1. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS DE LABORATORIO
TEMA 20
Reacciones de Precipitación
Las reacciones de precipitación, son las mas simples de las reacciones antígeno/anticuerpo y
en ellas se visualiza un precipitado visible, cuando reacciona un (ag) soluble (precipitógeno) y su
(ac) correspondiente (precipitina). Los precipitógenos pueden ser cualquier sustancia antigénica en
suspensión coloidal, como proteínas séricas, toxinas, extractos de bacterias, parásitos, hongos, etc.
Mecanismo de Reacción
Las reacciones de precipitación y aglutinación tienen un mismo mecanismo de reacción, y su
diferencia depende de la naturaleza del Ag. En las reacciones de precipitación el Ag además de ser
soluble, debe ser multivalente (es decir, debe contar con varias copias del mismo determinante
antigénico). Ello conlleva a la formación gradual de un entrecruzamiento o red entre los Acs
divalentes y los determinantes antigénicos de Ags adyacentes, que al alcanzar ciertas dimensiones,
el complejo formado precipita. La unión del precipitógeno y la precipitina ocurre rápidamente en
segundos, pero la formación de los precipitados y por lo tanto, su visualización, puede demorar
desde minutos, horas y hasta días.
Modalidades de las Reacciones de Precipitación
Las reacciones de precipitación se pueden realizar en: 1- Medio líquido y 2- Medio
semisólido.
Medio Semisólido: Inmunodifusión
Las reacciones de inmunodifusión, son técnicas de precipitación que utilizan el agar con
medio de soporte, en donde el Ag y/o el Ac van a difundir y en el sitio donde se encuentren en sus
proporciones óptimas, aparecerá una linea, un anillo o un arco de precipitación. Esta técnica fue
introducida por Oudin en 1946, con su método de difusión simple en un tubo.
Agar: polisacárido derivado de ciertas algas, que viene en forma granulada y se disuelve en agua
destilada o amortiguador (buffer) caliente. La solución al alcanzar la temperatura ambiente queda en
estado semisólido
La inmunodifusión se usa para el análisis cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo de
antígenos y anticuerpos en el suero y otros líquidos corporales. La interpretación del análisis es el
desarrollo de una reacción de precipitación (la formación de un complejo antígeno- anticuerpo
insoluble a partir de un antígeno y anticuerpo soluble).
Inmunodifusión Doble de Ouchterlony: Es una de las técnicas mas utilizadas para evaluar en
forma cualitativa o semicuantitativa la presencia de Ags o Acs en una muestra biológica. Se
fundamenta en el principio de que el Ag y el Ac difunden a través del agar formando líneas de
precipitación que representan complejos inmunes, los cuales pueden analizarse visualmente. Esta
prueba permite relacionar varios Ags o Acs a través de 3 tipos de patrones: patrón de identidad, de
no identidad y de identidad parcial.
Patrón de Identidad: Patrón caracterizado por la formación de dos líneas de precipitación que
confluyen en un punto y significa que en 2 muestras biológicas existe la presencia del mismo
anticuerpo específico para un determinado antígeno.
Patrón de No Identidad: Patrón caracterizado por la formación de 2 líneas de precipitación que se
cruzan por completo y significa que en una muestra biológica existe la presencia de 2 anticuerpos
diferentes, específicos para 2 antígenos.

2. Patrón de Identidad Parcial: Patrón caracterizado por la formación de 2 líneas de precipitación que
no se suponen por completo, debido a que los antígenos comparten un determinante antigénico
(Ags que reaccionan cruzadamente), con la consecuente formación de un espolón, debido a que una
de las líneas de precipitación se proyecta en el agar.
Utilidad Clínica de la Inmunodifusión de Ouchterlony
 Posibilidad de hacer diagnóstico y evaluar la evolución de enfermedades infecciosas
producidas por bacterias, hongos, virus y parásitos.
Inmunodifusión Radial de Mancini: Se Fundamenta en el principio de que exista una relación
cuantitativa entre la cantidad de Ag colocado en un pozo de una lámina de Agar-Ac y el diámetro del
anillo de precipitación resultante.
Para ello, se añade Ac a un gel de agar, que a continuación se vierte sobre un alamina de
vidrio y se deja solidificar. Cuando el agar ya esta sólido, se excavan en el mismo unos, unos
pocillos y se añade a cada uno un volumen estandár del Ag problema a diferentes concentraciones.
Las placas se incuban durante un periodo mínimo de 24 horas, durante el cual el Ag se difunde
hacia el exterior de los pocillos y forma complejos con el A. Estos se siguen difundiendo hacia el
exterior, uniéndose cada vez mas a cantidad de Ac, hasta que se alcanza el punto de equivalencia y
los inmunocomplejos precipitan formando un anillo. La superficie que abarca el anillo, que es función
del cuadrado de su diámetro, es proporcional a la concentración del Ag. La concentración de la
muestra problema se determina mediante interpolación a partir de una curva de calibración. El
proceso también se puede llevar a la inversa, utilizando un gel con Ag para determinar
concentraciones desconocidas de Ac.
