RESUMEN Las bacteriocinas son proteínas o péptidos bactericidas sintetizados en el ribosoma de las BAL, producción ocurrida durante la fase logarítmica o al final del desarrollo bacteriano. El objetivo de la investigación fue inducir la producción de bacteriocina producida por Lactobacillus Plantarum 32plp, en sustrato de chicha de jora y evaluar la capacidad inhibitoria in vitro frente a patógenos: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y Salmonella sp. La investigación contempla la incidencia de variables evaluadas: tratamiento térmico del sustrato (pasteurización, esterilización) y temperatura de fermentación (25°C, 35°C); los resultados obtenidos se encuentran en función de pH, % de acidez, D.O., recuento de colonias, durante el tiempo de fermentación. La purificación parcial de la bacteriocina se realizó a extractos crudos que brindaron formación de halos de inhibición sometiéndose a centrifugación a 4000 rpm por 20 minutos refrigerados (temperatura de 4 °C ±1), con solución de Sulfato de amonio al 65%, la actividad inhibitoria se realizó por método gota sobre césped (discos de sensibilidad con bacteriocina) en placas de Petri con agar nutritivo y método de difusión de bacterias patógenas, la lectura se realizó a placas que presentaron halos(expresados en mm) de inhibición. La evaluación fisicoquímica sirvió para confirmar la acción inhibitoria por la bacteriocina y no por otros metabolitos producidos. La conclusión de la investigación muestra al 3er tratamiento (sustrato esterilizado, 25ºC de fermentación), como mejor tratamiento (P<0.05); para inhibir el crecimiento de Bacillus cereus Staphylococcus aureus y Salmonella sp., logrando halos de inhibición: 1.95 mm, 1.80 mm y 1.30 mm respectivamente.

1. 1
Producción de bacteriocina utilizando como sustrato chicha de Jora y
evaluación de su capacidad inhibitoria in vitro en bacterias patógenas (Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus y Salmonella sp.) causantes del deterioro de alimentos.
Norma Silvia Huaman Huillca a,
a. Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional Micaela Bastidas de
Apurímac, Av. Garcilaso S/N – Tamburco –Abancay – Apurímac -Perú.
b. Laboratorio de Microbiología, Biotecnología Agroindustrial, Procesamiento de productos Agroindustriales – Universidad Nacional
Micaela Bastidas de Apurímac
Recibido 15 Abril 2013; aceptado 30 Julio 2013
Resumen
Las bacteriocinas son proteínas o péptidos bactericidas sintetizados en el ribosoma de las BAL, producción
ocurrida durante la fase logarítmica o al final del desarrollo bacteriano. El objetivo de la investigación fue inducir
la producción de bacteriocina producida por Lactobacillus Plantarum 32plp, en sustrato de chicha de jora y
evaluar la capacidad inhibitoria in vitro frente a patógenos: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y Salmonella
sp.
La investigación contempla la incidencia de variables evaluadas: tratamiento térmico del sustrato
(pasteurización, esterilización) y temperatura de fermentación (25°C, 35°C); los resultados obtenidos se
encuentran en función de pH, % de acidez, D.O., recuento de colonias, durante el tiempo de fermentación. La
purificación parcial de la bacteriocina se realizó a extractos crudos que brindaron formación de halos de
inhibición sometiéndose a centrifugación a 4000 rpm por 20 minutos refrigerados (temperatura de 4 °C ±1), con
solución de Sulfato de amonio al 65%, la actividad inhibitoria se realizó por método gota sobre césped (discos
de sensibilidad con bacteriocina) en placas de Petri con agar nutritivo y método de difusión de bacterias
patógenas, la lectura se realizó a placas que presentaron halos(expresados en mm) de inhibición. La evaluación
fisicoquímica sirvió para confirmar la acción inhibitoria por la bacteriocina y no por otros metabolitos producidos.
La conclusión de la investigación muestra al 3er tratamiento (sustrato esterilizado, 25ºC de fermentación), como
mejor tratamiento (P<0.05); para inhibir el crecimiento de Bacillus cereus Staphylococcus aureus y Salmonella
sp., logrando halos de inhibición: 1.95 mm, 1.80 mm y 1.30 mm respectivamente.
Palabras clave: Bacteriocinas, BAL, in vitro, extractos crudos, capacidad inhibitoria.
Abstract
Bacteriocins are proteins or peptides synthesized on the ribosome bactericidal of BAL, production occurred
during the logarithmic phase or at the end of the bacterial growth. The aim of this investigation was to induce
the production of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum 32plp in chicha substrate and evaluation of
their in vitro inhibitory activity against Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Salmonella sp; frequent
pathogens causing deterioration foods.
