1. INMUNODIAGNOSTICO
DR. CARLOS ESQUERRE AGUIRRE
MEDICO PATOLOGO CLINICO HVLE

2. INMUNOANALISIS
SON TECNICAS PARA
DETECTAR Y CUANTIFICAR
AG O AC.
UN IE DEBE SER CONFIABLE,
OPORTUNO Y EFICIENTE.

3. Inmunoanálisis
La gran especificidad de Ac, los hace de
gran utilidad como reactivos para detectar,
cuantificar y purificar Ag
Debido a que puede producirse Ac
prácticamente frente a cualquier molécula,
se les puede usar para estudiar cualquier
tipo de molécula

4. Inmunoanálisis
Basado en la presencia de un Ag o Ac,
cuya cantidad puede determinarse por
medio de una molécula indicadora
Cuando la molécula indicadora es marcada
con un radioisótopo, (Yalow y Berson,
1959) se puede cuantificar ultizando
instrumentos que detectan la
descomposición radioactiva. RIA

5. Inmunoanálisis
Cuando la molécula indicadora está unida
covalentemente a una enzima, puede
cuantificarse determinando la capacidad de
la enzima de transformar un sustrato
transparente en un producto coloreado
A este se le llama enzimoinmunoanálisis

6. CLASIFICACION DE IE
POR USO DE MARCADOR
SIN MARCA: PRECIPITACION,
INMUNOELECTROFORESIS,
NEFELOMETRIA,
INMUNOTURBIDIMETRIA.
CON MARCA: ISOTOPICOS Y NO
ISOTOPICOS (ENZIMATICOS Y NO
ENZIMATICOS)

7. CLASIFICACION DE IE
DE ACUERDO AL METODO
DE DETECCION:
COLORIMETRICO
FLUORESCENTE
QUIMIOLUMINISCENTE

8. CLASIFICACION DE IE
SEGÚN EL DISEÑO DEL
SISTEMA DE REACCION:
HOMOGENEO Y
HETEROGENEO
COMPETITIVO O NO
COMPETITVO

9. NOMENCLATURA
SE HA RECOMENDADO LLAMAR:
INMUNOENSAYO (RADIO, ENZIMO Y
FLUOROINMUNOENSAYO) A
AQUELLOS QUE SON DE DISEÑO
COMPETITIVO.
ENSAYO INMUNOMETRICO
(INMUNORADIOMETRICO, ETC)
PARA AQUELLOS NO
COMPETITIVOS

10. EMPLEO DE MARCADORES Y
NOMENCLATURA DE LOS IE
EL ANALISIS TIPO I (EXCESO DE
ANTICUERPO) ESTA BASADO EN
MARCAR EL AC REACTIVO.
EL TIPO II (EXCESO DE ANALIZADO),
SE MARCA LA SUSTANCIA
ANALIZADA.

11. Coloides
metálicos
Látex
Enzima
Marcado
Fluoróforo Radioisótopo
Hematíes Partículas de
colorante

12. LIMITES DE DETECCION DE
MARCADORES DE INMUNOENSAYOS
MARCADOR
 FOSFATASA
ALCALINA
 EUROPIO
QUELATO
 YODO 125
 ESTER DE
ACRIDINIO
 RUTENIO

13. CRITERIOS PARA SELECCIONAR
UN MARCADOR ENZIMATICO
 PUREZA
 SENSIBILIDAD
 FACILIDAD DE VELOCIDAD DE
DETECCION
 AUSENCIA DE FACTORES QUE
INTERFIERAN
 GRUPOS REACTIVOS POTENCIALES
 ESTABILIDAD
 IDONEIDAD PARA UN EIA HOMOGENEO

14. Ventajas EIA frente a RIA
Se evita la exposición a radiaciones
Reactivos más estables
No se requiere instalaciones ni
autorizaciones especiales
Mediciones rápidas y fácilmente
automatizables
Costo