Utilidad Clinica de la Inmunodifusión Radial de Mancini
• Determinación cuantitativa de Igs: IgA, IgG e IgM
• Determinación cuantitativa de C3 Y C4(componentes del complemento)
Inmunoelectroforesis: este es un método que combina el principio de la electroforesis zonal, es
decir, la separación de las proteínas presentes en una muestra biológica, mediante la aplicación de
un campo eléctrico y la inmunodifusión doble. Una vez separadas las proteínas de la muestra se
hacen reaccionar con Acs específicos y al difundir ambos elementos (Ag y Ac), se forman arcos de
precipitación característicos. Por lo tanto, se puede obtener la identificación y cuantificación
aproximada de proteínas individuales presentes en el suero, orina u otros líquidos biológicos.
En esta técnica, se cubre una portaobjetos con agar o agarosa fundidos en una solución
amortiguadora alcalina. Una vez gelificado, se abre un pocillo para colocar la muestra biólogica y un
canal para los anticuerpos específicos. Colocada la muestra se procede a aplicar una diferencia de
potencial para que ocurra la separación de las diferentes proteínas de la muestra, durante 30 a 60
minutos. Entonces se colocan los anticuerpos en el canal y se permite que las proteínas (Ags) y los
Acs difundan duante 18 24 horas.
En el caso particular en el que por ejemplo se sospeche de una mieloma productor de IgG,
se utiliza un suero control, en el cual la concentración de IgG es normal y se realiza la corrida
electroforética simultáneamente con el suero problema. Luego se añade anti-IgG humana en el
canal y se espera a que ambos reactantes difundan libremente. El arco de precipitación formado con
el suero del paciente se compara con el arco formado por el suero control.
Utilidad Clínica de la Inmunoelectroforesis
• Diagnostico de Paraproteinemias (por ejemplo: Mieloma Multiple)
• Identificación de cantidades elevadas de proteínas presentes en el liquido cefalorraquídeo,
en pacientes con diversas enfermedades neurológicas.

3. • Disminución o ausencia de inmunoglobulinas en diversos trastornos de deficiencia
inmunitaria.
Hay reacciones de precipitación anormales, llamadas de floculación, en las que la
precipitación se observa solamente en un intervalo muy estrecho de concentraciones relativas de
Ag y Ac; los agregados insolubles no se forman hasta que se ha añadido una cantidad relativamente
grande de Ag. Estas reacciones son producidas solamente por ciertos antisueros como por ejemplo:
antisueros de caballo contra la toxina diftérica y contra algunas toxinas estreptocócicas, algunos
antisueros humanos contra la tiroglobulina y anticuerpos no treponémicos humano contra la
cardiolipina del corazñon de buey, utilizado en el diagnostico serológico de sífilis, mediante la prueba
V.D.R.L.
Diagnóstico serológico de la sífilis (prueba de V.D.R.L)
La sífilis es una enfermedad de transmisión sexual de evolución crónica, con periodos
asintomáticos, cuyo agente etiológico es Treponema pallidum. Esta enfermadad se caracteriza por la
presencia de una lesión primaria (denominada chancro), una erupción secundaria que afecta la piel
y las membranas mucosas, largos períodos de latencia y lesiones tardías en la piel, los huesos, las
vísceras, los ojos, el sistema nervioso y el cardiovascular. Treponema pallidum es un patógeno
exclusivo del hombre, quien es su único reservorio. Se adquiere por contacto directo
(fundamentalmente por contacto sexual) con una lesión de sífilis reciente, por vía transplacentaria y
raras veces por transfusiones de sangre; penetra a través de la mucosa sana o la piel erosionada y
rápidamente se disemina en el organismo, por lo que la infección es sistémica desde etapas
precoces.
Existen básicamente dos estrategias que son utilizadas en la práctica para el diagnóstico de
la enfermedad:
a) Examen directo
b) Las reacciones serológicas.
El objetivo del examen directo consiste en demostrar la presencia de T. pallidum en los
exudados de las lesiones primarias (chancro) o en las serosidades de las lesiones secundarias
cutáneos-mucosas. La finalidad de las reacciones serológicas es demostrar la presencia de
anticuerpos contra Treponema pallidum o antígenos relacionados (ej. Cardiolipina) en muestras
obtenidas del paciente (ej. Suero, plasma y líquido cefalorraquídeo).
En la mayoría de las ocasiones, existen dificultades o no es posible realizar el diagnóstico
directo, por lo que el diagnóstico indirecto o serológico de la enfermedad se ha convertido en el
procedimiento mas frecuente. Los anticuerpos producidos como consecuencia de la infección por
Treponema pallidum, se clasifican operacionalmente en dos tipos: a) anticuerpos no treponémicos
(reciben también la denominación de anticuerpos reaginicos o reginas sifilíticas), los cuales
reaccionan con antígenos lipídicos (ej. Cardiolipina) y b) anticuerpos treponémicos que reaccionan
con Treponema pallidum o sus antígenos específicos.
Fundamento metodológico de la prueba de V.D.R.L
Uno de los métodos de laboratorio mas utilizados para establecer el diagnostico serológico
de la sífilis es la pruba conocida como V.D.R.L. En la prueba en referencia, una suspensión de
cardiolipina(con lecitina y colesterol) en buffer salino es mezclado con el suero del paciente, se agita
en un rotador mecánico y luego de un período de incubación adecuado (4 minutos) se observa
microscópicamente. Si el suero contiene anticuerpos reagínicos o anticuerpos no treponémicos se
observan flóculis (ó conglomerados) producto de la reacción Ag-Ac. Esta prueba puede realizarse de
manera cualitativa y semicuantitativa
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4. Se observa una suspensión homogénea de partículas delgadas y No Reactivo
cortas, semejantes a agujas, sin la presencia de conglomerados (NR)
(grumos).
