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1. Integrantes:
Lady Huamán Chacón
Kevin Fernandez Delgado
Joel Yaringaño Gonzales
Fiorella Fernandez Salcedo

5. Aislamiento de virus mediante enfoques de
cultivo celular
Cultura viral
Propagación - huevos embrionados - Gold Estándar
Cultivo viral
de concha
(SVC)
Implica la propagación de virus en células de
mamífero cultivadas en viales pequeños
Inoculación de líneas celulares permisivas
huevos embrionados con muestras infecciosas
Riñón canino M adin Darby (M DCK),A549,
(M v1
Lu),(LLC M K2),(BGM K) (RhM K) (AGM K).
Un método SVC modificado que utiliza células
R-mix (una mezcla de células de pulmón de
visón y células de adenocarcinoma humano)

6. Prueba de anticuerpos fluorescentes
directas (DFA)
Tinción directa de células epiteliales respiratorias derivadas de
hisopos nasofaríngeos o aspirados nasofaríngeos con anticuerpos
específicos del virus
2 Pruebas por FDA
ID3 FastPoint L-DFA
Bartels No tipifican subtipos
Influenza estacional
H1N1 de 2009, las pruebas DFA
demostraron sensibilidades de 38% y el
93%, en comparación con los enfoques
basados en (RT-PCR).
Se mostro sensibilidad de 46,7%
para DFA; 17,8% para BinaxNOW;
94,5% para el cultivo R-M ix y 97,8%
para RVP.

7. Otro estudio, que evaluó el rendimiento
de cuatro pruebas (DFA, inmunoensayo
cromatográfico de los virus de la
vial de
influenza A y B y cultivo en
concha) % para DFA, 70,3 % para
pruebas rápidas y 98,6 % para vial
de concha.
Para la detección del virus de la influenza A en
muestras clínicas,la prueba de citospin DFA
mostróuna sensibilidaddelensayo del92,5%
(49/53) en comparación con el ensayo de cultivo
celular
.

8. Ensayos serologicos
Utilizado comunmente en la deteccion de los
anticuerpos especificos en suero despues de una
infeccion natural y vacunacion .
Ensayo de inhibicion de la
hemoglutinacion
Si los anticuerpoS son capaces de
unirse al virus, la hemaglutinina
queda ocupada y se inhibe la
aglutinación de los glóbulos rojos,
de lo contrario la hemaglutinina
hace que los glóbulos rojos
aglutinen.
X Sensibilidad pobre para ID
de virus de influenza aviar A **
H5N1
1

9. 2
3
Ensayo de
neutralizacion de virus
Utilizado para la deteccion de titulos
de anticuerpos de cepas del virus
influenza A estacional o Aviar
X restringida para diagnostico de
rutina por el uso de virus infecciosos
en el laboratorio.
Hemólisis radial unica
Se utiliza para medir la hemólisis mediada por
complemento inducida por antígenos y anticuerpos
complejos, más sensible que la prueba HAI y no
requiere un tratamiento previo del suero para
inactivar los inhibidores no específicos.

10. Ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas
Aprobadas por la FDA para el diagnóstico de
infecciones virales y bacterianas. Aunque se ha
usado las pruebas basadas en ELISA por algún
tiempo, una limitación importante es la menor
sensibilidad en comparación con pruebas basadas
en ácido nucleico (NAT).

11. Pruebas diagnostico rapido de la influenza
Basadas en antígenos, desarrolladas para
el diagnóstico rápido de infecciones por
el virus de la influenza.Utilizan
anticuerpos monoclonales que se dirigen
a la nucleoproteína viral y emplean
inmunoensayos enzimáticos o técnicas
inmunocromatográficas (flujo lateral).
Las pruebas de diagnóstico rápido de
influenza están disponibles en tiras
reactivas, casetes o formatos de tarjeta.
Las RIDT se puede completar en menos de
30 minutos
Debido a la simplicidad de uso y la
velocidad de obtención de resultados de
los análisis, es muy común el uso de estas
pruebas para el diagnóstico de la
influenza.
X no distingue los distintos subtipos
de Influenza A

12. Dispositivos Lab-on-a-Chip
Microchip (LoC)
La tecnología LoC se origina a partir de la tecnología de sistemas
microelectromecánicos (MEMS), con un enfoque en aplicaciones químicas y
biológicas. Tiene muchas ventajas fascinantes, como una alta eficiencia de
reacción, un bajo consumo de reactivos/energía, una baja generación de
desechos y un tamaño reducido.
La tecnología LoC se ha utilizado para desarrollar ensayos dirigidos a
múltiples patógenos. Con respecto a las pruebas de influenza, el grupo de
Soh informó sobre un chip microfluídico desechable para el análisis
genético de muestra a respuesta del virus H1N1
Este sistema permite la concentración rápida y simultánea de partículas
virales y una mayor separación de los complejos virus-anticuerpo del
anticuerpo no unido. Estos ensayos de influenza se pueden implementar
utilizando la tecnología LoC y los ensayos de influenza con microchip
exhiben resultados impresionantes. Sin embargo, se necesitan más
esfuerzos en mejoras adicionales del sistema y validación de ensayos para
adaptar las nuevas pruebas de LoC a la configuración real de POC.