15. ELISA
Elemento de captura en la fase sólida.
Anticuerpo en el suero del paciente (+) o (-)
Reacción con el conjugado
Cambio de aspecto del substrato por acción de la Enzima
.
El cambio de aspecto del substrato es proporcional a la
cantidad del elemento “puente” es decir el anticuerpo presente
en el suero del paciente positivo.
El suero que no aporta el elemento puente (anticuerpo) , no
mantiene a la enzima en el sistema y por lo tanto no se
producen cambios en el aspecto del substrato y es negativo

16. ELISA
(+) (-)
Antígeno-Anticuerpo y conjugado antiglobulina - Enzima
Cambio de color del substrato

17. Respuesta Inmunológica
Ag IgG
Concentración relativa
IgM
Infección
Días Semanas Meses Años
Seroconversión

18. ELISA
Reacción antígeno-
anticuerpo
Antígeno
Anticuerpo
Ag - Ac

19. Elisa : Reacción
muestra - conjugado

20. Elisa: Reacción del sustrato
Cromógeno
O2 TMB
H 2O 2
H2O
Tampón sustrato

21. Bioelisa :
Leyendas
Anticuerpo Anticuerpo IgM
de captura
Antígeno Antígeno
recubriendo
el pocillo
Anticuerpo IgG
Conjugado

22. Detección de IgG
TMB
Fase
Solida
Muestra
Conjugado

23. Detección de Antígeno
TMB
Fase
Solida
Muestra
Conjugado

24. Detección de IgM: Inmunocaptura
TMB
Fase
Solida
Muestra
Conjugado

25. Protocolo standard bioelisa:
1.- Agregar muestra
Lavado
37°C

26. Protocolo standard bioelisa:
2.- Agregar el Conjugado
Lavado
37°C

27. Protocolo standard bioelisa:
3.- Agregar del Sustrato
TMB
H2O2
H2O2 TMB TMB
Temp. Amb.
TMB H2O2
H2O2 TMB

28. Protocolo estándar bioelisa:
4.- Agregar Solución de
parada
H2SO4

30. Protocolo estándar bioelisa:
4.- Lectura de
Absorbancias Fotocélula
LECTURA
DENSIDADES OPTICAS
Cálculo de resultados Filtro de 450 nm
Fuente de luz

31. Agregar muestras y controles
Incubación
Lavado
Dispensar Conjugado
Incubación
Lavado
Dispensar Sustrato
Incubación
Agregar solución de parada
Lectura a 450 nm

32. Sensibilidad Especificidad
Reproducibilidad Estabilidad Facilidad de uso
Automatizable

33. Elisa
Guía de errores

34. Causas de error en el ELISA
Leer y entender el
manual de usuario
Mejor
Programar el trabajo
prevenir
Preparar con tiempo
el material

35. Causas comunes de error en el Elisa
Errores de dilución durante la preparación de
controles y reactivos
Rascado de la fase sólida durante la adición de
muestras y/o reactivos
Pipeteo
Utilización de un tamaño de punta incorrecto
Comprobar que la pipeta no esté bloqueada y que
dispense correctamente
Evitar contaminación cruzada con muestras y/o
reactivos
Utilize puntas nuevas cada vez

36. Causas comunes de error en el Elisa
Uso de instrumentación en mal estado. Asegurese que los
instrumentos funcionen correctamente y estén calibrados.
Uso de los kits todavía frios. Permita que los kits y las
muestras adquieran la temperatura ambiente antes de ser
utilizados
Mezclar componentes de diversos lotes. Los reactivos
están optimizados para cada lote de fabricación.
Contaminación:
Salpicaduras de muestras o reactivo durante cualquier paso
intermedio de la técnica
Uso de puntas recicladas
Uso de viales sucios o mal secados en la preparación de los
reactivos

37. Causas comunes de error en el Elisa
Calidad del agua destilada/desionizada.
Parámetros como pH, iones, puede afectar la
cinética de los Elisas. La pureza del agua es
muy importante.
No utilizar los reactivos del kit pasada su fecha
de caducidad
Retornar los kits a la nevera, entre 2-8°C
inmediatamente después de usarlos.
Muy importante: Conserve las tiras no utilizadas
junto con la bolsita desecante, en la bolsa de
plástico con cierre que se incluye en cada kit

38. Errores en el ELISA
Esquema de investigación
Nº Acción OK?
1 Revisar el procedimiento y determinar si ha habido
algún error u omisión
2 Comprobar fecha de caducidad de los componentes
Parámetros físicos: Tiempo
3 Temperatura incubación
Temperatura ambiente
4 Equipo de laboratorio: Pipetas, lavador, lector
5 Calidad del agua desionizada / destilada
6 Preparación y conservación de los reactivos
7 Los controles han funcionado según lo esperado ?
8 Estaban los reactivos a temperatura ambiente?