Se observa la presencia de numerosos conglomerados pequeños Débilmente
repartidos entre partículas sueltas. Reactivo (DR)
Se observa la presencia de conglomerados relativamente Reactivo (R)
voluminosos medianos y grandes sobre un fondo claro.
Los procedimientos cualitativos únicamente permiten demostrar la presencia (muestra
reactiva) o ausencia (muestra no reactiva) de los anticuerpos no treponémicos en la muestra
analizada. Los procedimientos semicuantitativos (en el caso del V.D.R.L. se denomina V.D.R.L.
cuantitativo) permiten la obtención de títulos de anticuerpos que se correlacionan bastante bien con
el estado clínico del paciente, de manera que son usadas para evaluar la eficacia de los tratamientos
(el titulo de Acs no treponémicos tiende a disminuir con el tiempo en la medida que el paciente
mejora).
Si en la muestra de suero se detecta la presencia de anticuerpos reaginicos (V.D.R.L. cualitativo), se
realizara entonces la prueba semicuantitativa (V.D.R.L. cuantitativo), realizando diluciones seriadas
del suero. El titulo corresponderá a la mayor dilución del suero donde se produzca un resultado
reactivo. A continuación se presentan dos ejemplos que muestran los resultados obtenidos después
de realizado el V.D.R.L. cuantitativo y el reporte correspondiente, según el caso o suero examinado.
El reporte mencionado le es enviado posteriormente al médico que prescribió la prueba en
referencia.
Reacciones de Aglutinación y Hemaglutinación
Las pruebas de aglutinación, son aquellas reacciones que se caracterizan por la formación de
agregados visibles, cuando se mezclan antígenos (Ags) particulados o insolubles (aglutinógenos)
con sus anticuerpos (Acs) específicos (aglutininas). Los aglutinógenos mas frecuentes utilizados en
la reacción son: bacterias, partículas inertes (de latex, poliestireno, bentonita, etc) sobre la cual se
han acoplado Ags solubles. Los agentes que actúan como antígenos no necesariamente deben
estar vivos, porque reaccionan igual estando muertos.
En estas reacciones también se utilizan glóbulos rojos, bien sea para detectar Ags propios de
su membrana (tipificación ABO y factor Rh) o también para ser utilizados como reactivos en varias
pruebas de laboratorio. Cuando se utilizan como reactivos, previamente se absorben sobre su
superficie Ags solubles o Acs, se dice que los globulos rojos se han sensibilizado in vitro. Cuando se
utilizan globulos rojos, la reacción se denomina hemaglutinación y los Acs involucrados,
hemaglutininas.
1. Generalidades de las reacciones de Aglutinación
Estas pruebas pueden detectar el Ag o el Ac en una muestra biológica y se puede realizar en
forma cualitativa o semicuantitativa, no pudiéndose obtener resultados cuantitativos exactos. Sin
embargo, la facilidad con que se ejecutan y la capacidad que tienen para detectar pequeñas
cantidades de Ag o Ac (alta sensibilidad) las hacen muy útiles en el inmunodiagnóstico.
2. Mecanismo de la reacción
La unión del aglutinógeno y la aglutinina ocurre en segundos, pero la formación de los agregados,
puede tardar desde minutos hasta horas o días. En estas reacciones el Ag o aglutinógeno debe ser

5. multivalente. Esto conlleva la formación gradual de un entrecruzamiento (una red) entre el Ac y los
determinantes antigénicos, que al final de la reacción da como resultado la formación de grumos
visibles.
3. Utilidad Clínica de las reacciones de Aglutinacón:
• Detección de aglutininas en el suero de pacientes con: salmonelosis, brucelosis,
leptospirosis, fiebres tíficas, etc.
• Determinación del Factor Reumatoideo en la Artritis Reumatoidea.
• Determinación en suero de Proteína C Reactiva (PCR) en procesos inflamatorios.
• Determinación en orina de Gonadotrofina Coriónica Humana (GCH) (prueba de
embarazo).
4. Utilidad Clinica de las reacciones de Hemaglutinación:
• Tipificación ABO y Factor Rh
• Determinación de Acs anti-Toxoplasma gondi y anti-tripanosoma cruzi.
Prueba de la Anti-Inmunoglobulina Humana (Prueba de Coombs)
Este es un método ingenioso para detectar Acs incompletos o bloqueantes. Estos Acs
probablemente son moléculas bivalentes que forman un enlace monógamo (a grupos antigénicos de
repetición de la superficie celular), por lo que no se produce la reacción de aglutinación. (Figura 6)
Otros autores explican esta observación, basándose en el hecho de que en la superficie celular no
hay suficientes determinantes antigénicos para que los Acs superen la repulsión electrostática
normal que existen entre los Ags.(figura7)
Para la obtención de la anti-inmunoglobulina humana o reactivo de Coombs puede utilizarse
diversos métodos inmunoquímicos, uno de ellos es el denominado fraccionamiento Igs humanas.
Luego de esta fracción se inyecta a una especie animal heteróloga (conejo, carnero). El animal
empezara a producir Acs contra las Igs humanas (reactivo de coombs polivalente)

6. La prueba de Coombs tiene 2 modalidades:
• Prueba de Coombs Directa: Detecta la presencia de Acs imcompletos sobre glóbulos rojos
provenientes de individuos sensibilizados. El ejemplo clásico, es la detección de Acs anti-Rh
sobre los glóbulos rojos de un recién nacido Rh positivo, cuya madre es Rh negativo.