The investigation includes the impact of the evaluated variables: the substrate heat treatment (pasteurization,
sterilization) and fermentation temperature (25°C, 35°C), the results are a function of pH,% acidity, D.O., count
colony during the fermentation time. Likewise the partial purification of the bacteriocin was made that gave the
crude extracts inhibition zone formation undergoing centrifugation at 4000 rpm for 20 minutes in refrigerated at
4 ° C ± 1, ammonium Sulphate solution 65%, inhibitory activity was performed on grass drop method (sensitivity
discs) with bacteriocin in Petri dishes with nutrient agar diffusion method and pathogenic bacteria, the plates
were read at presenting diameter (halos) inhibition. The physicochemical evaluation served to confirm the
XIV CONGRESO NACIONAL DE ESTUDIANTES
DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

2. 2
inhibitory action of the bacteriocin and other metabolites produced. The conclusion of the research shows the
3rd treatment (sterilized substrate, 25 ° C fermentation) and best treatment (P <0.05), to inhibit the growth of
Staphylococcus aureus and Bacillus cereus Salmonella sp.
Keywords: Bacteriocins, BAL, in vitro, crude extracts inhibitory capacity.
Introducción
La contaminación alimentaria causada por
microorganismos patógenos conlleva al deterioro de
los alimentos. Siendo microorganismos patógenos
como Bacillus cereus Staphylococcus aureus y
Salmonella sp., frecuentes patógenos causantes de
estas alteraciones. Por otro lado la tendencia de
consumir alimentos naturales, orgánicos o
mínimamente procesados e inocuos, hace la
necesidad de buscar nuevas alternativas de
conservación.
La biopreservación es un método de conservación
que ofrece diversas condiciones para extender la vida
útil y aumentar la seguridad de los alimentos, por
medio del uso de las Bacterias Acido Lácticas (BAL)
y sus productos antibacteriales. Las bacteriocinas
(sustancias antimicrobianas), están siendo
ampliamente utilizadas como sustituto potencial de
conservantes químicos, ya que son producidas por
bacterias consideradas benéficas para la salud
pública. Estos compuestos purificados o
semipurificados pueden ser utilizados como
biopreservantes para la reducción o eliminación de
ciertos microorganismos patógenos como por
ejemplo: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Salmonella sp.
Con la denominación de “bacterias ácido lácticas”
(BAL) se generaliza a un grupo de bacterias que
fermentan azúcares como glucosa y lactosa para
producir ácido láctico. Dentro de este grupo se
reconoce la existencia de microorganismos aerobios,
anaerobios y anaerobios facultativos. Los géneros
representativos de las BAL se denominan:
Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus,
Bifidobacterium y Pediococcus. Con excepción de
Bifidobacterium, todos son aeróbicos (Torres, 1999).
Se han realizado diferentes estudios que demuestran
la efectividad de las bacteriocinas provenientes de
BAL contra cepas patógenas antes mencionadas.
Por ejemplo, plantaricina C producida por
Lactobacillus plantarum aislada de productos lácteos,
presenta actividad contra especies de Enterococcus,
Streptococcus, Staphylococcus carnosus, Bacillus
sp., Clostridium sp., pero no es activa contra Listeria
innocua (Delgado, et al., 2005).
Por otro lado en la región de Apurímac la actividad
económica de elaboración y comercio artesanal de la
chicha de jora (bebida fermentada a partir del maíz
germinado) ha ido disminuyendo a este mismo hecho
se suma que la chicha de jora al ser elaborada
artesanalmente no cuenta con parámetros de
fermentación estandarizados, bebida por su alto
contenido de carbohidratos continúa en proceso de
fermentación, degenerándose su valor sensorial a
limites no aceptables para su consumo derivándose
a veces para uso en gastronomía o en su mayoría a
ser desechado, circunstancias que hace que esta
bebida oriunda se esté olvidando con el pasar el
tiempo.
En tal sentido la importancia de la investigación es
brindar una alternativa de uso a la chicha de jora
como sustrato de crecimiento de Lactobacillus
Plantarum 32plp para la producción de bacteriocina.
Y sugiere que esta cepa o su bacteriocina pueden ser
utilizados como sustancias inhibitorias de amplio
espectro en la preservación de alimentos.
El presente trabajo de investigación tiene como
objetivo producir y purificar parcialmente la
bacteriocina producida por Lactobacillus plantarum
32plp, utilizando como sustrato chicha de jora y
evaluación de su capacidad inhibitoria in vitro sobre
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella
sp.
Chicha de jora
Se denomina chicha de jora, según Vásquez (1927),
a la bebida alcohólica obtenida por fermentación, de
la materia azucarada contenida en el maíz malteado.
Por otro lado para Simunovic (1999), define a la
chicha de jora como la bebida “suigeneris”, que no ha
completado su fermentación, muy dulce.
Consecuentemente a esta bebida Ulloa y Herrera
(1976), menciona que esta bebida se llama tesgüino,
o tejuino, es una bebida alcohólica semejante a la

3. 2
cerveza, por ser preparada de granos germinados de
un cereal, son de maíz y no de cebada.
Bacteriocinas
Las bacteriocinas se definen como proteínas o
complejos de naturaleza proteica con acción
bactericida en microorganismos filogenéticamente
muy próximos a la bacteria productora (Tagg et al.,
1976).
