfermedad.
 Evaluación del sistema inmune del individuo o de
una población.
 Medición de la inmunidad materna.
 Programación de calendarios de vacunación.
 Evaluación de programas o campañas de
vacunación.

25. patología clínica
serología
HEMOAGLUTINACION

26. hemaglutinación
Rta inmune
serologia
diagnostico
Inmunidad

27. La aglutinación es un agregado de células o partículas debido a una
formación entrelazadas, En las reacciones de aglutinación, un
anticuerpo puede unirse a la vez a dos antígenos, así mismo cada
antígeno puede unirse a varios anticuerpos y formar un entramado
de complejos antígeno-anticuerpo.

29. Anticuerpos policlonales y monoclonales

30. Dos fases básicas:
1.- Rx Ag---Ac
2.- partículas agregadas

31. En estas técnicas se hacen
visibles los complejos Ag-Ac
por la aglutinación que
producen los anticuerpos
cuando el Ag forma parte o se
ha unido artificialmente a la
superficie de glóbulos rojos,
plaquetas, leucocitos etc.

32. Hemoaglutinación directa
La presencia de antígenos en la superficie
de los glóbulos rojos se puede detectar
por la hemoaglutinación producida cuando
se añade un antisuero con anticuerpos
frente a dichos antígenos.
• identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre
heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes: anti-A,
anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habrá aglutinación
cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero
añadido. De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la
determinación de los distintos grupos Rh.

35. Hemoaglutinación indirecta
Se basa en el principio de la inhibición de la hemoaglutinación.
Para su realización se precisan glóbulos rojos a los cuales se les
ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar.

37. Incompatibilidad en
las transfusiones de
sangre
aglutinación
Grupo A: Tiene proteína A en la
superficie del glóbulo rojo.
Grupo B: Tiene proteína B en la
superficie del glóbulo rojo.
Grupo AB: Tiene ambas
proteínas A y B.
Grupo O: No tiene ninguna (A o
B) en la superficie del glóbulo
rojo

39.  Enzyme
 Linked
 Inmuno
 Sorbent
 Assay
https://www.pig333.com/3tres3_common/art/pig333/4500/company_news_4500_E
LISAjpg

40.  Las aplicaciones mas interesantes se
iniciaron en el campo de la microbiología y
parasitología, por los grupos de Alister Voller
y Dennis Ruiteberg en el Institutr of Public
Health del estado de Dutch.
 Voller y Bidwell introdujeron el uso de placas
de 96 pocillos.

41.  Son Utilizados en el Dx Medico, la industria
de alimentosy el estudio y control del medio
ambiente.
 En estudios Serologicos, hematológicos,
endocrinológicos, oncologicos en los
transplantes. En M. forence y Antropologia.
 Con propósitos médicos se han utilizado en la
determinación de hormonas y Proteinas
Plasm., Ag tumorales, drogas, Ag y Ac de
m.o. parasitos, hongos, bacterias y virus.
 Los resultadoselementos Dx, Info de Enfm.
y coadyuvan a la planificación del Tto.

43.  El ELISA se basa e el uso de Ag o Ac
marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad
tanto inmunológica como enzimática.
 Al estar uno de los componentes (Ag o Ac)
marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte (inmunoadsorbente) la
reacción Ag-Ac quedará inmovilizada

45.  Fácilmente revelada mediante la adición de
un substrato especifico que al actuar la
enzima producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso
de un espectrofotómetro o un colorímetro.

46.  Modelo analítico que depende de la Rx Ag-Ac
 Determinacion de (Ag) o un (Ac) mediante el
uso de uno de ellos inmovilizado en fase
solida y el otro en solución
 Cualitativo, cuantitativo
 Dependiendo del diseño se puede emplear
Ag, hatenos o Ac marcados con una enzima
para revelar Ag, Ac, hormonas o fármacos
presentes en fluidos corporales.
 El producto de la Rx puede ser detectado y
cuantificado mediante marcador enzimático
con un sustrato apropiado.

47.  La Rx consiste: Al suero problema se le
agrega un conjugado que son Ac dirigidos
contra Ac especificos o Ag. Los cuales se
unirán a una enzima.
 Las enzimas son capaces de modificar al
sustrato en presencia de un cromógeno
produciendo un producto coloreado que es
detectado visualmente o por
espectofotometria.