Cuando una mujer es factor Rh negativo, que da embarazada y el hijo es factor Rh positivo,
entonces de acuerdo al estado funcional de la placenta o en el momento del parto los
eritrocitos fetales pueden pasar a la circulación materna. Los glóbulos rojos fetales son
antigénicamente extraños a la madre y ella empieza a producir anticuerpos anti-Rh positivo.
Estos Acs son de la clase IgG y tienen capacidad de atravesar la placenta, por lo que
reacciones con factor Rh positivo de los glóbulos rojos del feto, quedando recubiertos de
estos Acs. Estos glóbulos rojos empiezan a ser lisados por el complemento o son destruidos
en el bazo y el feto empieza a sufrir de anemia. Cuando el niño nace y se sospecha de
anemia hemolítica del recién nacido, el médico ordena Coombs directo para detectar los Acs
anti-Rh positivos sobre los glóbulos rojos del recién nacido. Para ello se le extrae sangre al
recién nacido y sus glóbulos rojos se hacen reaccionar con el Reactivo de Coombs.

7. • Prueba de Coombs Indirecta: Detecta la presencia de Acs incompletos en el suero, mediante
una reacción en 2 etapas, que comprende la incubación de la muestra sérica con glóbulos
rojos con el objeto de sensibilizarlos y en una segunda etapa ocurre la aglutinación de los
glóbulos rojos sensibilizados por el reactivo de Coombs.
En la misma circunstancia del ejemplo anterior, es importante determinar el título de Acs anti-
Rh en la mujer embarazada. Para ello en una primera etapa se hacen reaccionar glóbulos rojos
conocidos (Rh positivos) con el suero de la paciente. Luego de un periodo de incubación, en una
segunda etapa se añade el reactivo de Coombs (anti-Ig) y si la mujer tiene Acs anti-Rh positivos
se observará la aglutinación de los glóbulos rojos.
Las pruebas de Coombs pueden usarse para detectar:
• Detectar Acs incompletos sobre la membrana plasmática del glóbulo rojo en individuos
sensiblizados (coombs directo)
• Anemias hemolíticas inducidas por fármacos
• Anemia hemolítica del recién nacido
• Anemias hemolíticas autoinmunitarias
• Detectar Acs incompletos que se encuentran libres en el suero (coombs indirecto)
Pruebas de Inmunofluorescencia

8. Existen sustancias denominadas fluorocromos, que emiten una luz o radiación lumínica
(fluorescencia) cuya longitud de onda se ubica dentro del espectro visible cuando se les hace incidir
otra luz de menor longitud de onda (mayor energía), como la luz ultravioleta. Entre estas se pueden
mencionar: Fluoresceína, Rodamina y naranja de acridina. Estas sustancias tienen la propiedad de
que puedan acoplarse a moléculas proteicas tales como los Acs formándose conjugados (Ac al que
se le ha acoplado un fluorocromo) que pueden ser utilizados para detectar Ags presentes en la
membrana celular, inmunocomplejos depositados en tejidos y Acs de una determinada especificidad
circulantes en líquidos orgánicos.
Con base a lo expuesto, el principio básico en el que se fundamentan las pruebas de
inmunofluorescencia, es hacer reaccionar un Ac específico conjugado a un fluorocromo con el Ag
correspondiente y la reacción Ag-Ac. Cabe destacar, que en la apreciación de estas reacciones se
usan equipos para permitir visualizar la fluorescencia emitida por el fluorocromo en forma cualitativa
(ej., microscopios de fluorescencia) o cuantitativa (ej., microfluorómetros).
Los tipos de muestras que se pueden examinar mediante las pruebas de
inmunofluorescencia incluyen cortes o biopsias de tejido, alimentos envasados contaminados,
suspensiones celulares y líquidos orgánicos.
Existen varias modalidades de las pruebas de inmunofluorescencia, de estas las que se
realizan con mayor frecuencia figuran la inmunofluorescencia directa e indirecta.
En la inmunofluorescencia directa se utilizan Acs conjugados a fluorocromos específicos
contra bacterias, virus, hongos, y parásitos también anti inmunoglobulina humana conjugada a un
fluorocromo (ej., en casos de la detección de complejos inmunológicos en diversos tejidos). El
objetivo de esta modalidad es demostrar la presencia del Ag correspondiente en la muestra que se
está examinando. Entre sus utilidades:
• Detecciónn del virus de la rabia en cortes de tejido cerebral de animales
• Detección de inmunocomplejos depositados en biopsias de órganos como piel o riñón
• Detección de gonococos en secreciones uretrales
• Detección de Chlamydia trachomatis en frotis endocervical
• Detección de Treponema pallidum en frotis de los exudados de las lesiones pimarias o en las
serosidades de las lesiones secundarias cutáneomucosas de pacientes con sífilis.
• Identificación y contaje de células B y T en sangre periférica humana
El objetivo de la inmunofluorescencia indirecta es la detección de Acs específicos contra un
determinado Ag presente en un líquido orgánico, para ello en una primera etapa del
procedimiento se hace reaccionar la muestra antigénica con Acs específicos presentes en el
suero del paciente. En la segunda etapa se agrega anti-inmunoglobulina humana conjugada a un
fluorocromo. Si en la primera etapa se produce la reacción Ag-Ac, se fijará el conjugado de anti-
inmunoglobulina humana y por tanto habrá fluorescencia entre sus utilidades:
• Detección de Acs antinucleares en pacientes con lupus eritematoso sistémico y de
otros autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes.
