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Influenza estacional
H1N1 de 2009, las pruebas DFA
demostraron sensibilidades de 38% y el
93%, en comparación con los enfoques
basados en (RT-PCR).
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para DFA; 17,8% para BinaxNOW;
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  • 1. Integrantes: Lady Huamán Chacón Kevin Fernandez Delgado Joel Yaringaño Gonzales Fiorella Fernandez Salcedo
  • 5. Aislamiento de virus mediante enfoques de cultivo celular Cultura viral Propagación - huevos embrionados - Gold Estándar Cultivo viral de concha (SVC) Implica la propagación de virus en células de mamífero cultivadas en viales pequeños Inoculación de líneas celulares permisivas huevos embrionados con muestras infecciosas Riñón canino M adin Darby (M DCK),A549, (M v1 Lu),(LLC M K2),(BGM K) (RhM K) (AGM K). Un método SVC modificado que utiliza células R-mix (una mezcla de células de pulmón de visón y células de adenocarcinoma humano)
  • 6. Prueba de anticuerpos fluorescentes directas (DFA) Tinción directa de células epiteliales respiratorias derivadas de hisopos nasofaríngeos o aspirados nasofaríngeos con anticuerpos específicos del virus 2 Pruebas por FDA ID3 FastPoint L-DFA Bartels No tipifican subtipos Influenza estacional H1N1 de 2009, las pruebas DFA demostraron sensibilidades de 38% y el 93%, en comparación con los enfoques basados en (RT-PCR). Se mostro sensibilidad de 46,7% para DFA; 17,8% para BinaxNOW; 94,5% para el cultivo R-M ix y 97,8% para RVP.
  • 7. Otro estudio, que evaluó el rendimiento de cuatro pruebas (DFA, inmunoensayo cromatográfico de los virus de la vial de influenza A y B y cultivo en concha) % para DFA, 70,3 % para pruebas rápidas y 98,6 % para vial de concha. Para la detección del virus de la influenza A en muestras clínicas,la prueba de citospin DFA mostróuna sensibilidaddelensayo del92,5% (49/53) en comparación con el ensayo de cultivo celular .
  • 8. Ensayos serologicos Utilizado comunmente en la deteccion de los anticuerpos especificos en suero despues de una infeccion natural y vacunacion . Ensayo de inhibicion de la hemoglutinacion Si los anticuerpoS son capaces de unirse al virus, la hemaglutinina queda ocupada y se inhibe la aglutinación de los glóbulos rojos, de lo contrario la hemaglutinina hace que los glóbulos rojos aglutinen. X Sensibilidad pobre para ID de virus de influenza aviar A ** H5N1 1
  • 9. 2 3 Ensayo de neutralizacion de virus Utilizado para la deteccion de titulos de anticuerpos de cepas del virus influenza A estacional o Aviar X restringida para diagnostico de rutina por el uso de virus infecciosos en el laboratorio. Hemólisis radial unica Se utiliza para medir la hemólisis mediada por complemento inducida por antígenos y anticuerpos complejos, más sensible que la prueba HAI y no requiere un tratamiento previo del suero para inactivar los inhibidores no específicos.
  • 10. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas Aprobadas por la FDA para el diagnóstico de infecciones virales y bacterianas. Aunque se ha usado las pruebas basadas en ELISA por algún tiempo, una limitación importante es la menor sensibilidad en comparación con pruebas basadas en ácido nucleico (NAT).
  • 11. Pruebas diagnostico rapido de la influenza Basadas en antígenos, desarrolladas para el diagnóstico rápido de infecciones por el virus de la influenza.Utilizan anticuerpos monoclonales que se dirigen a la nucleoproteína viral y emplean inmunoensayos enzimáticos o técnicas inmunocromatográficas (flujo lateral). Las pruebas de diagnóstico rápido de influenza están disponibles en tiras reactivas, casetes o formatos de tarjeta. Las RIDT se puede completar en menos de 30 minutos Debido a la simplicidad de uso y la velocidad de obtención de resultados de los análisis, es muy común el uso de estas pruebas para el diagnóstico de la influenza. X no distingue los distintos subtipos de Influenza A
  • 12. Dispositivos Lab-on-a-Chip Microchip (LoC) La tecnología LoC se origina a partir de la tecnología de sistemas microelectromecánicos (MEMS), con un enfoque en aplicaciones químicas y biológicas. Tiene muchas ventajas fascinantes, como una alta eficiencia de reacción, un bajo consumo de reactivos/energía, una baja generación de desechos y un tamaño reducido. La tecnología LoC se ha utilizado para desarrollar ensayos dirigidos a múltiples patógenos. Con respecto a las pruebas de influenza, el grupo de Soh informó sobre un chip microfluídico desechable para el análisis genético de muestra a respuesta del virus H1N1 Este sistema permite la concentración rápida y simultánea de partículas virales y una mayor separación de los complejos virus-anticuerpo del anticuerpo no unido. Estos ensayos de influenza se pueden implementar utilizando la tecnología LoC y los ensayos de influenza con microchip exhiben resultados impresionantes. Sin embargo, se necesitan más esfuerzos en mejoras adicionales del sistema y validación de ensayos para adaptar las nuevas pruebas de LoC a la configuración real de POC.