13. Pruebas basadas en
Ácidos Nucleicos (NAT)
RT-PCR
LAMP
SAMBA
NASBA
Micromatrices

14. 8. ENFOQUESDESECUENCIACION DE
ACIDOSNUCLEICOS
8.1 SECUENCIACION DE SANGER
La secuenciación de Sanger, desarrollada por Fredrick Sanger en la
década de 1970, es un método de terminación de cadena para
secuenciar ADN. Este enfoque implica el uso de ADN polimerasa,
cebadores de ADN, dNTP no marcados y di-desoxinucleótidos de
terminación de cadena (di-ddNTP) marcados con fluoróforos. La
incorporación selectiva de di-ddNTP en una hebra de ADN recién
sintetizada inhibe la adición de dNTP posteriores, lo que genera
fragmentos de ADN de diferentes tamaños con marcadores de
fluorescencia al final. La secuencia de ADN se determina según el
tamaño de estos fragmentos. La secuenciación de Sanger puede
generar lecturas de secuencias de ADN de hasta 1000 pares de
bases por reacción y se ha utilizado en la secuenciación de
genomas virales como el de la influenza, así como en la detección
de resistencia antiviral en estos virus.

15. 8. ENFOQUESDESECUENCIACION DE
ACIDOSNUCLEICOS
8.2 SECUENCIACION DE PRÓXIMA GENERACION (NGS)
La secuenciación de próxima generación (NGS) es una tecnología avanzada con
un impacto significativo en la investigación en ciencias de la vida y medicina.
Ofrece mejoras notables en velocidad y rendimiento en comparación con la
secuenciación de Sanger, además de simplificar la preparación de muestras.
NGS analiza fragmentos de ácido nucleico directamente, evitando la necesidad
de clonación de vectores complicada. También ha reducido drásticamente los
costos de secuenciación. Por ejemplo, el costo de secuenciar un genoma
humano pasó de
$100 millones en 2001 a aproximadamente $5000 en 2014 y se espera
que
disminuya aún más.
Existen varias plataformas de NGS, como Roche 454 Life Sciences, Illumina
MiSeq, Ion PGM, PacBio RS, SOLiD NGS, y otras, cada una con sus propias
ventajas y desventajas en términos de rendimiento, longitud de lectura, tasa de
error y costo. Estas plataformas se utilizan en diversas aplicaciones, incluido el
diagnóstico de virus de la influenza.
En el caso de la influenza, la secuenciación de NGS ha sido utilizada para
identificar marcadores de resistencia antiviral y mutaciones en los genes que
codifican proteínas virales, como HA y NA. Además, se ha empleado para
analizar coinfecciones con otros patógenos y estudiar la expresión génica del
huésped en respuesta a la infección por el virus de la influenza.
Un enfoque reciente ha utilizado una plataforma de diagnóstico universal que
combina RT-PCR y NGS para detectar y caracterizar simultáneamente
infecciones de influenza desconocidas en una sola muestra. Este enfoque
ofrece una detección altamente sensible y proporciona información completa
sobre el genoma de la gripe, incluyendo la resistencia antiviral y marcadores de
alta virulencia.

16. 9. CONCLUSIONES
La deriva antigénica, causada por mutaciones en el genoma viral de la
influenza, genera nuevas variantes que pueden evadir la inmunidad previa y
desencadenar epidemias anuales. La combinación de genes de cepas
humanas, porcinas o aviares conduce a la aparición de virus con nuevos
genes HA y/o NA, para los cuales la población carece de inmunidad. Detectar
rápidamente estas variantes emergentes es crucial para iniciar la terapia
antiviral y la profilaxis durante brotes estacionales y pandémicos. Aunque los
métodos de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) son precisos, su alta
complejidad y costo los hacen menos prácticos en regiones con recursos
limitados.
En respuesta a esta necesidad, se han desarrollado pruebas de diagnóstico
rápidas (RIDT) asequibles y portátiles. Sin embargo, las RIDT varían en
sensibilidad para detectar la influenza y su capacidad de subtipificar los
virus de la influenza A es limitada. Por lo tanto, se requieren nuevos enfoques
rentables y fáciles de usar que puedan detectar y subtipificar los virus de la
influenza A, al tiempo que identifiquen marcadores de resistencia antiviral.
Esto es esencial dada la creciente resistencia a los inhibidores de la
influenza A H5N1 y H7N9, lo que subraya la importancia de la vigilancia
molecular de los factores de virulencia y la resistencia antiviral para mejorar
la salud pública durante los brotes estacionales y epidemias.