• Detección de Acs específicos que contribuyen al diagnóstico serológico de
enfermedades infecciosas como sífilis, rubeola, sarampión, toxoplasmosis,
tripanosomiasis (mal de chagas)
Radioinmunoanálisis
Estas pruebas se fundamentan en que son procedimientos en los cuales se utilizan Ags o
Acs marcados con un isotopo radiactivo con el objeto de estudiar Ags o Acs de una determinada
especificidad en muestras biológicas. La reacción Ag-Ac se evidencia en estas pruebas mediante la

9. emisión radiactiva por parte del isotopo que fue utilizado para el marcaje respectivo. La
radioactividad emitida puede ser medida por instrumentos adaptados para tal fin.
Es importante destacar, que estas pruebas tienen importantes limitaciones ya que el costo
de los equipos ya que el costo de los equipos y reactivos radioactivos es muy elevado, además,
existen potenciales problemas de contaminación ambiental por el tratamiento inadecuado de los
desechos y por otra parte riesgo de contaminación para el personal de laboratotio. Estas limitaciones
y ante el advenimiento de pruebas muy sensibles y específicas que no presentan las desventajas
mencionadas (ej., ELISA), han limitado en la actualidad el uso de estos procedimientos.
El Radioinmunoanálisis ha sido utilizado en la determinación de: hormonas, drogas,
fármacos, IgE total, IgE específica contra un determinado alérgeno, Acs contra parásitos, bacterias y
virus, Ags bacterianos, virales y parasitarios.
Pruebas Imunoenzimáticas (ELISA)
Estas pruebas se basan en la detección de complejos Ag-Ac mediante el empleo de enzimas
unidas al Ag o al Ac, los cuales actúan sobre determinados sustratos para dar origen a productos
coloreados que pueden ser medidos espectrofotométricamente. La intensidad del color será
directamente proporcional a la cantidad de complejos Ag-Ac que se ha formado y por tanto
directamente proporcional a la concentración del Ac o Ag investigado en la muestra analizada (ej.,
suero). Estas pruebas constituyen una de las herramientas actuales mas útiles en el laboratorio de
inmunodiagnóstico debido a que las mismas presentan las siguientes ventajas:
• Alta sensibilidad y especificidad
• Son pruebas de gran aplicabilidad clínica
• Son de fácil realización
• Son pruebas cuyos resultados se obtienen en un tiempo relativamente corto
• Son pruebas seguras ya que los reactivos empleados no presentan riesgos a la salud
• Los reactivos empleados por lo general son bastantes estables.
Las pruebas de ELISA se pueden realizar de diversas formas o modalidades según el
objetivo propuesto, entre estas modalidades figuran el método indirecto y el método de captura,
también denominado “de doble Ac” ó “sándwich”. Mediante la aplicación del método indirecto, es
posible detectar en muestras obtenidas de pacientes Acs de una determinada especificidad de
combinación antigénica, mientras que el desarrollo de la modalidad de captura o de doble Ac,
permite la detección de Ags diversos en la muestra analizada (ej., AgsHB son herramientas muy
útiles para establecer el diagnóstico de diferentes enfermedades humanas.
Las aplicaciones de ELISA abarcan un espectro amplio de enfermedades infecciosas,
enfermedades autoinmunes, detección de marcadores tumorales, enfermedades endocrinas,
cuantificación de drogas, medicamentos, hormonas, marcadores virales, etc. Aplicaciones
clínicas:
• Detección de Acs diversos, entre los que figuran: anti-VIH, anti-citomegalovirus
humano (IgM/IgG) anti-virus del sarampión, antivirus de la hepatitis B los 2 también
con (IgM/IgG), anti-esperma, anti-ovario, autoanticuerpos de diferentes
especificidades.
• Detección de Acs, tales como: Ags HB, hormonas tiroideas, hormonas de la
fertilidad, hormonas esteroideas, ferritina, interleuquinas, interferon gamma, factor de
necrosis tumoral, antígeno prostático específico
• Dentro de las aplicaciones de estas pruebas inmunoenzimáticas, figura la detección
serológica de Acs de clase IgM específica contra una gran variedad de antígenos
de diferentes microorganismos infecciosos (ej., IgM anti-toxoplasma gondii, IgM anti-

10. Tripanosoma cruzi, IgM anti-virus dengue). La presencia de Acs de clase IgM
antígeno específica es indicativo que la infección ocurrió recientemente. En casos de
los niños recién nacidos se correlaciona con infección congénita o que la infección
ocurrió durante el nacimiento.
Western-Blot (Inmunotransferencia- Inmunoelectrotransferencia)
La prueba WB es una técnica que incluye la transferencia de proteínas desde un gel a una
membrana. Este procedimiento proporciona un medio muy específico para identificar reactividad de
Acs en muestras biológicas. Esta técnica se puede realizar con la finalidad de detectar la presencia
de Acs contra una determinada proteína antigénica o identificar un determinado Ag. La prueba se
realiza en 3 etapas:
1- Separación de los Ags mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida
(SDS-PAGE)
2- Transferencia de los Ags proteicos separados en la electroforesis inicial, desde el gel a una
matriz de soporte
3- Detección de los Acs específicos contra los Ags transferidos al papel de nitrocelulosa ó
identificación de de los Ags transferidos a la matriz de soporte mencionada
Uno de los usos mas frecuentes de la WB es la confirmación de las pruebas de detección
serológica reactivas para Acs anti-VIH. En este caso, los Ags virales se separan mediante
electroforesis en gel de SDS-PAGE. El tratamiento del lisado viral con SDS imparte una carga
negativa a las proteínas. Las proteínas virales en seguida son objeto de electroforesis en un gel
de poliacrilamida. Como las proteínas están cargadas negativamente migrarán al polo positivo y
se separan en función de su peso molecular. Las proteínas mas grandes tendrán una distancia
de migración inferior a la exhibida por las proteínas de menor peso molecular.