Este grupo heterogéneo de sustancias, generados
tanto por microorganismos Gram-positivos como
Gram-negativos, varía mucho en propiedades
bioquímicas, espectro antimicrobiano y mecanismo
de acción.
Mecanismo de Acción de las Bacteriocinas
El modo de acción de las bacteriocinas se centraliza
en la membrana plasmática; donde la unión inicial a
la membrana bacteriana por atracción electrostática
entre lípidos cargados negativamente y las
bacteriocinas con su carga neta positiva se produciría
la inserción de los monómeros de bacteriocina en la
bicapa lipídica de la cepa sensible. Permeabilizando
la membrana de las células sensibles, provocando la
inmediata e inespecífica liberación de iones,
compuestos de bajo peso molecular y algo más tarde
del ATP intracelular. Estas alteraciones provocan la
disipación completa o parcial de la fuerza protón
motriz (PMF) ocasionando desórdenes metabólicos
secundarios que, en último término, inhiben la
generación de energía y la síntesis de
macromoléculas, lo que supone la muerte celular
(Soomroet al., 2002; Barefoot y Nettles, 1993;
Castellano et al., 2003).
Figura 01: Mecanismo de acción de las Bacteriocinas por la formación
de poros en la membrana bacteriana. (Ruiz et al., 2006).
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y cultivos
Se utilizó cuatro microorganismos: Lactobacillus
plantarum 32plp (laboratorio de Biotecnología de
Universidad Nacional de San Cristóbal de
Huamanga, Facultad de ciencias Biológicas),
Salmonella sp. (Facultad de Ciencias Biológicas, San
Antonio Abad del Cusco) y cepas de Bacillus cereus
y Staphylococcus aureus fueron aislados a partir de
arroz cocido y suero de queso, evaluándose
características morfológicas y pruebas presuntivas
de confirmación de las cepas aisladas.
Activación y conservación de las cepas
La cepa Lactobacillus plantarum 32plp se conservó
en tubos inclinados de agar Lactobacilli a 4±1°C.,
para activarlas, fue suspendido en caldo Lactobacilli
e incubada a 30°C±1, por 48 horas sin agitación, en
anaerobiosis y repicado en agar Lactobacilli,
incubado a 30°C±1 (primera siembra), para luego
realizar la preparación del inoculo con la única
finalidad de obtener un cultivo en fase exponencial
para ser adicionada a la chicha de jora que será
sustrato para realizar la fermentación propiamente
dicha.
Para Salmonella sp., fue conservada en tubos
inclinados de agar Mc Conkey a 4±1°C, y activadas
en caldo nutritivo e incubada a 30°C±1, por 24 horas
para su posterior uso. En cuanto a las cepas de
Bacillus cereus y Staphylococcus aureus fueron
aislados de alimentos fermentados y conservadas en
tubos inclinados de agar TSA (Tripticasa Soya) a
4±1°C, y activadas en caldo nutritivo e incubada a
30°C±1, por 24 horas para su posterior uso.
Sustrato empleado
Se empleó chicha de jora fermentada
artesanalmente, previo a la utilización como sustrato
para la fermentación láctica se sometió a dos tipos de
tratamiento térmico: pasteurización (temperatura de
ebullición por 30 minutos) y esterilización (en
autoclave a 121°C por 15 minutos). Con la finalidad
de adecuar al medio de fermentación de las bacterias
lácticas.
Métodos analíticos
Durante el tiempo de fermentación, se evaluaron
variables de crecimiento de biomasa mediante
conteo en placa de células viables, producción de
ácido láctico mediante la determinación de acidez
titulable con NaOH al 0.1N, utilizando como indicador
fenolftaleína, medición de pH con un potenciómetro,
sólidos solubles en refractómetro ABBE (escala 0 a
32°Brix) y medición de la turbidez por Densidad
Óptica (D.O.) en un espectrofotómetro Marca
GENESIS 20.

4. 3
Para la evaluación de la capacidad inhibitoria se
utilizó el método de gota sobre césped con discos de
sensibilidad (papel Watman N° 40 de 6 mm de
diámetro esterilizados) mediante la técnica de
inmersión durante 30 min., a 10°C, colocados con
una pinza esterilizada a placas de Petri (4 discos por
placa) con agar nutritivo previamente diseminadas
con asa de Drigalski las bacterias patógenas en
estudio (Lama, 2002), para verificar la acción
inhibitoria de la bacteriocina como extracto y
parcialmente purificado, cabe mencionar que las
cepas patógenas fueron difuminadas cuando se
encontraban en crecimiento exponencial para ello se
empleó caldo nutritivo para el crecimiento de los
patógenos (metodología adaptada de Lord, 2002)
Técnicas de purificación parcial.
Para la purificación parcial de las bacteriocinas
producidas se empleó el método de separación de las
células por precipitación con Sulfato de amonio y
centrifugación (Jimenez et al., 1993). Al
sobrenadante se le neutralizó el pH, para descartar
efectos de acidez y posteriormente se eliminaron las
células remanentes.