39. ¿Por qué falsos positivos?
Espacios libres
Antígeno HIV
cubiertos por la
soluble fijado en
Albúmina
la placa
bovina
IgG contra Albúmina bovina
IgG específica contra HIV
HIV Positivo verdadero Falso positivo

40. ¿Por qué falsos positivos?
HIV Positivo verdadero HIV Falso positivo

41. RADIOINMUNOANALISIS
 Así como en el sistema ELISA usamos una
enzima y valoramos los cambios en el aspecto del
substrato , en el RIA nos valemos de un
ISOTOPO RADIOACTIVO unido a sistemas de
anticuerpos .
 Las lecturas se hacen por una valoración de la
cantidad de radiación emitida , la que es
proporcional a la concentración del analito
estudiado .

42. RADIOINMUNOANALISIS
VALIDACION: CONSISTE EN
COMPARAR SU RENDIMIENTO CON
OTRO DE REFERENCIA
TRANSFERIBILIDAD:
TIEMPO DE REALIZACION:
SUSTANCIA PROBLEMA MARCADA.

43. RADIOINMUNOANALISIS
LOS METODOS RIA OFRECEN
UN CONSIDERABLE
ATRACTIVO POR SU EXTREMA
SENSIBILIDAD, SU RELATIVA
FACILIDAD DE CREACION Y SU
COSTO RELATIVAMENTE
BAJO.

44. COMPONENTES DEL
SISTEMA RIA
SUSTANCIA: AG NO MARCADO.
AG MARCADO.
AC.
MEDIO DONDE OCURRE LA
REACCION.
ISOTOPOS COMO TRAZADORES: 3H Y
125
I.

45. QUIMIOLUMINISCENCIA
El principio de la prueba es similar al de
ELISA es decir una reacción de antígeno y
anticuerpo .
Esta reacción se objetiva por la producción
de luz a partir de una molécula de alta
energía que es descompuesta por actividad
enzimática.
La cantidad de luz producida es
proporcional al analito investigado.

46. VENTAJAS DE LA
QUIMIOLUMINISCENCIA
 PRESENTAN UN GRAN INTERVALO
LINEAL.
 BAJO LIMITE DE DETECCION.
 ELEVADA ESPECIFICIDAD Y RAPIDEZ.
 LA MAYORIA SON PROCEDIMIENTOS DE
UN PASO.
 NO ES NECESARIO LARGAS
INCUBACIONES.
 ESTABILIDAD DE COMPUESTOS
LUMINISCENTES

47. FACTORES QUE AFECTAN
LAS MEDICIONES QLC
EL PH ES UNA VARIABLE
IMPORTANTE.
LAS REACCIONES SON
DEPENDIENTES DE LA
TEMPERATURA.
LOS COMPONENTES SERICOS COMO
ADENINA Y NUCLEOTIDOS DE
PIRIDINA. (LAVADOS).
LA LUZ AMBIENTAL

48. ELECTROQUIMIOLUMINISCENCI
A
UTILIZACION DE MARCADORES
NO ISOTOPICOS MUY ESTABLES.
LA ELEVADA
DETECTABILIDAD.
EL AMPLIO INTERVALO DE
MEDIDA
LA FACIL SEPARACION DE LA

49. NECESIDADES
EMERGENTES EN LOS
ANALISIS
MENORES LIMITES DE DETECCION.
DETECCION DE ANALITOS DE BAJO
PM.
MAYOR ESPECIFICIDAD.
VELOCIDAD DE PROCESAMIENTO
DE GRAN NUMERO DE MUESTRAS.
DIAGNOSTICOS RAPIDOS.