Para la detección de Acs contra los Ags del VIH, las proteínas se transfieren del gel a la
matriz de soporte (papel de nitrocelulosa). Esta transferencia tiene como resultado una copia
exacta del patrón del gel en matriz. La tira de papel de nitrocelulosa donde se han transferido los
Ags virales se incuba con el suero del paciente. Cabe destacar, que tiras de papel de
nitrocelulosa similares se incuban simultáneamente con sueros controles positivos y negativos.
Si el suero del paciente tiene Acs específicos contra los Ags del VIH, estos interaccionarán con
los Ags virales respectivos. Después del lavado para eliminar todo aquello que no se haya
combinado, se procede a revelar la reacción Ag-Ac.
Existen varios procedimientos de revelado, uno de los mas utilizados es agregar
antiinmunoglobulina humana conjugada a una enzima. El conjugado en referencia se combinará
con el Ac anti-VIH que esta interaccionando con el Ag fijado a la matriz de nitrocelulosa de un
determinado peso molecular. Seguidamente se agrega el sustrato de la enzima, el cual se
transformará en productos insolubles coloreados que precipitan en la zona de reacción, dejando
una “mancha coloreada” visible al ojo humano. La presencia del precipitado coloreado es
indicativo que el suero del paciente tenía Acs contra la proteína antigénica de VIH.
Cabe destacar, que el suero del paciente puede tener Acs específicos contra diferentes
proteínas virales de diferentes pesos moleculares, por lo que mediante esta prueba pueden
detectarse la presencia de estos. Las reaccionas se reportan como positivas cuando una línea
de precipitación coloreada se forma en la zona del papel de nitrocelulosa donde estaba presente
el correspondiente Ag viral de un determinado peso molecular.
La prueba WB ha demostrado ser muy útil en la identificación de ags importantes en
microorganismos bacterianos, micóticos, virales y parasitarios, además tiene otras aplicaciones
clínicas aparte de ser utilizada como prueba confirmatoria de la infección por VIH:
• Diagnóstico de enfermedad gastrointestinal autoinmune
• Diagnóstico de enfermedad reumatoide autoinmune
• Diagnóstico de Vasculitis autoinmune

11. Unidad Hemolítica CH50 se define como la cantidad de suero necesario para realizar el 50 % de
hemólisis de una suspensión de eritrocitos de carnero, sensibilizados con anticuerpos anticarnero de
conejo (hemolisina).
Pruebas de Inmunohemólisis (Complemento Hemolítico Total CH50)
Principio de la Inmunohemólisis: Se refiere a la liberación de hemoglobina por parte de eritrocitos,
luego que éste interactúa con un Ac específico para determinantes antigénicos situados en su
superficie, debido a la participación del sistema del complemento en el suero de un paciente. Las
células utilizadas son glóbulos rojos de carnero o de conejo.
Análisis Cuantitativo de la actividad hemolítica del complemento (Prueba del Complemento
Hemolítico Total CH50: Es una prueba funcional que refleja la actividad de los componentes de la
vía clásica del complemento. Esta prueba resulta útil para evaluar la integridad del sistema,
particularmente en casos de deficiencias genéticas donde la ausencia de uno de los componentes
se refleja en títulos bajos de Unidades Hemolíticas CH50.
Principio: El análisis cuantitativo de la actividad hemolítica del complemento, basado en la unidad
hemolítica CH50 depende de la capacidad de la vía clásica del complemento para inducir la
hemólisis de eritrocitos de carnero sensibilizados con cantidades óptimas de anticuerpos
antieritrocito (hemolisina). Luego se añade el suero del paciente y finalmente se determina el grado
o porcentaje de hemólisis. La hemólisis ocasionada por los componentes de la vía clásica del
complemento se mide de manera espectrofométrica y puede relacionarse la cantidad de suero con
la cantidad de hemoglobina liberada.
Determinación del título en la Prueba de Complemento Hemolítico Total CH50: Para la realización
de la prueba, inicialmente se añade a una serie de tubos de ensayos cantidades variables y
crecientes del suero diluido 1/50 en estudio al sistema indicador (eritrocitos de carnero mas
anticuerpos antieritrocitos) Después de un periodo de incubación adecuado se determina la cantidad
de hemoglobina liberada con ayuda de un espectrofotómetro. Seguidamente se determina el
porcentaje de hemólisis obtenida en cada tubo. A continuación se grafica en un papel milimetrado
porcentaje de hemólisis (ordenada) y el volumen de suero diluido 1/50 que se agregó a cada tubo
(abscisa) lo que permite calcular el volumen de suero diluido 1/50 necesario para causar la
hemólisis del 50% de los eritrocitos indicadores, el valor obtenido constituye la unidad hemolítica
CH50. Finalmente se determina el título el cual es reportado al médico que prescribió la prueba.