Diagrama de flujo para Producción de Bacteriocina
utilizando como sustrato chicha de jora
Figura 02: Diagrama de flujo para la obtención de Bacteriocinas chicha de jora,
Adaptado de: (Lama, 2002).
Evaluación fisicoquímica de la bacteriocina
Se realizó con la finalidad de descartar que la
actividad inhibitoria sea por otros metabolitos (ácidos
orgánicos, peróxidos de Hidrógeno, etanol) que
también puedan ejercer efecto inhibitorio. (Delgado,
2008)
- Sensibilidad a la catalasa. Se realizó a
sobrenadantes que presentaron actividad
antibacteriana, ajustados a pH 6.5 con NaOH 2.5
N, adicionándose una solución estéril de catalasa
(2 mg/m), dichas muestras se incubaron a 37°C
por espacio de 1 hora, para luego realizar el
ensayo de difusión en agar. Prueba realizada con
finalidad de descartar que la inhibición sea debido
a la acción de peróxido de hidrógeno.
- Estabilidad a diferentes pH. A sobrenadantes se
ajustaron a pH de 4 (solución ácida), 6.5 y 9
(solución básica NaOH 2.5N dichas muestras se
incubaron a 37°C por espacio de 1 hora, para
luego realizar el ensayo de difusión en agar.
- Tolerancia al etanol. Se evaluó el crecimiento de
Lactobacillus Plantarum 32plp a concentraciones:
4, 8,10% de etanol para luego realizar el ensayo
de difusión en agar. Prueba realizada con la
finalidad de descartar que la inhibición sea debido
a la acción del etanol.
Medida de las zonas de inhibición
Para la lectura de los halos de inhibición no se tomó
en cuenta sólo su presencia o su ausencia, en todos
los casos se tomó el diámetro de los halos, siendo
variable según la inhibición provocada por la
bacteriocina. Para ello se empleó una regla
milimétrica de tal manera se considera la diferencia
de todo el halo producido y el disco es decir 6 mm
(Shiva, 2007).
La activada inhibitoria se calcula por la medida del
valor de inhibición:
Valor de Inhibición = (I – DC)/2
Dónde: DC = Diámetro del Disco (mm)
I = Diámetro de Inhibición (mm)
Análisis estadístico
Para evaluar el efecto de los diferentes tratamientos
térmicos sobre la estabilidad de los compuestos
antimicrobianos se utilizó análisis de varianza de un
factor (ANOVA) para la comparación en significancia
entre los tratamientos en el paquete de Statgraphics
Plus Versión 8.0.
Los resultados de los halos de inhibición expresados
en valor de inhibición obtenidos de cada tratamiento
frente a Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y
Salmonella sp., se analizaron estadísticamente
mediante el análisis de varianza multifactorial con un
nivel de confianza de un 95%. Al registrarse
diferencia significativa se aplicó la prueba de
comparación múltiple de Tukey para determinar el
tratamiento más efectivo sobre cada cepa sensible.
Se utilizó el Software Statgraphics Plus Versión 8.0.
1. Resultados y discusión
Sobrenadante
Neutralizado
Chicha de jora
Sedimentación
Tratamiento térmico
Fermentación
Centrifugación
Almacenamiento
Sobrenadante
Agua
(1/10)
Tiempo: 1
h.
% de inoculo:1%
(cte.)
4000 rpmX20min
Sol. de fosfato
de Sodio al
0.05 M a pH 6.5
Sulfato de
amonio al 65%
Identificación morfológica
de levaduras
predominantes
Temperatura1: 25ºC
Temperatura 2: 35ºC
Temperatura: 4ºC
 Pasteurización
 Esterilización
Evaluación
Fisicoquímica
Poder de inhibición

5. 4
Cinética de crecimiento de Lactobacillus
plantarum 32plp en chicha de jora
Los ensayos se realizaron para cuatro tratamientos
como se muestra en la fig. 03(*), con la finalidad de
conocer la cinética de crecimiento de Lactobacillus
plantarum 32plp utilizando como medio chicha de jora
y evaluar las condiciones óptimas de producción de
bacteriocina.
Figura 03: Recuentos (UFC/ml) de Lactobacillus plantarum
32plp en el proceso de fermentación de chicha de jora.
(*) Leyenda: T1 = (Pasteurización, 25°C),
T2 = (Pasteurización, 35°C),
T3= (Esterilización, 25°C),
T4= (Esterilización, 35°C).
Resultados similares fueron obtenidos por Quillama,
(1998) quien comprobó que Lactobacillus plantarum
E2 aislado de Chicha de jora, bebida fermentada a
base de un cereal rico en almidón (maíz germinado),
presentaba una cinética de máxima producción del
compuesto antimicrobiano durante la fase logarítmica
tardía. Observándose en la presente investigación un
crecimiento en aumento de ciclos logarítmicos de 0.6
a 4.15 en fase exponencial y una prolongada fase
estacionaria.
