1. Carga Viral
Dr. Juan Carlos Romero

2. CARGA VIRAL
Consiste en la detección por medio de la amplificación de
las secuencias de ácidos nucleicos del ARN del VIH.
Se logra su detección gracias al avance que ha
experimentado la biología molecular.
Su detección ha permitido demostrar la modificación que
realiza la TARV sobre la historia natural de la infección
VIH.
Depende del método empleado y la capacidad de detectar
mínimas cantidades de ARN del virus.
Se expresa en copias de ARNv /ml .
Posee las principales características se un buen marcados
de laboratorio: Sensibilidad, especificidad, valor predictivo
positivo y negativo y reproducibilidad.

3. PROPIEDADES DE LA CARGA VIRAL
La CV plasmática es la resultante del equilibrio
dinámico entre los distintos compartimientos
virales.
Son reproducibles.
No existe equivalencia directa entre los diferentes
métodos utilizados comercialmente.

4. INDICACIONES CLINICAS Y USO DE CV
INDICACIÓN CLÍNICA
INFORMACIÓN
USO
SD. Compatible con
infección aguda VIH
Establece el diagnóstico
cuando la prueba de
anticuerpos es negativa o
indeterminada
Diagnóstico
Valoración inicial de una
infección VIH recientemente
diagnosticada
CV basal
Apoya decisión en conjunto
con CD4(+) de iniciar o no
tratamiento
Control de pacientes VIH(+)
sin TARV
Cambios de la carga viral
ídem
Luego de 3-6 semanas del
inicio o cambio de TARV
Valoración inicial de
eficacia de TARV
Decisión de continuar o
cambiar esquema
Control c/3-6 meses en
pacientes con TARV
Duración del efecto
antiretroviral
Decisión de continuar o
cambiar TARV
Acontecimientos clínicos o
disminución significativa de
LTCD4(+)
Asociación con CV variable
o inestable
ídem

5. DIGNOSTICO MOLECULAR
Principio General:
– Lisis de la muestra
– Extracción del Ácido Nucleíco
– Amplificación del Ácido Nucleíco
– Detección del Ácido Nucleíco

6. METODOS
Reacción en Cadena de la Polimerasa
-PCRADN PROVIRAL
Amplificación basada en la transcripción
NASBA

7. PCR
Reaccion en Cadena de la Polimerasa
Aplicación del proceso de Replicación:
Utilizado para amplificar segmentos cortos de
ADN
Específica para identificar genes o segmentos
de genes de cualquier microorganismo
Utiliza una ADN polimerasa resistente al calor
Primers específicos
Reacción controlada
Millones de copias de secuencia objetivo

8. PCR Amplifica una secuencia específica
Secuencia del
Objetivo
Hebra Doble Hélice del DNA
Cromosoma

9. Transcripción Reversa - Paso 1 – Primer se
une a la secuencia objetivo de RNA

10. Transcripción Reversa - Paso 2 - rTth DNA
Polimerasa Cataliza la extensión de los Primers
incorporando Nucleótidos Complementarios

11. Fin de la Transcripción Reversa - Paso 3 –
Resulta una síntesis de un DNA Complementario
(cDNA) a la Secuencia Objetivo de RNA

12. Fin del 1er Ciclo de la PCR – Resulta una Copia
de una Doble Cadena de DNA (Amplicon) de la
Secuencia Objetivo

13. PCR – Amplificación Exponencial: Cada Nuevo
Ciclo duplica la cantidad del Objetivo,
Resultando en un Incremento Exponencial en
Amplicones
Single strand RNA
1 cycle = 1 (RNA/cDNA hybrid)
2 cycle = 2
3 cycle = 4
4 cycle = 8
5 cycle = 16
6 cycle = 32
7 cycle = 64

14. ADN PROVIRAL
Al momento de nacer no se distingue entre los
anticuerpos maternos tranferidos por vía placentaria
de los generados por infección del niño.
Determinación cualitativa de ADN proviral integrado
en células mononucleares de sangre periférica por
PCR.
Se recomienda a las 24-48 hrs de vida, si es positiva
indica infección intrauterina.
Si es negativa debe repetirse a los 15 días y a las 6
semanas.

15. ROCHE
1. AmplliPrep (extracción)
2. Cobas (AmplificacionDetección)
3. Cobas Taq-Man 48

16. NASBA
Sample + Lysis buffer
Release of nucleic acid
Stabilization of nucleic acid
Nucleic acid
Binding of nucleic acid
Washes
Proteins
etc. Lipids
Purification of nucleic acid,
Elution buffer removal of inhibitors
Purified Nucleic acid
Recover nucleic acid in
small volume

17. Determinación NASBA
reacción NASBA
Fluorescencia Normalizada
Señal Fluorescente
(real-time)
0
10
20
30
40
Tiempo (minutos)
50
60

18. Determinación en el tiempo
Normalized fluorescence
Fluorescent signal
(real-time)
0
10
20
30
Time (minutes)
40
50
60

19. &
Dos plataformas – Un reactivo
Extracción Magnética
“BOOM®” Manual
Magnética
“BOOM®”
Automatizada

20. Carga Viral de VIH-1
La cuantificación de la Carga Viral de VIH de manera
precisa y confiable es esencial para el manejo clínico y
terapéutico del paciente infectado por el VIH
Los resultados Precisos y Confiables dependen de:
Integridad de la muestra de Sangre
Reactivos adecuados y protocolo de procesamiento
Instrumento con plataforma validada

21. Recolección de la Muestra
Debe utilizarse plasma con EDTA.
Las muestras para las pruebas de Carga Viral deben
ser tomadas en tubos estériles con anticoagulante
EDTA. (Restos de detergentes provenientes de tubos
lavados, inhiben la reacción. (1.5 ml de Plasma)
Mantenga las muestras de sangre total entre 2-25°C
por no más de 6 horas
Separe el plasma de la sangre total dentro de las
primeras 6 horas por medio de centrifugación de 800
– 1600 rpm por 20 minutos
Transfiera el plasma a un tubo estéril de
polipropileno

22. Integridad de la Muestra
Consideraciones Críticas
Uso del Anticoagulante adecuado – K3EDTA
(spray dried) evita el efecto de dilución para un conteo absoluto
adecuado
Volumen adecuado de colección para lograr la
anticuoagulación adecuada
Mezcle bien el tubo después de recolectar la muestra para
evitar la formación de coagulos
El tubo debe ser rotulado con el nombre completo del paciente,
cédula, día y hora de toma de muestra
No utilizar tubos con EDTA y Gel.

23. Transporte de la Muestra
La sangre total debe ser mantenida entre 2-25° y e l
C
plasma debe ser separado por centrifugación en menos de
6 horas
El plasma puede ser transportado a temperatura ambiente
(22° hasta por 24 horas
C)
El plasma puede ser transportado de 2-8° hasta por 5 dias
C
De -20 a -80° por periodos de tiempo superiores a 5 dias
C

24. Diagnóstico
Pronóstico
Terapia
Contagio
Blips

25. Gracias