12. Pruebas de Neutralización
La neutralización o actividad neutralizante se refiere a la capacidad de un suero inmune
específico (antisuero o acs específicos) de reducir o inhibir la actividad biológica de un
microorganismo o de algún producto derivado del mismo. Esta propiedad de los Acs ha permitido
desarrollar un conjunto de técnicas de laboratorio, las cuales se identifican de manera genérica con
el término de “pruebas o reacciones de neutralización”. Estas pruebas presentan varias
modalidades, las cuales están directamente relacionadas con el tipo de microorganismo o producto
derivado del mismo, cuya actividad biológica ha sido objeto de neutralización total o parcial por un
determinado Ac o antisuero específico.
Modalidades de las pruebas de neutralización
La mayoría de las pruebas de neutralización que tienen utilidad clínica se pueden agrupar en
3 modalidades:
• Neutralización de toxinas (exotoxinas) y productos extracelulares secretados por bacterias.
• Neutralización de enzimas
• Neutralización Viral
Neutralización de Toxinas bacterianas y productos extracelulares secretados por bacterias
Algunos microorganismos bacterianos elaboran y secretan toxinas, enzimas y otros
productos (hemolisinas, leucocidinas, hialuronidasa, entre otros). Dichos productos contribuyen a la
patogenicidad, virulencia y poder invasivo de las bacterias. Muchos de estos productos son
inmunogénicos, por lo que estimulan en el hospedador una respuesta inmune humoral específica
contra los mismos. Un ejemplo de este tipo de prueba lo constituye la prueba de Antiestreptolisina
“O” la cual es útil en el diagnóstico de infecciones causadas por estreptococos beta hemolíticos del
grupo A (bacterias patógenas al hombre) estos pueden ocasionar enfermedades, tales como
infecciones agudas (ej., faringitis estreptocócicas), erisipela (inflamación de la piel), escarlatina
(erupción eritemato-papulosa difusa) y procesos tardíos, producto de complicaciones de infecciones
estreptocócicas no tratadas (ej., fiebre reumática y glomerulonefritis aguda). Este grupo bacteriano
produce Estreptolisina “O” y la secretan a los tejidos infectados; esta es una hemolisina y ocasiona

13. la hemólisis de eritrocitos (ej., eritrocitos humanos, de carnero y de conejo). Los pacientes infectados
producen Acs Antiestreptolisina “O” que neutralizan la actividad hemolítica de la estreptolisina “O”.
Los Acs mencionados se encuentran presentes en casi todas las personas a títulos bajos. Debido a
que estas infecciones son comunes, un título alto o creciente es indicativo de infección reciente por
estos microorganismos.
El Fundamento metodológico de la misma se resume de la siguiente manera:
• Se colocan diluciones (crecientes) de un suero (paciente) en presencia de un volumen
constante de estreptolisina “O”
• Se produce la reacción Ag/Ac que neutraliza la actividad hemolítica de la estreptolisina “O”
• La neutralización se evidencia por la inhibición de la hemólisis al agregar un volumen
constante de una suspensión de eritrocitos (3,5%)
• El título de Antiestreptolisina “O” se calcula determinando la recíproca (el inverso) de la
máxima dilución del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente a la Estreptolisina
“O” ( es decir, lamayor dilución del suero donde no se observa hemólisis alguna)
• El título se expresa en “unidades Todd/ml”
• Valores referenciales normales oscilan alrededor de 166 unidades Todd/ml.
Pruebas Dérmicas de Hipersensibilidad Retardada
La prueba de piel de hipersensibilidad retardada es la técnica mas antigua para evaluar la
inmunidad mediada por células. A pesar del desarrollo de multitud de procedimientos complejos para
la evaluación de la inmunidad celular, las pruebas intradérmicas, relativamente simple, permanece
como un arma muy útil y a menudo contribuye para establecer el diagnóstico de diversas patologías.
La reacción de hipersensibilidad retardada es una respuesta inmune adaptativa mediada por
células que se genera como consecuencia de la inyección intradérmica de un Ag a la cual la persona
se han sensibilizado previamente, es decir, la respuesta es inducida por los linfocitos T de memoria
inmunológica que se generaron como producto de una respuesta previa contra el Ag que se
administra a nivel de piel.
Al nivel celular la inyección de un Ag causa una inflamación detectable e infiltración de
células mononucleares dentro de las primeras 16 horas. La reacción se intensifica alcanzado su
máximo 48-72 horas después de la inyección observándose en la superficie de la piel un área
eritematosa y una induración palpable, siendo esta última verdaderamente significativa y la que
determina si la prueba es positiva o negativa.
Estas pruebas detectan hipersensibilidad cutánea a un antígeno o grupos de antígenos. Sin
embargo, cuando se efectúan pruebas para una enfermedad infecciosa, una respuesta positiva no
indica una infección activa con el microorganismo, sino más bien exposición previa al
microorganismo.