Durante el tiempo de fermentación paralelamente se
evaluó la variación de % de Acidez expresado en
ácido láctico.
Figura 04: Comportamiento de la acidez titulable (expresado
como ácido láctico), a lo largo del periodo de fermentación
Como se muestra en el siguiente gráfico el % de
ácido láctico se ve influenciado por factores como
temperatura (25, 35°C), concentración de inóculo,
fuente de nutrientes asimilables para L. plantarum
32plp. Medidos en función del tiempo el %acidez
aumenta para los 4 tratamientos llegando a valores
máximos de 0.76 g. á. láctico/L, si se comparan estos
resultados con os obtenidos por Escobar et al, (2010),
ha reportado producción de ácido láctico por
Lactobacillus casei, con mayores valores de 0.97 g/L
a 75 horas de crecimiento. Está claro mencionar que
cada lactobacilo produce diferentes cantidades de
concentración de ácido láctico.
Valores de inhibición de extractos crudos de
bacteriocina producida por L. plantarum 32plp.
Por otro lado en el cuadro 1 y figura 05 se muestran
los valores de inhibición de la bacteriocina producida
por Lactobacillus plantarum 32plp durante su cinética
de crecimiento en chicha de jora, frente a tres cepas
patógenas (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y
Salmonella sp.
Cuadro 01: Resumen de los valores máximos de inhibición de
la bacteriocina (extracto crudo) producida por L. plantarum 32plp
en chicha de jora, frente a Staphylococcus aureus, Salmonella
sp. y Bacillus cereus.
IFE = Inicio de la Fase Exponencial, Fe = Fase estacionaria, TFe = Termino de
la Fase estacionaria, IFM = Inicio de la Fase de Muerte.
Zapata, et al. (2009), trabajo con Lactobacillus
plantarum LBPM10, en el cual menciona que
presenta actividad antimicrobiana con un máximo a
las 12 horas (final fase exponencial). El máximo de
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
0 12 24 36 48 60 72
LogUFC/ml
Tiempo de fermentacion (horas)
Crecimiento de Lactobacillus plantarum 32plp
en chicha de jora
1er
tratamiento
2do
tratamiento
3er
tratamiento
4to
tratamiento
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 12 24 36 48 60 72 84
%Acidez
Tiempo de fermentacion (horas)
Variación del % de Acidez (ácido láctico)
1er
tratamiento
2do
tratamiento
3er
tratamiento
Tratamientos Cepas sensibles
Staphylococcus
aureus
Bacillus
cereus
Salmonella
sp.
1er
tratamiento
2.50 mm (IFE) 2.00 mm
(Fe)
1.44 mm (Fe)
2do
tratamiento
1.63 mm (TFe) 1.69 mm
(TFe)
2.38 mm
(TFe)
3er
tratamiento
1.95 mm (Fe) 1.80 mm
(IFE)
1.30 mm
(TFe)
4to
tratamiento
0.70–1.11 mm
(IFE - IFM)
1.00 mm
(IFE)
0.60 mm
(IFE)

6. 5
actividad se mantuvo constante durante 12 horas y
comenzó a decrecer a las 27 horas demostrando que
la producción de bacteriocinas depende de la fase de
crecimiento y es estable en el medio de producción
durante largos periodos.
Resultados similares obtenidos por Nissen- Meyer et
al. (1993) y González et al. (1999), quienes reportan
que la actividad antimicrobiana de L. lactis y L.
plantarum comienza a decaer una vez comienza la
fase estacionaria. Sin embargo en la presente
investigación la cepa de Lactobacillus plantarum
32plp presenta un amplio rango de actividad
antimicrobiana durante su cinética de crecimiento,
desde el inicio de la fase exponencial, estacionaria y
el inicio de la fase de muerte o decadencia, como se
muestra los valores de inhibición frente a los tres
patógenos en estudio.
Figura 05: Valores de inhibición de la bacteriocina producida
por L. plantarum 32plp frente a Staphylococcus aureus.
A través de este estudio, se pudo comprobar que la
sustancia inhibitoria producida por Lactobacillus
plantarum32plp mostró un espectro de actividad a
especies Gram positivas y Gram negativas,
inhibiendo el crecimiento de bacterias patógenas
(Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y
Salmonella sp.). Estos resultados coinciden con
Zapata, et al. (2009), que menciona que el extracto
libre de células de Lactobacillus plantarum LPBM10
mostró un efecto antibacterial frente a bacterias Gram
positivas como Bacillus cereus, Bacillus pumilus,
Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes y
Staphylococcus aureus (ATCC 1395); y bacterias
Gram negativas como Salmonella sp.Tiphy (ATCC
6539), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsilellasp.
Y Serratia marcescens.
El efecto bactericida del extracto frente a las bacterias
Gram negativas es interesante ya que pocos
extractos de bacterias acido lácticas han mostrado
actividad antimicrobiana frente a este grupo de
bacterias. En L. plantarum se ha reportado actividad
frente a bacterias Gram negativas con la
plantaricina35d (Messi, et al., 2001).