  • 13. Pruebas basadas en Ácidos Nucleicos (NAT) RT-PCR LAMP SAMBA NASBA Micromatrices
  • 14. 8. ENFOQUESDESECUENCIACION DE ACIDOSNUCLEICOS 8.1 SECUENCIACION DE SANGER La secuenciación de Sanger, desarrollada por Fredrick Sanger en la década de 1970, es un método de terminación de cadena para secuenciar ADN. Este enfoque implica el uso de ADN polimerasa, cebadores de ADN, dNTP no marcados y di-desoxinucleótidos de terminación de cadena (di-ddNTP) marcados con fluoróforos. La incorporación selectiva de di-ddNTP en una hebra de ADN recién sintetizada inhibe la adición de dNTP posteriores, lo que genera fragmentos de ADN de diferentes tamaños con marcadores de fluorescencia al final. La secuencia de ADN se determina según el tamaño de estos fragmentos. La secuenciación de Sanger puede generar lecturas de secuencias de ADN de hasta 1000 pares de bases por reacción y se ha utilizado en la secuenciación de genomas virales como el de la influenza, así como en la detección de resistencia antiviral en estos virus.
  • 15. 8. ENFOQUESDESECUENCIACION DE ACIDOSNUCLEICOS 8.2 SECUENCIACION DE PRÓXIMA GENERACION (NGS) La secuenciación de próxima generación (NGS) es una tecnología avanzada con un impacto significativo en la investigación en ciencias de la vida y medicina. Ofrece mejoras notables en velocidad y rendimiento en comparación con la secuenciación de Sanger, además de simplificar la preparación de muestras. NGS analiza fragmentos de ácido nucleico directamente, evitando la necesidad de clonación de vectores complicada. También ha reducido drásticamente los costos de secuenciación. Por ejemplo, el costo de secuenciar un genoma humano pasó de $100 millones en 2001 a aproximadamente $5000 en 2014 y se espera que disminuya aún más. Existen varias plataformas de NGS, como Roche 454 Life Sciences, Illumina MiSeq, Ion PGM, PacBio RS, SOLiD NGS, y otras, cada una con sus propias ventajas y desventajas en términos de rendimiento, longitud de lectura, tasa de error y costo. Estas plataformas se utilizan en diversas aplicaciones, incluido el diagnóstico de virus de la influenza. En el caso de la influenza, la secuenciación de NGS ha sido utilizada para identificar marcadores de resistencia antiviral y mutaciones en los genes que codifican proteínas virales, como HA y NA. Además, se ha empleado para analizar coinfecciones con otros patógenos y estudiar la expresión génica del huésped en respuesta a la infección por el virus de la influenza. Un enfoque reciente ha utilizado una plataforma de diagnóstico universal que combina RT-PCR y NGS para detectar y caracterizar simultáneamente infecciones de influenza desconocidas en una sola muestra. Este enfoque ofrece una detección altamente sensible y proporciona información completa sobre el genoma de la gripe, incluyendo la resistencia antiviral y marcadores de alta virulencia.
  • 16. 9. CONCLUSIONES La deriva antigénica, causada por mutaciones en el genoma viral de la influenza, genera nuevas variantes que pueden evadir la inmunidad previa y desencadenar epidemias anuales. La combinación de genes de cepas humanas, porcinas o aviares conduce a la aparición de virus con nuevos genes HA y/o NA, para los cuales la población carece de inmunidad. Detectar rápidamente estas variantes emergentes es crucial para iniciar la terapia antiviral y la profilaxis durante brotes estacionales y pandémicos. Aunque los métodos de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) son precisos, su alta complejidad y costo los hacen menos prácticos en regiones con recursos limitados. En respuesta a esta necesidad, se han desarrollado pruebas de diagnóstico rápidas (RIDT) asequibles y portátiles. Sin embargo, las RIDT varían en sensibilidad para detectar la influenza y su capacidad de subtipificar los virus de la influenza A es limitada. Por lo tanto, se requieren nuevos enfoques rentables y fáciles de usar que puedan detectar y subtipificar los virus de la influenza A, al tiempo que identifiquen marcadores de resistencia antiviral. Esto es esencial dada la creciente resistencia a los inhibidores de la influenza A H5N1 y H7N9, lo que subraya la importancia de la vigilancia molecular de los factores de virulencia y la resistencia antiviral para mejorar la salud pública durante los brotes estacionales y epidemias.