La incapacidad para reaccionar contra un conjunto de antígenos cutáneos habitualmente
utilizados en este tipo de pruebas se denomina anergia o anergia cutánea, lo que sugiere que la
respuesta inmune celular del paciente está deteriorada. Los trastornos clínicos vinculados con este
estado anérgico se observan en una gran varieadad de afecciones tales como: inmunodeficiencias
congénitas, inmunodeficiencias adquiridas, enfermedades coexistentes, enfermedades infecciosas y
tratamientos farmacológicos
Para el desarrollo de estas pruebas se utilizan antígenos de diversos microorganismos. Entre
los antígenos que con mayor frecuencia se utilizan en nuestro país para realizar este tipo de prueba
dérmica:
PPD Tuberculina
Candidina Extracto antigénico del hongo candida albicans
Sk/SD
(estreptoquinasa/estreptodornasa) Enzimasproducidas porbacterias(estreptococos)

14. Trycophyton Extracto antigénico del hongo
La prueba se considera positiva si el promedio de los 2 diámetros perpendiculares de la
induración resultan mayores o iguales a 5 mm por el contrario la prueba resultaría negativa si el
diámetro de la induración es inferior a 5 mm o si se observa sólo eritema.
Utilidad: Las pruebas de hipersensibilidad retardada también son de gran valor en estudios
epidemiológicos, ya que permite evidenciar infecciones previas ocasionadas por microorganismos
bacterianos, micóticos y parasitarios, estos estudios epidemiológicos son de utilidad para determinar
la prevalencia de la infección y/o la endenmicidad de un microorganismo en una determinada
población. Entre los Ags utilizados en nuestro país para realizar estos estudios epidemiológicos
figuran: tuberculina, leishmanina, toxoplasmina, histoplasmina y paracoccidiodina.
Indice CD4/CD8
Se estima que del total de los linfocitos de sangre periférica humana entre 70 y 75% son
linfocitos T, mientras que el 20% son células B y el resto de los linfocitos pueden considerarse
células nula o células NK. Asimismo, se ha señalado que en sangre periférica y en la mayoría de los
tejidos linfoides secundarios la proporción de células CD4+ es de 65% mientras que la proporción de
células CD8+ es de 35%. Muchos laboratorios expresan los resultados de contaje de células
cooperadoras/citotóxicas, como un índice o cociente (índice CD4/CD8) cuyo valor de referencia
norma se ha establecido entre 1,5 y 2.

15. Pruebas de Transformación Linfoblástica
Las pruebas de transformación linfoblástica miden la capacidad funcional de los linfocitos de
proliferar luego de un estimulo inducido por un Ag o mitógeno y es por lo tanto una prueba de
inmunocompetencia. La activación de linfocitos es una técnica in vitro comúnmente utilizada para
evaluar la inmunidad celular y es aplicable en los casos de pacientes con inmunodeficiencias
congénitas o adquiridas, autoinmunidad, enfermedades infecciosas, cáncer, entre otras. Estas
pruebas permiten la exploración invitro de la depresión invivo de la inmunidad mediada por células
en combinación con otras pruebas de inmunidad celular y el seguimiento longitudinal del hospedador
inmunocomprometido.
Este procedimiento se refiere a una correlación in vitro de un proceso que ocurre
normalmente in vivo cuando el Ag interactúa con linfocitos específicamente sensibilizados en el
individuo. Asi, cuando los linfocitos aislados de sangre periférica son cultivados in vitro en presencia
de mitogenos o antígenos éstos proliferan en respuesta al estímulo; lo que se conoce como
blastogénesis o transformación blástica.
Cuando los linfocitos son estimulados ocurre una gran variedad de cambios morfológicos y
bioquímicos que incluyen fenómenos tales como incremento en: la formación de linfoblastos, síntesis
de proteínas y síntesis de ADN. Este último evento tardío es el que a la larga origina la división
celular y constituye la base de la mayor parte de los análisis de relevancia clínica para la
transformación de linfocitos. Es precisamente la síntesis de ADN lo que los inmunólogos utilizan
como indicador de activación linfocitaria.
Los activadores policlonales ó mitógenos, son sustancias capaces de inducir la
proliferación de linfocitos pertenecientes a múltiples clones, en otras palabras los mitógenos
estimulan en forma no específica la linfoblastogénesis de múltiples clones celulares sin la
sensibilización previa del individuo e independientemente de la especificidad de combinación
antigénica de su receptor de membrana.

16. En el caso de los activadores oligoclonales o antígenos utilizados en las pruebas de
transformación linfoblástica, la blastogénesis o activación de los linfocitos dependerá de la
sensibilización previa que in vivo haya tenido el individuo con el antígeno en particular. Además, la
respuesta será producto de la activación de un número restringido de clones de linfocitos
sensibilizados, es decir, solo se estimularán aquellos clones de linfocitos que posean en su
membrana receptores antigénicos capaces de interactuar con los determinantes antigénicos que
tenga el antígeno utilizado en la prueba, la misma es por lo tanto específica. Entre los antígenos más
utilizados en la prueba de transformación linfoblástica en nuestro país, figuran:PPD, extracto de
Candida albicans (candidina), toxoide tetánico y la estreptolisina “O”.
Utilidad Clínica
Los ensayos de transformación linfoblástica proveen un medio práctico y adecuado para
determinar y controlar estados de inmunodeficiencia genética y adquirida. Además provee un
indicador sensible de función linfocitaria deprimida, asi como también los efectos de diversas
terapias inmunoestimulantes o inmunosupresoras. Se ha sugerido que el grado de deterioro de la
reactividad linfocítica en paciente con cáncer y el mejoramiento de éstas siguiente a la resección o
quimioterapia, se puede utilizar como indicadores del pronóstico de estado inmunitario de estos
pacientes. Asimismo, provee una poderosa herramienta para detectar reacciones inmunitarias hacia
agentes patógenos, alérgenos y autoantígenos.