Figura 06: Valores de inhibición de la bacteriocina producida
por L. plantarum 32plp frente a Salmonella sp.
En la industria de los alimentos, las bacterias Gram
negativas representan un gran problema económico
y de salud pública ya que presentan una resistencia
inherente a algunos compuestos antimicrobianos
utilizados. Esto hace que la sustancia inhibitoria
producida por L. plantarum 32plp, tenga una
prometedora aplicación al ser activa frente a
bacterias Gram negativas, a diferencia de la mayoría
de bacteriocinas reportadas hasta el momento.
Figura 07: Valores de inhibición de la bacteriocina producida
por L. plantarum 32plp frente a Bacillus cereus.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 12 24 36 48 60 72
Inhibición(mm)
Tiempo de Fermentación (horas)
Valores de Inhibición en S. aureus
1er
Tratamiento
2do
Tratamiento
3er
Tratamiento
4to
Tratamiento
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 12 24 36 48 60 72
Inhibición(mm)
Tiempo de Fermentación (horas)
Valores de Inhibición en Salmonella Sp.
1er
Tratamiento
2do
Tratamiento
3er
Tratamiento
4to
Tratamiento
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 12 24 36 48 60 72
Inhibición(mm)
Tiempo de Fermentación (horas)
Valores de Inhibición en Bacillus cereus
1er
Tratamiento
2do
Tratamiento
3er
Tratamiento
4to
Tratamiento

7. 6
Valores de inhibición de bacteriocina producida
por L. plantarum 32plp.parcialmente purificadas
Con el fin de establecer la incidencia del aumento de
los valores de inhibición y la claridad del espectro de
inhibición.
Stiles,(1996), menciona que el espectro de inhibición
de las bacteriocinas o sus extractos, puede verse
afectado según el tratamiento a que son sometidos,
como liofilización, concentración del sobrenadante,
purificación y neutralización entre otros.
Figura 08: Valor de inhibición de la bacteriocina parcialmente
purificada frente a Staphylococcus aureus
En el caso particular de los extractos de bacteriocina
producida por L. plantarum 32plp, purificada
parcialmente presentan halos de inhibición más
definidos y estables por periodos largos para los
cuatro tratamientos realizados y evaluados en las tres
cepas patógenas antes mencionadas.
Figura 09: Valor de inhibición de la bacteriocina parcialmente
purificada frente a Salmonella sp.
Figura 10: Valor de inhibición de la bacteriocina parcialmente
purificada frente a Bacillus cereus
Siendo el tercer tratamiento (Esterilización, con
fermentación a 25°C) quien presenta mejores
resultados en formación de halos de inhibición, para
lo cual se realizó la evaluación fisicoquímica, y en
comparación del 1er tratamiento (Pasteurización, con
fermentación a 25°C).
Zona de
inhibición
Foto 01: Halos de inhibición de L. plantarum 32plp
sobre Salmonella sp.
Zona de
Inhibición
Foto 02: Halos de inhibición de L. plantarum 32plp
sobre Staphylococcus aureus
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0 12 24 36 48 60 72
Inhibicion(mm)
Tiempo de fermentacion (horas)
Valor de inhibicion de la bacteriocina
parcialmente purificada frente a S. aureus
1er
tratamiento
2do
tratamiento
3er
tratamiento
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0 12 24 36 48 60 72
Inhibicion(mm)
Tiempo de fermentacion (horas)
Valor de inhibicion de la bacteriocina
parcialmente purificada frente a Salmonella sp.
1er
tratamiento
2do
tratamiento
3er
tratamiento
4to
tratamiento
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0 12 24 36 48 60 72
Inhibicion(mm)
Tiempo de fermentacion (horas)
Valor de inhibicion de la bacteriocina
parcialmente purificada frente a Bacillus cereus
1er
tratamiento
2do
tratamiento
3er
tratamiento
4to
tratamiento

8. 7
Zona de
Inhibición
Foto 03: Halos de inhibición de L. plantarum 32plp
sobre Bacillus cereus
Evaluación fisicoquímica de la bacteriocina
Se realizó la prueba de la sensibilidad a la catalasa,
para verificar la estabilidad de la bacteriocina a
diferentes pH, y para descartar que la inhibición sea
por peróxido de hidrogeno y etanol.
Figura 11: Sensibilidad a la catalasa (peróxido de hidrogeno) de
la bacteriocina producida por L. plantarum y evaluación de la
acción inhibitoria sobre Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Salmonella sp.,
Sedano, (2006), menciona que cuando el
sobrenadante libre de células conteniendo la
sustancia inhibitoria producida por Lactobacillus
plantarum M4 fue tratado con NaOH y catalasa, se
pudo también observar que la actividad
antimicrobiana se mantuvo estable, indicando que la
inhibición frente a la cepa sensible Lactobacillus
fermentum CHJ4C, no fue debida a la acción de ácido
orgánico ni peróxido de hidrógeno. La capacidad
inhibitoria del extracto crudo o sobrenadante de
bacteriocina producida en la chicha de jora no fue
inactiva en presencia de catalasa, excluyendo que la
inhibición fuera producida por la presencia de
peróxido de Hidrógeno.