48.  Anticuerpos marcados:
 ELISA Directo
 ELISA Indirecto
 ELISA sándwich
 Doble (DAS)
 Heterólogo (HADAS)
 Antígeno marcado
 ELISA competitivo

52.  Aalta Sensibilidad y Especificidad,Sencillo, bajo costo
reproducible y adaptable Versatil.
 SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la tecnica
para detectar las menores concentraciones posibles
de los anticuerpos(o antigenos) buscados
 ESPECIFICIDAD: expresa la capacidad de esta tecnica
para diferenciar los anticuerpos especificos(o
antigenos) buscados de otros presentes en el material
de estudio.
 Consigue mediante el uso de fase solida una
separación fácil entre la fracción retenida y la
fracción libre.
 Puede detectar sustancias en el orden de los
nanogramos y picogramos/ml
 Automatizacion

53.  Poca cant. de muestra, suero problema (ul)
 Enzimas de menor costo y seguras para el
operador
 Menor tiempo
 Mas estables, mayor periodo de validez
 Pureza, estabilidad y cant del Ag
 Pureza y calidad del Ac conjugado

54.  1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de
antígenos o anticuerpos.
 3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo
o antígeno tapizado en el pocillo
 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o
anticuerpo no unido
 5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la
enzima
 6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o
anticuerpo
 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no
unida
 8. Adición del substrato
 9. Unión del substrato a la enzima
 10. Desarrollo del color

55.  Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden
resumir en dos grandes grupos:
 ELISAs para detectar Ag: ELISAs sándwich.
 ELISAs para detectar Ac: ELISAs indirectos.

58.  COMPETITIVO
 Con reactivo limitante, para dosificar partículas
pequeñas con relativa pureza en una muestra y
pueden ser marcados con una enzima
 Detectan Ac específicos independientemente de
su isotipo

59.  NO COMPETITIVO
 Tambien llamado inmunometrico “Reactivo en
exceso” (Inmunopatologia de Enf. Infecciosas)
 Detectan Ag y Ac

60.  Se puede utilizar 2 tipos de ustancias:
 Las que favorecen la adsorción física (por
fuerzas electrotaticas) de las mol. De Ag o
Ac: Poliestireno, cloruro de polivinilo,
polipropileno, nylon y silicona
 Las que permiten fijación covalente de eos
reactivos: Acrilamida, celulosa e
isotiocianato
 Tubos, placas de microtitulacion requieren
menor cantidad de reactivos, muestra y son
aptas para la automatización

61.  Clasificacion
 Solubles: Proteinas, Glicoproteinas , CHOS y
Acidos Nucleicos: Unidos a fase solida
(Adsorcion)(Union covalente)(adsorción-fijación—
Glutaraldehido)
 Particulados: Celulas

62.  Ag
 Por sensibilidad es necesario contar con un
Ag purificado y estable que asegure la
reproducibilidad
 Ag parasitario= Mezclas complejas de
macromoléculas inmunogenicas entre las que
se hallan Ag específicos y sust. Ag que
provienen del medio de cultivo o del huésped
 La puruficacion de Ag ha mejorado
sustancialemente con empleo de Ing.
Genetica, AcMo y sueros

63.  Enzimaticos (Ps Alcalina,Peroxidasa)
 Fluorescentes (Fluoroinmunoensayo)
 Ligandos (Biotina, Avidina)
 Luminiscentes (Luminoinmunoensayo)
 Particulas (Liposomas)
 Espectofotometria
 Fluorescencia
 Quimioluminiscencia (Luminol)
 Electro-quimica

65.  Actividad especifica
 Pureza
 Estabilidad
 Solubilidad
 Facil medición y detección
 No se reduce la actividad por la conjugación
 Bajo costo
 Estables en amplio intervalo de condiciones
del ensayo
 Con grupos funcionales adecuados para su
acción Ac o Ag

67.  Luego de la incorporación de cada
componente (Ag-Ac conjugado, sustrato
enzimático), debe efectuarse una serie de
lavados con el fin de eliminar el exceso que
no se le haya fijado (físico-inmunológico) al
sopsorte solido
 Dependiendo del ensayo, habitualmente se
realizan de 3 a 6 en c/u de las etapas

68.  El tiempo también depende del ensayo
 Como solución se emplea buffer pH 7,2 que
tiene además Tween 20, el cual facilita la
separación de las sustancias actuando como
humectante, detergente y fungicida

73. FIJACION DEL COMPLEMETO
www.lookfordiagnosis.com

74.  Nació en Soignies el
13 de junio de 1870.
 La reacción de
fijación del
complemento --
(antes “alexina”)
descrita por Bordet
(fenómeno de
Bordet, o fenómeno
de Bordet-Gengou)
http://www.historiadelamedicina.org/bordet.html

75.  Método de elección para el Dx indirecto de
enfermedades infecciosas importantes en
veterinaria: brucelosis, paratuberculosis.
 Posee alta especificidad y sensibilidad.