Estabilidad a diferentes pH (acción del ácido
orgánico)
Frente a la estabilidad de la bacteriocina producida
por L. plantarum 32plp se muestran los resultados
que se probaron a pH de 4.0, 6.5, 9.0, con la finalidad
de determinar la acción sea debido al ácido orgánico.
Figura 12: Estabilidad de la bacteriocina a diferentes pH (4.0,
6.5, 9.0), evaluadas frente a Bacillus cereus, para el 3er
tratamiento, probados mediante los halos de inhibición.
De la figura se observa que el 3er tratamiento
muestra mejor estabilidad a pH 6.5 por tanto mayor
valor de inhibición frente a Bacillus cereus que
descarta la posibilidad de que la inhibición sea por
efecto de ácido láctico. También se ve que es estable
a pH9.0
Figura 13: Estabilidad de la bacteriocina en diferentes pH (4.0,
6.5, 9.0), evaluadas frente a Staphylococcus aureus, para el 3er
tratamiento, probados mediante los halos de inhibición.
De la figura tanto el 3er tratamiento, muestra mejores
resultados cuando se trabaja pH 6.5 y 9.0 que inhiben
el crecimiento de Staphylococcus aureus. Por otro
lado, Agarry et al., (2005) comprobaron que la
sustancia inhibitoria producida por la especie
Lactobacillus brevis aislada de yuca, fue ácido
orgánico, porque al ser neutralizado el sobrenadante
a pH 6,5 desapareció la zona de inhibición. Sin
embargo en la investigación realizada presentó
0
1
2
3
4
5
6
12h 36h 48h 60h 72h
Inhibición(mm)
Tiempo de fermentación (horas)
Sensibilidad a la catalasa (3er tratamiento
B. cereus
S.aureus
Salmonella
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 12 24 36 48 60 72
Inhibición(mm)
Tiempo de fermentación (horas)
Estabilidad del valor de inhibición de la
bacteriocina a diferentes pH frente a B. cereus
pH 4.0
pH6.5
pH9.0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 12 24 36 48 60 72
Inhibición(mm)
Tiempo de fermentación (horas)
Estabilidad del valor de inhibición de la
bacteriocina a diferentes pH frente a S. aureus
pH 4.0
pH6.5
pH9.0

9. 8
valores de inhibición lo cual descarta que la inhibición
fuese por la presencia de ácido láctico.
Figura 14: Estabilidad de la bacteriocina en diferentes pH (4.0,
6.5, 9.0), evaluadas frente a Salmonella sp., para el 3er
tratamiento, probados mediante los halos de inhibición.
Estas características representarían un interés
biotecnológico e industrial adicional dada su
condición de sustancia inhibitoria resistente a
variaciones considerables de pH.
Tolerancia al etanol
Como se muestra en la figura 15, la variabilidad
notable de tolerancia al etanol a diferentes
concentraciones evaluadas: 4%, 8% y 10%.
Figura 15: Cinética de crecimiento de Lactobacillus plantarum
32plp a diferentes concentraciones de etanol. (Densidad óptica
cte. = 560 nm)
En cuanto a la determinación del nivel de tolerancia
de la cepa Lactobacillus plantarum 32plp, mostró sus
máximas tasas de sin etanol a 30°C, el 100% de las
cepas tuvieron un crecimiento total, pero
conteniendo etanol a concentraciones de 4 v/v, el
53.9% de las cepas mostraron tener un buen nivel de
tolerancia, para 8% v/v solo el 15.4% mostro
crecimiento considerándose que la cepa productora
de bacteriocina llega una tolerancia no mayor a 8%,
puesto que a 10% no existió crecimiento (figura 15,
Cuadro 02).
Cuadro 02: Calculo de los máximas poblaciones relativas y
determinación del nivel de tolerancia de etanol para
Lactobacillus plantarum 32plp.
1: Densidad óptica del cultivo al inicio del ensayo
2: Máximo valor de D.O. alcanzado por la cepa a lo largo de su curva de
crecimiento (60horas).
3: Valor menor de D.O. que al iniciar (no hay crecimiento), por
consiguiente la cepa tolera hasta un 4% v/v de etanol.
Observaciones de Alegría et al., (2004) quienes
reportaron el mismo efecto con 7% de etanol (v/v) en
el caldo de cultivo. La mayoría de cepas no fueron
inhibidas por concentraciones de 4 % de etanol en el
medio de cultivo, lo que indica una tolerancia
significativa de las cepas de Lactobacillus plantarum
cuando este se encuentre en otro sustrato como la
chicha de jora, podrá tener un crecimiento tolerable
de hasta 4% de etanol que se pueda generar en dicho
sustrato.
Valor de inhibición de L. plantarum 32plp a
diferentes concentraciones de etanol frente a B.
cereus, S. aureus, Salmonella sp.
Figura 16: Formación de halos de inhibición de la bacteriocina
producida por Lactobacillus plantarum a 4% de etanol frente a
tres tipos de patógenos
La cepa de Lactobacillus plantarum 32plp con
capacidad inhibitoria y tolerantes al etanol entre 4 y
8% (v/v) producen pequeños valores de inhibición no
mayores a 1mm como se muestra en las fig. 16 y 17.
Por último, el incremento en concentración de etanol,
tiene un efecto negativo en el aumento de la cinética
de crecimiento de L. plantarum y en la producción de
bacteriocina, por ende en el valor de inhibición frente
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 12 24 36 48 60 72
Inhibición(mm)
Tiempo de fermentación (horas)
Estabilidad del valor de inhibición de la
bacteriocina a diferentes pH frente a
Salmonella sp.
pH 4.0
pH6.5
pH9.0
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 12 24 36 48 60 72
D.O.(560nm)
Tiempo de crecimiento (horas)
Tolerancia al etanol de Lactobacillus plantarum
32plp
0 % etanol
4 % etanol
8 % etanol
10 %
etanol
0
0.25
0.5
0.75
1
0 6 12 18 36 48 54 60
V.I.(mm)
Tiempo de crecimiento (horas)
Valor de Inhibición de L. plantarum 32plp a
4% de etanol
Valor de inhibicion
contra Bacillus cereus
Valor de inhibicion
contra Staphylococcus
aureus
Valor de inhibicion
contra Salmonella
Tratamiento
Máxima
D.O.
(560nm)
Máxima
Población
Relativa (%)
Caldo Lactobacilli sin etanol 0.0391
Caldo Lactobacilli sin etanol 0.4752 100
Caldo L .+ 4% v/v etanol 0.256 53.89
Caldo L .+ 8% v/v etanol 0.073 15.37
Caldo L .+ 10% v/v etanol 0.393 0

10. 9
a Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Salmonella sp.es bajo.
Figura 18: Formación de halos de inhibición de la bacteriocina
producida por Lactobacillus plantarum a 8% de etanol frente a
tres tipos de patógenos.
Esto hace constatar que la concentración de etanol
no influye en la formación de los halos de inhibición o
el poder inhibitorio sea a causa de etanol.
2. Conclusiones
La chicha de jora empleado como sustrato para el
crecimiento de Lactobacillus plantarum 32plp en
tiempos fermentación de 48 horas y 60 horas,
produce bacteriocina con mayor acción inhibitoria in
vitro formando zonas de inhibición (extracto crudo) en
valores de inhibición promedio máximos de 2.25 ±
0,29 mm para inhibir Bacillus cereus, 2.00 ± 0,41mm
frente Staphylococcus aureus y 2.69 ± 0,38mm para
inhibir el crecimiento de Salmonella sp., el cual
muestra que el factor tipo de tratamiento térmico del
sustrato no influye significativamente en el valor de
inhibición (P< 0.05).
Los extractos de bacteriocina purificada parcialmente
presentan halos con valores de inhibición más
definidos en el cual la interacción de factores de tipo
de tratamiento térmico y temperatura de fermentación
muestran diferencias significativas (P< 0.05),
obteniéndose al 3er tratamiento (sustrato
esterilizado, 25ºC de fermentación) como mejor
tratamiento, para inhibir el crecimiento de Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus y Salmonella sp.
La evaluación fisicoquímica de la bacteriocina
producida permitió descartar que la acción inhibitoria
sea por otros metabolitos (ácido láctico, etanol,
Peróxido de Hidrógeno) producidos durante el
proceso de fermentación.
La variación de pH en la estabilidad de la bacteriocina
favorecieron significativamente (P< 0.05) en el
incremento del valor de inhibición, frente Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus y Salmonella sp.,
considerándose sustancias inhibitorias de amplio
espectro en la preservación de alimentos.
Agradecimientos
A los docentes de la Escuela Académico Profesional
de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad
Nacional Micaela Bastidas de Apurímac, por su
valiosa contribución en el desarrollo de la
investigación. A Mg. Paula García Godos Jefe de
laboratorio de Biotecnología de la Universidad
Nacional de San Cristóbal de Huamanga, Al
laboratorio de la Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco.
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Ed. Gráfica Nueva. México.
0
0.25
0.5
0.75
1
0 6 12 18 36 48 54 60
0 0 0
0.5 0.5 0.5
0 0
V.I.(mm)
Tiempo de crecimiento (horas)
Valor de Inhibición de L. plantarum 32plp a
8% de etanol
Valor de inhibicion
contra Bacillus cereus
Valor de inhibicion
contra Staphylococcus
aureus
Valor de inhibicion
contra Salmonella
________________
* Autor para correspondencia. Tel.: (083) 983908539/ (084)
984463839; E-mail: norma988_7@hotmail.com.

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