76.  Tiene como fundamento la utilización de una
cantidad precisa de complemento sérico
(cobayo) – se utiliza de manera total en
presencia de la reacción de un Ag con su Ac
homologo.
www.scielo.org.co

77. Una segunda parte de la prueba consiste en:
una suspensión de glóbulos rojos de carnero
(sensibilizados con Ac anti-globulos rojos) – en
el complemento producen hemolisis del glóbulo
rojo dando un fenómeno claramente visible.

78.  Si en la primera fase la reacción del
complemento presente se utiliza, en la
segunda fase no hay complemento y el
fenómeno hemolítico no ocurre.

79. Pero si en la primera fase el complemento no
se utiliza porque no hay reacción Ag-Ac el
complemento queda libre y se utiliza en la
segunda fase dando un fenómeno visible de
hemolisis.

80. http://es.slideshare.net/cocogonzalez790/brucelosis-46381424

81.  Son pruebas de tipo cuantitativas – determinar
concentraciones del Ac
 Son complicadas y de mayor duración que otras pruebas
serológicas. Se emplean en el Dx de algunas infecciones
(brucelosis, perineumonía contagiosa virus respiratorio
sincitial etc.)

82. http://es.slideshare.net/bill12/pruebas-serologicas-14841066

84. 1954
1940
Albert H. Coons
Desarrollo de la
Inmunofluorecencia
1912-1978
McDevitt,t , memorias biográficas de la Academia Nacional de Ciencias.

85. Fluorocromo
Isotiocianato de fluoreceina
Isotiocinato de
tetrametilrodamina

86. lámpara
Filtro
Excitación
Filtro de
barrido
Lente
ocular
Espejo
dicroico
Lente
objetivo

87. Fluorocromo
Longitud de onda de
absorción (nm)
Longitud de onda
de emisión (nm)
Cascade blue
374-403
422-430
Fluoresceína
(FITC)
494 520
Rodamina (TRITC) 540
570
Naranja de
acridina
460-502 526-650
Yoduro de
propidio
536 617

88. Uso

89. Directa Indirecta
Citometría de
flujo

92. Ventajas desventajas
Rápida
Amplificación
mínima
Unión especifica
duracion
Marcaje

93.  RABIA
 CAMPYLOBACTER
 LISTERIA
 CLOSTRIDIUM
 MICOBACTERIUM

96.  ViLeF
 DISTEMPER
 IBR
 LEUCOSIS
 RABIA
 Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino
(PRRS)
 DEL VIRUS DE NEWCASTLE Y GUMBORO

97. Ventajas desventajas
Sensibilidad
No cultivos
Rapida
Costo
Trabajo
personal

98.  Citometría de flujo:
 Análisis de células
 Núcleos
 Cromosomas
 mitocondrias
 otras partículas en suspensión
 Utiliza Ac monoclonales fluorescentes para la
detección de Ag de superficie celular
mediante un láser de luz que separa
específicamente las células marcadas.

99.  La celda de flujo laminar,.
 Un sistema de medición --los sistemas ópticos.
 Un sistema de iluminación lámparas (Hg, xenón) láseres
(argón, criptón, tinturas), láseres (de argón ), láser
rojo de helio-neón , verde de helio-neón, ultravioleta de
helio-cadmio; láseres de diodo (azul, verde, rojo,
violeta).
 Un detector y un conversor de
señales, ----computador.
 Un sistema de amplificación, lineal o
logarítmico.
 Un ordenador para el análisis de las
señales

100.  Rápida
 Sencilla
 Suficientemente sensible
 Económica
 Fácil

101.  lupus eritematoso sistémico
 identificación precoz del rechazo en
pacientes que han recibido un trasplante
 anemia aplásica
 enfermedades inmunológicas del pulmón
 Leucemias
Si bien la citometría de flujo no se aplica mucho en veterinaria, su uso
en futuro cercano aumentará de manera considerable en la medida que
sea difundida la posibilidad de su aplicación en otras especies distintas a
pequeños roedores

102.  Lequin. R.M. Enzyme Inmunoassay (EIA),
Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay (ELISA),
Clinical Chemestry. 2005
 Van Weemen, B.K. The Rise of EIA/ELISA
Clinical Chemestry. 2005
 Yuan, Y.; Wang, W.; Chiou, N.-R.; Epstein,
A.J.; Lee, L.J. Design and Testing of a
 Microfluidic Biochip for Cytokine Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay.
Biomicrofluidics 2009